elisa测抗原实验报告

elisa测抗原实验报告（共2篇）

篇1：elisa测抗原实验报告

一.实验目的

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。

二.实验原理

用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β-D-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶(HRP)是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是(已知HRP的A(1cm 403nm 1%)=25，式中1%指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ(Reinheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三条：

(1)抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性;

(2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;

(3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的`循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：

1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。

2、研究抗酶抗体的合成。

3、显现微量的免疫沉淀反应。

4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

基本方法二 用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。 ↓

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) ↓

于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 ↓

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

(二) 酶与底物

酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。

免疫技术常用的酶及其底物

* 终止剂为2mol/L H2SO4

** 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。

可催化下列反应： HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体; A—— 为有色产物。

(三) ELISA常用的四种方法

1.直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面;

加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物; 加底物。底物的降解量=抗原量。

2.间接法测定抗体

将抗原吸附于固相载体表面; 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; 加酶标抗体;

加底物。 测定底物的降解量=抗体量。

3.双抗体夹心法测定抗原

将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗体复合物;

加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); 加底物。底物的降解量=抗原量。

4. 竞争法测定抗原

将抗体吸附在固相载体表面;

(1) 加入酶标抗原;

(2),(3)加入酶标抗原和待测抗原;

加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。

篇2：elisa测抗原实验报告

1检验目的及原理

1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验

用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen以及Schuurs进行描述的。在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。HBsAg在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。

本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。方法性能参数

2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：

样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。(2)特异性：

使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。

标本

3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

3.3采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

3.4严重脂血、严重溶血原则上不会影响检测结果，但洗涤一定要彻底、干净。检测系统

4.1 组成

乙型肝炎病毒表面抗原两步夹心ELISA试验试剂盒(英科新创科技有限公司)主要组成成份：包被HBsAb的预包被微孔板、HRP标记抗体、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、HBsAg样品稀释液（含BSA缓冲液）、浓缩PBS-T缓冲液、底物A（含H2O2）、底物B（含TMB）、终止液（含2 M H2SO4）、封板膜，自封袋。

试剂信息：以上构成仅对英科新创（厦门）科技有限公司的试剂盒有效，批准文号（国药准字S10910148），试剂储存于2-8℃避光保存，有效期六个月。4.2 试剂配制

（1）PBS-T缓冲液：取浓缩PBS-T缓冲液若干，以蒸馏水或去离子水按照20倍稀释成应用液。

试剂保存：室温。4.3主要仪器

Tecan Sunrise酶标仪、汇松PW-960酶标洗板机、20～200 ul可调式微量移液器、25～56℃可调式气浴恒温振荡器。校准

可调式微量移液器由武汉市技监局校准完成，酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责每年一次技术校准。检验程序

6.1 操作步骤

6.1.1、平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18～25℃），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

6.1.2、编号：取所需要数量微孔固定于支架，按序编号。6.1.3、稀释：每孔加入20 ul样品稀释液。

6.1.4、加样：分别在相应孔中加入100 ul待测样本血清、阴阳性对照血清或质控血清。6.1.5、温育：置37℃温育60分钟。

6.1.6、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。

6.1.7、加酶：在每一微孔中加入酶标记抗体50 ul。6.1.8、温育：置37℃温育30分钟。

6.1.9、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。

6.1.10、显色：每孔加底物A、底物B各50 ul，轻轻振荡混匀，37℃暗置30分钟。

6.1.11、终止：每孔加入终止液50 ul，混匀。

6.1.12、测定：用酶标仪双波长法450nm/630nm测定每一微孔OD值，记录结果。6.2 结果判断

6.2.1、临界值Cut off（CO）的计算：CO = 阴性对照OD均值×2.1 阴性对照OD均值低于0.05时，以0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。

6.2.2、样品OD值S / CO ≥ 1者，结果阳性

样品OD值S / CO ＜ 1者，结果阴性

6.2.3、如果阴性对照OD均值 >0.1或阳性对照OD均值< 0.4时，则表明不正常的操作或试剂盒已经变质损坏不能使用，需要重新试验，若问题仍然存在，应该立即停止使用该批号产品，并与试剂厂商联系。

6.2.4、注意：

A.通过以上检测阴性的样品，由于方法学以及其他不可控因素影响，不能绝对保证样本中没有低滴度抗原的存在，不能完全排除HBV感染的可能。

B.过以上检测阳性的样品，应通过人Anti-HBs的中和试验予以确认。如果样品在确证试验中发生中和，则该样品可以视为HBsAg呈阳性，无需进一步检测。质量控制

7.1 室内质量控制

室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1 ng/ml、2 ng/ml，均购自卫生部临床检验中心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录S/CO值。

7.2室间质量控制：每年参加卫生部、湖北省以及武汉市临床检验中心乙型肝炎病毒表面抗原的质量评价。

7.3尽可能排除干扰因素对试验的影响。干扰因素及变异的潜在来源

以下类型的冻融过的样品可能会引起本实验结果的假阳性：含高滴度免疫球蛋白（IgG 骨髓瘤，IgM骨髓瘤，怀孕前3个月的妇女，流感疫苗受体），大肠杆菌抗体，抗-CMV阳性，抗-EBV阳性，抗-HSV阳性，风疹抗体阳性，霉菌感染，抗核抗体阳性，梅毒阳性，类风湿因子及弓形虫抗体阳性。结果计算及测量不准确度

无结果计算及测量不确定度 生物参考区间

无 患者检验结果可报告区间

阴阳性 警告/危急值

阳性为警告 安全性预警措施

13.1所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，潜藏有传染成分。目前尚没有已知的方法，能够确保人源制品或灭活微生物无传染性。因此，所有取自人源材料必须视为潜在的污染物质。

13.2强烈建议严格按照有关血液滋生病原体的标准对检测系统所使用试剂和人源标本进行处理。对于含有或怀疑含有污染物的制剂材料适用生物安全2级或其他相应的生物安全措施。这些预防措施应包括但不局限于以下内容：

A.处理样本或试剂时，佩戴手套。B.不要用嘴吸液。

C.不要在处理这些材料的区域内吸烟，吃东西，饮水，使用化妆品或戴取隐形眼镜。D.使用杀菌消毒剂，如0.5％次氯酸钠、84或其他相应的消毒剂，对样本或试剂的所有溢出物进行清洁和消毒。

E.按照当地政府规定，对所有样本，试剂和其他潜在传染材料进行去污和处理。13.3安全预防措施：终止液含有较低浓度H2SO4,对皮肤、眼睛有损伤。如果溶液不慎接触眼睛，立即用清水冲洗。如果刺激依然存在，则请求医护人员帮助。临床意义

乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科。完整的病毒称为Dane颗粒，直径42 nm，球形，其外层包膜即HBsAg，由病毒S基因编码，是病毒衣壳蛋白，包括S、前S1和前S2蛋白；HBsAg是病毒感染的主要标志。除Dane颗粒外，感染者血液中还存在16 – 25 nm的球状和杆状体，是病毒组装过剩的HBsAg。