[摘要]在中药材实际生产与贸易交流中，中药材准确、快速鉴别一直是比较困难的工作。分子鉴别被认为是传统鉴别技术的有益补充，但目前分子鉴别方法仅止于实验室阶段，难以实现在产地、药市、药房等进行现场鉴别，极大的限制了其使用的范围和推广程度。其中，中药材DNA快速提取技术和DNA标记的快速检测技术是实现分子鉴别现场运用的两大瓶颈和关键问题。今天小编为大家精心挑选了关于《金银花类中药种类分析论文(精选3篇)》仅供参考，希望能够帮助到大家。
金银花类中药种类分析论文 篇1：
金银花配方颗粒的位点特异性PCR鉴别研究
[摘要] 中药配方颗粒已失去所有形态学辨识特征，传统鉴定方法无法有效鉴定其真伪。该文使用位点特异性PCR鉴别技术，根据金银花trnL-trnF的一个SNP位点设计特异性鉴别引物，对金银花基原植物及配方颗粒进行鉴定。经过优化DNA 提取方法后，药材与配方颗粒均成功提取到DNA，金银花基原植物及配方颗粒均可扩增获得约110 bp的条带，混伪品无条带。且BLAST结果比对证明PCR产物序列为金银花trnL-trnF序列。該文研究结果表明，DNA分子鉴定方法可弥补性状、显微鉴别局限性，对中药配方颗粒真实性进行快速准确的鉴定，为其生产、流通、用药安全提供科学依据和保障。
[关键词] 金银花；配方颗粒；位点特异性PCR；分子鉴定
[Key words] Lonicerae Japonicae Flos；formula granule；allele-specific PCR；molecular authentication
中藥配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，在中医临床配方后，供患者冲服使用的粉状或颗粒状产品。配方颗粒具有携带方便、服用简单、易于调制、适合工业化生产的特点，同时实现了中药同批内产品物质基础的均质性要求，解决了中药长期以来质量不均的问题[1]。自2001年7月，国家食品药品监督管理总局制定了《中药配方颗粒管理暂行规定》规定配方颗粒纳入中药饮片管理范畴以来，中药配方颗粒快速发展，经过10余年的试点，中药配方颗粒已超过600多品种，并广泛应用于600多家医院中[2]。
然而，由于中药配方颗粒已完全失去了传统中药饮片的鉴别特征，其鉴别与监管已成为制约配方颗粒产业的瓶颈问题之一。由于生产、控制工艺的不同，中药配方颗粒一直处于“试点”阶段，尚缺乏统一可控的质量标准，在生产、流通、使用环节上技术监管难度较大[3]，导致中药配方颗粒存在出现以伪充真、以次充好现象的风险，影响配方颗粒的临床功效。
作为质量控制的上游环节，配方颗粒的基原鉴定直接决定了其质量与疗效。由于配方颗粒系经提取加工形成的颗粒状制剂，已失去所有形态学辨识特征，无法通过性状和显微检测的方式进行鉴别；而在理化鉴别方面目前配方颗粒一般只通过薄层色谱和高效液相色谱进行鉴别，但使用个别指标成分进行定性分析对于近似种、尤其是同属近缘物种的鉴定具有很大困难；且对一些配方颗粒品种，因尚无专属性指标性成分而难以建立化学鉴定方法。因此，目前急需建立准确性高、稳定性好的方法用于配方颗粒原料物种的鉴定。
DNA分子鉴定是指通过比较药材、饮片的DNA差异来鉴别药材、饮片的方法。分子鉴定具有稳定、准确、特异性好、不受生物发展阶段与储藏加工影响等特点，受到了国内外研究者广泛关注，已建立多种中药材及中药饮片的分子鉴定方法[4-11]，甚至也有对中成药乃至其汤剂进行分子鉴定的报道[12-16]。其中蕲蛇、乌梢蛇饮片分子鉴别方法已经作为国家标准率先收录于2010年版《中国药典》中[17]。2016年8月国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》也明确提出“对于来源复杂的原料药材，必要时采用DNA分子鉴别技术进行物种真伪鉴别”。
选择合适的分子标记，建立特异性DNA分子鉴定手段，可解决配方颗粒物种基原鉴别的难题，有助于建立统一可控的配方颗粒质量标准，规范其生产、流通、用药过程的监管，为产品追溯及仲裁提供依据。金银花配方颗粒（Jinyinhua formula granule）由金银花药材水提后加工而成，是临床最为常用的配方颗粒之一。本研究以金银花配方颗粒为例，运用位点特异性PCR技术对金银花的基原植物及配方颗粒进行鉴定，分析DNA分子鑒定技术对配方颗粒基原鉴定的适用性，以期为中药配方颗粒质量控制与标准制定研究提供依据，为配方颗粒生产、流通、用药安全提供保障。
1 材料
1.1 植物材料
依托第四次全国中药资源普查标本库，收集金银花配方颗粒正品基原植物忍冬Lonicera japonica Thunb.及其同属混伪品短柄忍冬、红腺忍冬、华南忍冬、黄褐毛忍冬、灰毡毛忍冬、金银忍冬、盘叶忍冬、华南忍冬、西南忍冬、细毡毛忍冬、新疆忍冬原植物材料，使用硅胶干燥，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。
1.2 配方顆粒
从华润三九医药股份有限公司、北京中医药大学附属东直门医院、中国中医科学院附属西苑医院购买金银花配方颗粒样品，共计17批，见表2。
1.3 仪器
VeritiTM96孔梯度PCR仪（Applied Biosystems公司）；5810R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司）。
1.4 试剂
SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶和DL2000 DNA Marker均购自Takara公司。
2 方法
2.1 DNA提取
2.1.1 植物DNA提取 使用改良CTAB法[19]提取金银花及其混伪品基原植物DNA，使用200 μL dd H2O溶解，-20 ℃保存。
2.1.2 配方颗粒DNA提取 使用改进的硅胶吸附柱法进行提取，取20 mg配方颗粒置于2.0 mL微量离心管中，加入1 000 μL提取缓冲液，充分漩涡混匀至配方颗粒全部溶解，56 ℃水浴15 min；取出，冷却至室温，5 000×g离心5 min；取750 μL上清，加入至G2硅胶吸附柱，12 000×g离心1 min；弃穿透液，加入700 μL漂洗缓冲液，12 000×g离心1 min；取出离心柱转移至一新的2.0 mL微量离心管中，使用50 μL洗脱液洗脱。
2.2 鉴别引物设计
基于金银花基原植物忍冬及其同属混伪品间SNP鉴别位点（trnL-trnF序列625G/A）[18-20]，设计金银花配方颗粒特异性鉴别引物Jinyinhua-1.F/R和Jinyinhua-2.F/R。使用Primer Premier 5.0 设计引物，参数为：引物长18～25 nt，GC为40%～60%，Tm位于50～60 ℃，扩增产物大小为100～200 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表3。
2.3 金银花真伪鉴别方法的建立
取金银花及其混伪品DNA，使用设计的鉴别引物进行扩增，用于确定位点特异性PCR反应条件。25 μL PCR反应体系包含2× MightyAmp Buffer Ver.2预混液 12.5 μL，MightyAmp DNA Polymerase （1.25 U·μL-1） 0.6 μL、10 μmol·L-1上游及下游引物各0.25 μL，20% 聚乙烯吡咯烷酮-40（PVP-40）溶液1 μL，10 g·L-1牛血清蛋白（BSA）溶液0.5 μL[21]，DNA 模板1 μL（约10 ng）。PCR反应在VeritiTM型96孔梯度PCR扩增仪上进行。初始反应程序见表3。取PCR反应产物，加入5 μL 6× Loading buffer （Takara 公司） 混匀后于溴化乙锭（EB）染色的2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。根据文献[19]方法对PCR反应条件进行考察，确定可鉴别金银花及其混伪品的位点特异性PCR退火温度、循环数和DNA浓度范围。
2.4 金银花配方颗粒真伪方法的建立
根据2.3项的结果，筛选出特异性鉴别引物Jinyinhua-1.F/Jinyinhua-1.R，取金银花基原植物、混伪品及配方颗粒DNA，考察①退火温度：57，59，61，63，65 ℃；②PCR循环数：35，40，45，50个循环；③Taq种类：SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶、MightyAmp DNA Polymerase；④不同Taq酶量：0.25，0.75，1.25 U对PCR鉴别结果稳定性的影响。筛选出最适鉴别条件，对金银花配方颗粒进行位点特异性PCR鉴别。
2.5 序列测定及分析
金银花配方颗粒特异性PCR扩增阳性产物，使用Sanger法进行测序，由北京睿博兴科科技有限公司完成。对获得的序列，使用BLASTn程序在NCBI核酸数据库中进行比对，以判断鉴别结果的准确性。
2.6 检出限
调整金银花、混伪品及配方颗粒的总DNA至50 mg·L-1，并进行逐级稀释依次获得浓度分别为50，10，2，0.4 mg·L-1的DNA。以所稀释的DNA为模板进行位点特异性PCR，以扩出条带的最低浓度确定检测限。
3 结果与分析
3.1 金银花位点特异性PCR鉴别结果
凝胶电泳结果表明，所有样品仅金银花特异性鉴别引物Jinyinhua-1.F/R在退火温度>53 ℃扩出条带，当退火温度为59，61，63 ℃时仅金银花出现特异性鉴别条带，混伪品无条带。大于30个循环时，金银花样品均出现明显条带，30～45循环时，金银花出现特异性鉴别条带。DNA浓度在0.5～100 mg·L-1时均可获得扩增。因此，本文最终确定的金银花特异性PCR的反应参数为95 ℃预变性5 min 后，（95 ℃ 20 s，63 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s）共40个循环，并使用该条件对金银花及其同属混伪品进行扩增，结果金银花均出现条带，混伪品无条带，见图1。
3.2 金银花配方颗粒的位点特异性PCR鉴别
根据3.1项获得的金银花位点特异性PCR鉴别体系，对金银花配方颗粒PCR鉴别反应参数进行筛选和优化，见表3。使用优化后的PCR反应条件对不同来源金银花配方颗粒或基原植物进行扩增，均可获得约100 bp的特异性条带，配方颗粒扩增条带亮度较基原植物条带弱；配方颗粒特异性PCR产物测序峰图与基原植物峰图一致，且与金银花trnL-trnF序列完全相同，见图2。
BLAST结果表明，配方颗粒特异性扩增产物序列与GenBank数据库中相似性最高的是金银花trnL-trnF（KU298636.1），一致性为98%，仅有1个T/A变异，经核对引物序列表明，该SNP位点位于引物倒数第二位，是为了增加特异性而人为引入的错配。
3.3 检出限
使用优化后的PCR反应条件，对不同浓度的金银花配方颗粒DNA模板进行位点特异性PCR扩增。DNA模板浓度在50～10 mg·L-1时，金银花配方颗粒均能扩增出约110 bp的特异性鉴别条带；降低至2 mg·L-1后，部分厂商配方颗粒无法扩增，见图3。
4 讨论与展望
中药配方颗粒是一种经水煮沸提取1 h以上并加入輔料制成的颗粒状饮片，已完全失去了原药材的性状与显微鉴别特征，难以用传统鉴定方法对其真实性进行有效鉴定，无法满足《中药配方颗粒质量控制与标准定技术要求（征求意见稿）》提出的“对栽培、养殖或野生采集的药用动植物，应准确鉴定其种，不同种的中药材不可相互混用”的要求。本研究运用位点特异性PCR技术，对金银花配方颗粒及其基原植物进行鉴别。经过优化DNA 提取方法后，药材与配方颗粒均成功提取到DNA，采用凝胶电泳或测序比对均能成功鉴定到物种。动植物DNA经长时间煮沸提取后会发生严重降解，DNA降解程度类似古DNA样品，难以存留超过200 bp的DNA片段[22-23]。本研究使用了3對不同扩增长度的鉴别引物进行PCR反应，仅Jinyinhua-1.F/R引物在金银花配方颗粒中获得扩增产物，长度约100 bp，其结果与崔占虎等在水提液中获得的片段长度类似[13]。
本研究结果证明，即使在长时间煮沸提取的中药配方颗粒中，也有短片段DNA存留，可以使用特异性PCR的方式对其物种基原进行鉴定。由于不同中药品种具有不同性质，其配方颗粒加热提取时间、加水用量、辅料用量、干燥方法均有不同，应根据配方颗粒的性质和制备工艺，考察并选择合适的DNA提取方法，寻找高稳定性DNA片段，遵循中药分子鉴定使用原则[24]，使用短片段扩增与鉴定的方式建立配方颗粒DNA分子鉴别方法，并测试方法对原料药的适用性，从而建立覆盖原料、中间体、成品的配方颗粒真实性鉴别及溯源体系。由于配方颗粒DNA片段短，辅料干扰性大，基于SNP或短序列扩增的特异性鉴别技术，如位点特异性PCR、快速PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温核酸扩增技术及高分辨率熔解曲线鉴别技术等在中药配方颗粒产业的原料收购、加工及市场流通、产品追溯与仲裁等方面将起到更好的控制和监管的作用，发挥更大的经济效益和社会效益。
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[责任编辑 孔晶晶]
作者：蒋超 屠李婵 袁媛 黄璐琦 高伟 金艳
金银花类中药种类分析论文 篇2：
中药材分子鉴别现场运用的策略与实践
[摘要] 在中药材实际生产与贸易交流中，中药材准确、快速鉴别一直是比较困难的工作。分子鉴别被认为是传统鉴别技术的有益补充，但目前分子鉴别方法仅止于实验室阶段，难以实现在产地、药市、药房等进行现场鉴别，极大的限制了其使用的范围和推广程度。其中，中药材DNA快速提取技术和DNA标记的快速检测技术是实现分子鉴别现场运用的两大瓶颈和关键问题。该研究开发了一套中药材分子鉴别现场运用模块系统，包括药材DNA快速提取模块、DNA标记检测模块和保障模块，并配备了相应的自主开发试剂盒、仪器装备。运用这套系统对金银花进行现场鉴别，可在40～60 min完成，且仪器装置简单、易于操作，为传统中药现场鉴别手段的有益补充。
[关键词] 现场鉴别；分子鉴定；药材
[收稿日期] 2012-12-03
[基金项目] 北京市科技专项“道地中药材功能基因组研究北京市重点实验室2012年阶梯计划项目”
[通信作者] *黄璐琦，E-mail：huangluqi@263.net 中药材基原真伪鉴别是中药学研究领域中的重要研究方向和首要问题，中药材是否“正本清源”直接影响到用药安全。由于中药材基原具有多样性、复杂性的特点，易受到物种延续性、变异性、地域性和复杂性等因素的影响。因此，对中药材基原鉴别可以从源头上控制中药的质量，对保障中药生产和中药产业的健康发展起到举足轻重的作用[1]。利用分子生物学技术依据遗传物质DNA在不同生物个体的差异鉴别生物物种，可为中药材品种鉴别提供依据[2]。近20年间，以PCR技术为基础的中药分子鉴别技术因其不受外界环境的影响、具有较好的客观性，逐渐被业内认可。其中乌梢蛇、蕲蛇分子鉴别方法被《中国药典》（2010年版）收载。笔者认为，对中药鉴定技术的需求不仅仅局限于实验室应用，未来将更主要应用于广泛的实际生产与贸易交流环节。随着分子鉴别技术的发展，构建中药材分子鉴别现场运用模块系统有望实现在产地、药市、药房等进行药材现场分子鉴别，将对中药鉴定学科和中药产业的可持续发展将起到推动作用。
1 中药材分子鉴别现场运用的意义和需求
1.1 分子鉴别现场运用是常规检测手段的延伸
对中药材真伪品的检测通常采用眼看、手摸、嘴尝、鼻闻等方法，正确辨别药材真伪品需要较高的专业技能和长时间经验积累。目前能够熟练掌握这一技能的人才缺乏，且面对种类繁多的中药材，鉴定人员存在主观判断力差异，也影响鉴定的结果。分子鉴别现场运用可以在短时间内实现对药材真伪品的检测，且不受药材外观形态、个体大小和完整性的影响，有利于提高中药材质量监管的科学性和管理效力。
1.2 高通量检测是分子鉴别现场运用的重要优势
在药材抽检的过程中，按照中药材或中药饮片抽验工作程序，样品数量巨大。发展高通量检测技术是缩短检测时间、减少工作量、节约检测成本的重要途径。
1.3 仪器设备简单、成本低廉将有利于分子鉴别现场运用的推广
近年来，许多学者利用分子生物学技术对中药鉴定方法进行了广泛的研究，并取得了丰富的成果。如杨俊宝等[3]筛选获得2个RAPD引物，可以用于鉴别半夏和掌叶半夏。蒋超等[4]利用EST-SSR技术对金银花、山银花进行了鉴别方法的研究。DNA条形码技术也被认为是中药鉴别的重要方法之一[5]。荆志伟等[6]用基因芯片技术对中药石斛的不同种属进行了鉴别研究，将16个不同种属石斛的ITS序列固定在玻片上制作了基因芯片，用于其中5种石斛的鉴定。然而这些方法目前仅止于实验室阶段，由于其操作繁琐、检测需要大型仪器、耗时长、成本高，难以实现在产地、药市、药房等进行现场鉴别，极大的限制了分子鉴别技术的使用范围和推广程度。
在日常监督工作中对于廉价药材的检测或者对技术较复杂、操作过程繁琐的检测指标进行大批量样品筛检时，往往面临时间和经费的双重困难。利用分子鉴别现场运用系统有望有效解决这一难题。
1.4 在有毒中药、珍稀濒危药材、贵重药材鉴别方面具有广阔的发展潜力
分子鉴别现场运用系统，对药材需求量少，仅需0.1 g药材就可以进行鉴别反应。因此，对于一些价格昂贵或珍稀濒危的药材，该系统具有更广阔的发展潜力。
1.5 中药材快速检测工作模式的探讨
将快速检测车及现场快速检测仪器作为主要工作平台，依托快检实验室开展工作。形成涵盖现场快速检测的药材分子快速检测模式。现场采集的样本可以通过快速检测仪器获得结果，如需实验室检测或需进一步确证，则将样品送回快检实验室获得检测结果。
2 中药材分子鉴别现场运用存在的困难及解决方案
2.1 中药材DNA快速提取
CTAB法、SDS法等[7]是中药材DNA提取的常用方法，在这些方法中常使用65 ℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性，从而使DNA被释放出来，水浴时间一般为30 min至2 h，这很难满足中药材分子鉴别现场运用的需求。本课题组开发了一种基于碱裂解法的中药材DNA快速提取方法，并申请发明专利，在此基础上研制了中药材DNA快速提取试剂盒。试剂盒中主要包括溶液A和B。简要操作过程：将药材粉末加入溶液A后震荡1 min，再加入溶液B震荡1 min，静置后取上清待用。笔者利用这种方法对市售的180余种药材包括果实类、种子类、花类、全草类、皮类、根类药材及炮制品进行了DNA提取，并选择叶绿体psbA-trnH序列通用引物进行PCR反应及琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明85%药材DNA获得了PCR扩增条带，其中花类、果实种子类及动物类药材DNA获得了100%的PCR成功率，但炮制过的药材PCR成功率明显降低。
2.2 药材真伪鉴别DNA标记的开发及其快速检测
获取药材正品及其市场常见混淆品的核酸信息，并利用生物信息学分析软件对相关序列进行分析，筛选药材真伪鉴别DNA标记，收集不同产地、不同批次的药材正品及其混淆品样品，对真伪鉴别DNA标记进行验证。RAPD，RFLP，ISSR，DNA条形码等DNA标记已被用于中药材的真伪鉴别[8]，但这些鉴别DNA标记检测的方法大多以PCR技术为基础，荧光定量法[9]、测序法、限制性内切酶酶切法[10]、质谱法[11]、基因芯片[6]等方法也被用于鉴别标记的检测。但这些方法大多操作复杂、价格昂贵、检测时间长，而且需要大型的仪器设备，因此并不适合于现场鉴别。
单核苷酸多态性SNP（single nucleotide polymorphisms）作为新一代的分子标记，具有数量多、覆盖密度大、遗传稳定性强、多态性丰富的优势，且由于SNPs一般只有2个等位基因，在检测时只需要通过一个简单的“+/-”方式即可进行基因分型，使得其检测易于实现自动化[12]。基于SNP标记，在病原微生物检测、疾病诊断等研究中陆续开发了一些可用于现场快速鉴别的技术，简化了对仪器和实验室条件的要求、缩短了检测时间，具有很好的发展前景。如等温扩增技术，包括Q复制酶反应（QBRA）、链置换扩增技术（SDA）、切口酶恒温扩增技术（NEMA）、转录依赖的扩增技术（TASTMA，3SR，NASBA）、解旋酶扩增技术（HAD）、滚环扩增技术（RCA）、环介导等温扩增技术（LAMP）、单引物等温扩增技术（SPIA）等[13-14]，为中药材现场鉴别中的鉴别DNA标记快速检测试剂盒开发提供了思路。
3 研究实例
3.1 中药材分子鉴别现场运用的整体方案
从实际出发，基于药材真伪鉴别DNA标记，设计了一套用于中药材分子现场鉴别的模块系统（图1），包括药材DNA快速提取模块、药材鉴别DNA标记检测模块和保障模块。
图1 中药材分子鉴别现场运用模块系统组成
Fig.1 A module system for the scene application of molecular identification in Chinese medicine materials
3.1.1 药材DNA快速提取模块 包括①手持式研磨仪。配置锂电池，适合野外使用。②中药材DNA快速提取试剂盒，包括溶液A和B，常温保存。
3.1.2 药材鉴别DNA标记检测模块 包括①微型金属加热槽。配置锂电池或车载电源，可用于（65±5） ℃ DNA扩增反应。②便携式紫外灯。配置锂电池，适合野外使用，用于荧光检测，配备小型暗箱。③鉴别DNA标记的快速检测试剂盒。
3.1.3 保障模块 包括①微量移液器。②微量离心管。③吸头、吸头盒。④锋利的剪刀。⑤低温保藏盒，用于储存DNA聚合酶，配置冰袋。
现场鉴别模块系统拥有完善和简单的操作流程，操作时间控制在40～60 min，仪器装置简单、成本低，操作人员无需掌握较好的专业知识，经过简单训练即可进行中药材快速鉴别。
3.2 金银花分子鉴别现场运用研究
3.2.1 金银花真伪鉴别DNA标记的开发 通过对GenBank收录的忍冬属植物叶绿体 trn L-trn F序列进行对比分析，获得金银花真伪鉴别SNP位点，并依据该SNP位点设计特异性引物，对84份金银花基原植物及其市售饮片、混淆品进行双向位点特异性PCR扩增，根据真伪品的特异性条带进行金银花药材鉴别，确定了金银花真伪鉴别SNP[15]。
3.2.2 鉴别DNA标记的快速检测技术 利用已获得的金银花真伪鉴别SNP，开发了一种改良LAMP技术，通过设计特异性引物，于65 ℃在DNA聚合酶的作用下进行扩增反应。反应产物加入适量的SYBR Green染料，在紫外灯下进行检测，正品样本即可检测产生荧光，混淆品样品则不产生荧光。在此基础上开发了金银花鉴别DNA标记快速检测试剂盒。包括溶液C.缓冲液（常温保存）；溶液D1-4.特异性引物（常温保存）；溶液E.DNA聚合酶（低温保存）；溶液F.SYBR Green染料（常温保存）；溶液G.正对照；溶液H.负对照。
3.2.3 金银花分子鉴别现场运用操作规程 ①用剪刀剪碎药材，取少量样品用手持式研磨仪磨成粉末。②取少量粉末放置于2 mL离心管中，使用中药材DNA快速提取试剂盒进行DNA提取。③使用鉴别DNA标记快速检测试剂盒进行药材的真伪检测。依次在0.2 mL离心管中加入溶液C，溶液D，2 μL DNA提取液，溶液E，放置于微型金属加热槽中，在65 ℃条件下进行DNA扩增反应。反应30 min后，冷却至室温。加入溶液F，混匀后在紫外灯下进行检测。实验设置正、负对照。④判定标准：产生荧光即为正品样本，不产生荧光则为混淆品样品。
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Strategy and practice on scene application of molecular identification in
Chinese medicine materials
YUAN Yuan， JIANG Chao， HUANG Lu-qi*
（National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
[Key words] scene identification； molecular identification； Chinese medicine materials
doi：10.4268/cjcmm20131601
[责任编辑 吕冬梅]
作者：袁媛 蒋超 黄璐琦
金银花类中药种类分析论文 篇3：
金银花研究新进展
摘要：系统查阅了近年来国内外有关金银花的文献资料，对金银花的生药学、化学成分、药理活性等方面的研究成果作了简要全面的综述，为今后金银花的深入研究和开发提供相关依据。
关键词： 金银花 生药学 化学成分 药理活性
Honey suckle to study new progress
Song Lei Shen Wei Yu Xin
金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq、山银花Lonicera confusa DC或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd的干燥花蕾或带初开的花。在我国资源丰富，分布广泛，主产山东、河南等省，多为家种，山东金银花产量大，俗称济银花、东银花；河南产品质佳，俗称密银花。金银花具有清热解毒、凉散风热之功效，主治痈肿疖疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等，为中医临床常用药。在预防非典的中药处方中，金银花出现频率最高［1］，引起了广大医药工作者的普遍关注。
1 生药学研究
忍冬属全世界约有200种，我国有98种，广布于全国各地，而以西南部种类最多，其中可供药用的品种达47种［2］。徐炳声等对我国18个省(市、自治区)的158个市县的202件商品“金银花”的样品进行研究，结合腊叶标本材料共鉴定了原植物14个种、1个亚种和2个变种，其中以忍冬（Lonicera japonica Thunb）分布最广，产量最高［3］。市场上作药用的金银花约有17种［4］。另据调查，广西药用金银花有9种，贵州有7个种作商品药材，四川（含重庆市）药用金银花共计有10个种及2个变种［5］。
2 化学成分研究
金银花的化学成分复杂，已鉴别出的就有60多种。目前已发现的化学成分主要为挥发油类、黄酮类、有机酸类、三萜皂苷类、无机元素等。
2.1 挥发油类。
挥发油是金银花的有效成分。通过气质联用分离出芳樟醇(linalool)、双花醇［6］、棕榈酸(palmitic acid)、二氢香苇醇(dihydrocarveol)、二十四碳酸甲酯(tetracosanoic acid methylester)［7］,十八碳二烯酸乙酯(9,12-octadecadienoate)［8］、棕榈酸乙酯(palmitic acid ethylester)、1，1’-联二环己烷(1，1’-bicyclohexyl)［9］等成分。金银花干花和鲜花的化学成分差异较大，鲜花挥发油成分中，以芳樟醇为主,含量高达14%,其他成分多为低沸点的不饱和萜烯类成分，而干花挥发油成分以棕榈酸为主，一般占26%以上，芳樟醇含量仅0.39%以下。可能由于芳樟醇是低沸点化合物，在干燥加工过程中损失造成［10］。
2.2 黄酮类化合物。
金银花中目前鉴定出的黄酮类化合物包括木犀草素(luteolin)、忍冬苷(lonicerin)、木犀草素-7-O-α-D-葡萄糖苷(luteolin-7-O-α-D-glucoside)、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷(luteolin-7-O-β-D-galatoside),槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(qucrcotin-3-O-β-D-glucoside)、金丝桃苷(hypcroside)［11］；corymbosin和5-羟基3,4,7三甲基黄酮(5-hydroxyl-3-,4’,7-trimethoxyflavone)［12］。
2.3 有机酸类化合物。
绿原酸类化合物是金银花的主要有效成分，包括绿原酸(chlorogcnic acid)、异绿原酸(isocholrogenic acid〕［13］和咖啡酸(caffeic acid),其他有机酸还有肉豆蔻酸（myristic acid)及棕榈酸(palmitic acid)［14］。前三者是金银花的主要活性成分。其中异绿原酸为一混合物［15］，其异构体有7种，分别为4,5-二咖啡酸酰奎尼酸,3,4-二咖啡酸酰奎尼酸,3，5-二咖啡酸酰奎尼酸、1，3-二咖啡酸酰奎尼酸,3-阿魏酰奎尼酸,4-阿魏酰奎尼酸和5-阿魏酰奎尼酸。咖啡酸(caffeic acid)是绿原酸的水解产物。
2.4 三萜皂苷类 。
金银花中三萜类化合物目前已鉴定出以下几种:3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖基-hederagenin-28-O-β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯(I)、3-0-α-L-吡喃阿拉伯糖基-hederagenin-28-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-［β-D-吡喃木糖基-(1→6）］-β-D-吡喃葡萄糖酯(Ⅱ)和3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-hederagenin-28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-［β-D-吡喃木糖基(1→6)］-β-D-吡喃葡萄糖酯(Ⅲ)［16］、灰毡毛忍冬皂苷甲(macranthoidin A)、灰毡毛忍冬皂苷乙(macranthoidin B)、川续断皂苷乙(disacoside B)［17］、木通皂苷［18］、新常春皂苷［19］。Kwak等［20］首次从金银花地上部分中分离出１个新的三萜皂苷－忍冬苦苷C。
2.5 无机元素。
金银花含无机元素共15种之多：铁、锰、铜、锌、钛、锶、钼、钡、镍、铬、铅、钒、钴、锂、钙等。
2.6 其他成分。
忍冬花蕾中所含其他成分，主要包括β-谷甾醇（β-sitosterol）、肌醇（inositol）、二十九烷醇等。
3 药理活性研究
3.1 抗菌、抗病毒作用。
金银花对多种致病菌均有一定的抑制作用［21］，包括金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌，对肺炎球菌、脑膜炎双球菌、绿脓杆菌、结核杆菌亦有效，水浸剂比煎剂作用强。金银花对致龋病的变形链球菌、放线粘杆菌和引起牙周病的产黑色素类杆菌、牙龈类杆菌及伴放线嗜血菌亦显示了较强的抗菌活性［22］。金银花于体外有一定的抗钩体作用［23］，对皮肤真菌有一定抑制作用。金银花水煎剂(1∶20)在人胚肾原代单层上皮细胞组织培养上，对流感病毒、孤儿病毒、疮疹病毒增多有抑制作用［24］。一般认为金银花中抗菌消炎的主要成分是绿原酸及异绿原酸［25］。
3.2 抗炎及解热作用。
对金银花解热、抗炎、免疫等试验研究结果表明，其水煮液、口服液和注射液对角叉胶，三联菌苗致热有不同程度的退热作用，对蛋清、交叉菜胶、二甲苯所致水肿有不同程度的抑制作用，还能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬巨红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，从而证明临床作为清热解毒治疗感染性疾病主要是通过调节机体兔疫功能而实现的。金银花抗炎作用的有效成分尚不清楚，但从黄褐毛忍冬花中提得的黄褐毛忍冬总皂苷Ful具有显著抗炎活性［26］。
3.3 利胆保肝作用。
金银花所含多种绿原酸类化合物具有显著的利胆作用，可增进大鼠胆汁分泌。黄褐毛忍冬总皂苷中α-春藤皂苷和无患子皂苷B有显著的保肝作用［27］。
3.4 降血脂作用。
金银花能显著降低多种模型小鼠血清胆固醇(Tc)及动脉粥样硬化指数(AI),提高高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)含量，保护胰腺β细胞及弱降糖作用［28］。
3.5 对免疫系统的作用。
金银花具有促进白细胞的吞噬功能，促进炎性细胞吞噬功能，降低豚鼠T细胞a一醋酸萘酯酶(ANAE)百分率，降低中性粒细胞(PMN)体外分泌功能，恢复巨噬细胞功能，调理淋巴细胞功能，显著增强IL-2的产生等作用［29］。另外，硝酸铈与金银花配合使用对烫伤小鼠细胞免疫的调理作用较单味药效果更好［30］。
3.6 止血作用。
金银花炭水煎液、混悬液具有显著的止血作用，且混悬液的作用强于水煎液。金银花炭中鞣质的含量仅为生品的1/2，但其止血作用却明显优于生品，从而提示揉质并非金银花炭止血作用的唯一物质基础［31］。
3.7 抗氧化作用。
金银花水提物在体外对H2O2具有直接的清除作用［32］，能使烫伤小鼠中性粒细胞合成和释放溶酶体酶的能力相应减少，说明其具有抗氧化反应的作用。
3.8 其它作用。
金银花中所含绿原酸可引起大鼠、小鼠中枢神经系统兴奋［33,34］。口服大剂量绿原酸能增加胃肠蠕动，促进胃液及胆汁分泌。此外绿原酸还能轻微增加肾上腺素及去甲肾上腺素对猫与大鼠的升压作用，但对猫的瞬膜反应无影响［34］。金银花叶对于治疗急性腹泻亦有很好的效果［35］。
综上所述，金银花中含有挥发油类、黄酮类、有机酸类、三萜皂苷等多种成分，药理试验证明有多种活性，特别是在抗菌、抗病毒方面，作用更为显著。该药用植物资源丰富，疗效确切，功能多样，除可作药用外，还广泛用于凉茶、保健食品等，具有极高的开发价值和可靠的开发前景。
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作者：宋磊 沈伟 于昕
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