精细化工领域工程技术论文提纲

论文题目：重组大肠杆菌全细胞合成光学纯L-苯基乳酸

摘要：L-苯基乳酸（L-phenyllactic acid,L-PLA）是一种具有重要生理功能和药理特性的小分子天然有机酸,是许多高附加值复合物的手性中间体,在医药和精细化工领域有着重要应用。L-PLA对食品腐败真菌和细菌具有广谱而高效的抑菌特性,有望作为新型天然生物防腐剂应用于食品和饲料行业,发展前景广阔。本研究为了获得高产和高光学纯度的L-PLA,通过基因工程技术构建过表达L-乳酸脱氢酶大肠杆菌以及偶联NADH辅因子再生体系的共表达型重组大肠杆菌,结合全细胞转化法不对称还原苯丙酮酸钠（PPA）合成L-PLA。主要研究成果如下:PCR扩增植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ATCC14917）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium Z2013513）L-乳酸脱氢酶基因Lpldh和Bmldh,构建重组菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-Lpldh、E.coli BL21（DE3）/pET28a-Bmldh。二者SDS-PAGE电泳凝胶约40 kDa处均有明显蛋白条带,粗酶液LpLDH和BmLDH对PPA比酶活分别为154.02 U/mg和3.40 U/mg。E.coli BL21（DE3）/p ET28a-Lpldh全细胞转化合成L-PLA产量明显高于E.coli BL21（DE3）/pET28a-Bmldh,通过150 min分批补料合成L-PLA 77.26mM,生产速率为30.90 mM/h,L-PLA光学纯度高达97%,表明过表达植物乳杆菌L-乳酸脱氢酶Lpldh重组大肠杆菌能立体特异性转化PPA合成高产光学纯L-PLA。PCR扩增植物乳杆菌Lpldh和巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因gdh,构建共表达型菌株E.coli BL21（DE3）/pETDuet-Lpldh-gdh。SDS-PAGE电泳凝胶约40 kDa处和27 kDa处均有明显蛋白条带,粗酶液中L-乳酸脱氢酶LpLDH比酶活为9.48 U/mg,葡萄糖脱氢酶GDH比酶活为5.37 U/mg。E.coli BL21（DE3）/pETDuet-Lpldh-gdh合成L-PLA产量高于E.coli BL21（DE3）/pETDuet-Lpldh 16.79%,PPA摩尔转化率高达70.08%,表明辅因子再生系统有效加强全细胞催化合成L-PLA。对共表达菌株全细胞转化条件优化后进行90 min分批补料转化实验,积累L-PLA至108.51 mM,生产速率高达72.34 mM/h,L-PLA光学纯度大于99%,说明此辅因子再生循环系统在提高L-PLA产量的同时,也有助于其光学纯度的提高。此共表达菌株实现高效高光学纯生产L-PLA,有望应用于工业化生产和发酵食品领域。

关键词：L-苯基乳酸;L-乳酸脱氢酶;全细胞转化;辅因子再生;葡萄糖脱氢

学科专业：食品科学

摘要

Abstract

1 前言

1.1 L-苯基乳酸概述

1.2 L-苯基乳酸的合成与检测

1.3 辅因子再生概述

1.4 研究内容及目的意义

1.5 论文创新点

2 材料与方法

2.1 试验材料与仪器设备

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 高产L-苯基乳酸重组大肠杆菌的构建

3.2 重组大肠杆菌辅因子再生系统的构建

3.3 共表达重组大肠杆菌全细胞转化L-苯基乳酸条件优化

4 讨论

4.1 L-乳酸脱氢酶重组大肠杆菌的构建及全细胞转化

4.2 辅因子再生偶联体系的构建及全细胞转化

4.3 共表达重组大肠杆菌全细胞转化条件优化及分批补料转化

5 结论

参考文献

致谢