木质素高效降解菌血红密孔菌产酶条件研究

木质素高效降解菌血红密孔菌产酶条件研究（通用2篇）

篇1：木质素高效降解菌血红密孔菌产酶条件研究

木质素高效降解菌血红密孔菌产酶条件研究

Abstract：[Objective]The purpose was to study the optimum conditions of Pycnoporus sanguineus for producing ligninase.[Method]A strain of lignindegrading white-rot fungus was selected from 5 strains of collected fungi and its liguinase production and the optimum conditions for producing ligninolytic enzyme were measured.[Result]It could produce two kinds of ligninase with good thermal stability.Different temperatures,carbon sources,nitrogen sources,acidities,as well as the additions of surfactant had distinct influence on the development of ligniu-degrading enzymes of the fungus.The optimum condition was drawn out:38 ℃,pH=4.5,10.0 g/L glucese,1.0 g/L tartaric acid ammonium.[Conclusion]The aim of research was to provide a basis for liguin degradation in practical production.作 者：王丹梅    任大明    李秀娜    石皎    WANG Dan-mei    REN Da-ming    LI Xiu-na    SHI Jiao  作者单位：沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳,110161 期 刊：农业科学与技术(英文版)  ISTIC  Journal：AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY 年，卷(期)：, 9(1) 分类号：X7 Keywords：White-rot fungus    Lignin degradation    Fermentation condition    Orthogonal test   

篇2：木质素高效降解菌血红密孔菌产酶条件研究

关键词：木质层孔菌,原生质体,制备,再生

如何开辟新的饲料来源,提高饲料利用率已是一个世界性的研究课题[1]。秸杆作为一种特殊形态的可再生资源,因其含有难以降解的木质素,长期以来一直没有得到合理的开发利用。目前国内关于秸杆的降解多集中在纤维素的降解方面,对于木质素的研究比较少,木质素的生物降解是真菌、细菌和相关微生物群落共同作用的结果,其中真菌起着主导作用,特别是白腐真菌。目前,对白腐真菌的研究主要集中在作用机理和酶学性质上,对菌种选育方面的报道较少,尤其是利用原生质体生物技术选育菌种的报道更少。本研究是选用经初步筛选对木质纤维素具有较强降解力的木质层孔菌5.132,拟采用诱变或原生质体融合进行菌种选育,以期获得木质纤维素酶高产菌株,但是不论采用何种方法木质层孔菌原生质体的高形成率及高再生率的都是进一步研究的前提。本文就木质层孔菌5.132原生质体形成和再生的最佳条件进行研究,为进一步利用木质层孔菌5.132奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

木质层孔菌5.132(Fomes lignosns(Brek) Ccoke):购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心,本实验室保存。

1.1.2 试剂

氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为国产分析纯,均购自天津市科密欧科技有限公司;蔗糖为国产分析纯,购自天津市广成化学试剂有限公司;甘露醇为国产分析纯,购自上海试剂三厂。

蜗牛酶(Snailase)生物试剂,购自北京百泰生化技术公司;纤维素酶(Cellulase)生物试剂,购自郑州创生生物技术有限公司进口分装产品。

1.1.3 仪器

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司; 802型离心机,江苏省金坛市大地自动化仪器厂;DZKW型电子恒温水浴锅,北京市中兴伟业仪器有限公司; HH·B11·500型电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;XK96-B型快速混匀器,姜堰市新康医疗器械有限公司。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 斜面保藏培养基:

固体综合PDA培养基。

1.1.4.2 液态菌丝生长培养基:

液体综合PDA培养基。

1.1.4.3 原生质体再生培养基:

分别采用0.8mol/L氯化钠、0.6mol/L氯化钾、0.6mol/L硫酸镁、0.6mol/L甘露醇和0.6mol/L蔗糖等渗透压稳定液作为溶剂配制综合PDA培养基。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬液的制备

取28℃培养6d的试管斜面菌种,加入一定量无菌水,轻轻把孢子刮下,倒入无菌的有玻璃珠的三角瓶中,振荡分散孢子,用4层无菌高级擦镜纸过滤,取滤液经倍比稀释,显微镜下计数使孢子终浓度为106-7个/mL。

1.2.2 菌丝培养[2,3,4]

取上述新鲜孢子悬液1mL接种于盛有50mL综合PDA液体培养基的三角瓶中,于28℃恒温培养。到规定时间后终止培养,取样、离心(3 500r/min,10min),收集菌体。

1.2.3 原生质体的制备[5]与纯化

将已培养好的菌丝置于离心管中,离心(3 500r/min,10min)将菌丝与培养基分离,弃上清,用0.8mol/L的NaCl溶液洗涤2次,于收集的菌丝体中加入0.01mol/L的β-巯基乙醇预处理30min,3 500r/min离心10min,弃上清,0.8mol/L的NaCl溶液洗涤3次,加入酶液,32℃轻微振荡酶解3h。酶解结束后,用4层无菌高级擦镜纸过滤,滤去未被酶解的菌丝残片,滤液离心(3 500r/min,10min),弃上清液,0.8mol/L的NaCl溶液洗涤2次,收集原生质体重悬于0.8mol/L的NaCl溶液中保存,用血球计数板计数。

1.2.4 原生质体再生[6]

将上述所得原生质体悬浮液用0.8mol/L NaCl溶液梯度稀释到适当浓度后取0.1mL分别接种于综合PDA平板和高渗综合PDA平板,用以下公式计算再生率:

再生率(%)=(高渗综合PDA上的菌落数-综合PDA上的菌落数)/显微镜计数原生质体数×100%

1.2.5 菌龄对原生质体制备和再生的影响[7,8]

分别在菌丝培养24h、36h、48h、60h、72h时取样,过滤收集菌体,加入2.0%纤维素酶+2.0%蜗牛酶混合酶液,30℃下酶解3h,0.8mol/L的NaCl溶液作为渗透压稳定剂,涂平板计数,结合血球计数板观察计数,计算原生质体形成数量和再生率,选择菌株5.132制备原生质体的最适菌龄。

1.2.6 酶解时间对原生质体制备和再生的影响[9,10]

取培养60h的菌丝过滤收集菌体,其他条件同菌龄对原生质体制备和再生的影响,酶解时间设置为2h、3h、4h、5h,进行原生质体形成数量和再生率的测定,选择最适酶解时间。

1.2.7 酶浓度对原生质体制备和再生的影响[11,12]

酶解时间3h,其他条件同酶解时间对原生质体制备和再生的影响,通过原生质体形成数量和再生率两个指标,考察纤维素酶、蜗牛酶不同浓度对其形成和再生的影响,酶浓度分别采取0.5%纤维素酶+0.5%蜗牛酶(第Ⅰ组)、1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶(第Ⅱ组)、1.5%纤维素酶+1.5%蜗牛酶(第Ⅲ组)、2.0%纤维素酶+2.0%蜗牛酶(第Ⅳ组)、2.5%纤维素酶+2.5%蜗牛酶(第Ⅴ组)。

1.2.8 酶解温度对原生质体制备和再生的影响[13,14]

选用2.0%纤维素酶+2.0%蜗牛酶的混合酶液,其他条件同酶浓度对原生质体制备和再生的影响,分别在28℃、30℃、32℃、35℃下酶解,进行原生质体形成数量和再生率的测定,选择最适的酶解温度。

1.2.9 渗透压稳定剂对原生质体制备和再生的影响[15,16]

选用培养60h的菌丝体和2.0%纤维素酶+2.0%蜗牛酶的混合酶液,在32℃下酶解3h,渗透压稳定剂分别采用0.8mol/L的氯化钠、0.6mol/L的氯化钾、0.6mol/L的硫酸镁、0.6mol/L的甘露醇、0.6mol/L的蔗糖,进行原生质体形成数量和再生率的测定,选择其形成及再生的最适渗透压稳定剂。

1.2.10 pH值对原生质体制备和再生的影响[17,18]

在上述优化的实验条件下,分别采用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的0.8mol/L的氯化钠磷酸缓冲溶液配制混合酶液酶解菌丝体,通过原生质体形成数量和再生率的测定,考察pH值对其形成及再生的影响。

1.2.11 优化条件验证实验

综合上述优化实验条件,选择菌龄60h,pH 5.0的2.0%纤维素酶+2.0%蜗牛酶混合酶液在32℃酶解菌丝体3h,0.8mol/L的NaCl溶液作为渗透压稳定剂,观察对菌株5.132原生质体的制备与再生的影响。

2 结果与分析

2.1 菌龄对原生质体制备和再生的影响

真菌原生质体获得的决定性因素是菌丝体的生理状况,而菌丝体的生理状况主要受菌龄影响[12]。菌龄不同,其细胞壁组分也发生一定变化,因此对于不同菌龄的菌丝分别酶解3h制备原生质体。随菌龄增加,获得的原生质体数量逐渐增加,到菌丝体培养60h时原生质体数量达到高峰,但随着培养时间继续延长,原生质体数量则显著下降。原生质体再生率在菌丝体培养48h时最高,在48h～72h呈下降趋势,综合考虑,确定原生质体制备的最适菌龄为60h(见图1)。

2.2 酶解时间对原生质体制备和再生的影响

由于细胞壁降解酶是将真菌细胞壁降解,从而使原生质体释放,酶解时间的长短对原生质体的活性影响很大。酶解时间短,可使原生质体保持较高的活性,酶解3h时再生率达6.15%,但是不能保证原生质体充分释放,此时,原生体产量只有2.75×105个/mL。酶解时间长,能够使原生质体充分释放,白腐真菌酶解4h可获得最大原生质体产量,但对原生质体质膜会造成一定的伤害,与酶解3h相比,原生质体再生率急聚下降。综合考虑原生质体形成数量和再生率,确定原生质体制备的最佳酶解时间为3h(见图2)。

2.3 酶浓度对原生质体制备和再生的影响

蜗牛酶是制备真菌原生质体最有效的水解酶,为大部分学者所采用,蜗牛酶有一定破壁效果,在蜗牛酶中复合加入纤维素酶能得到更理想的效果。不同菌体原生质体制备的最适酶浓度是不同的,本研究采用不同比例的两种混合酶液酶解制备原生质体,实验结果表明,酶浓度增大,原生质体形成数量增大。因为酶浓度增大,增加了酶分子与供试菌株细胞壁接触的机会,使酶解完全,有利于原生质体的形成。酶浓度为2.0%复合酶时原生质体数量与再生率均最高,但当酶浓度过大超过2.0%时,可能会导致原生质体的质膜受损伤,原生质球破裂,所以原生质体数量和再生率均下降。因此酶浓度为2.0%纤维素酶+2.0%蜗牛酶时最佳(见图3)。

2.4 酶解温度对原生质体制备和再生的影响

由图4可知,当酶解温度超过32℃,原生质体形成数量和再生率下降,可能因在32～35℃时酶的活性较强,细胞壁降解效果较好,但易造成原生质体质膜的损伤,导致生成的原生质体不稳定,容易破裂;而温度过低则会影响酶的活力,达不到最适温度,不能充分发挥酶的效率。因此,酶解的最适温度选择32℃。

2.5 pH值对原生质体制备和再生的影响

pH值影响酶的活性,从而影响其对细胞壁降解,在不同pH条件下原生质体制备和再生结果见图5。结果可见 pH值为5.0时,对菌株5.132原生质体制备和再生较适,原生质体数量达到3.52×105个/mL,再生率为6.61%,二者均达到最高水平。

2.6 渗透压稳定剂对原生质体制备和再生的影响

原生质体由于脱去了细胞壁,对外界环境变得非常敏感,特别是对渗透压。如果把它悬浮在蒸馏水中,则容易膨胀破裂,因而必须在一定浓度的高渗溶液中进行酶解、破壁,才能形成和保持稳定的原生质体。实验中选用5种常用的渗透压稳定剂,由图6可见,渗透压稳定剂的种类及其浓度的选择对菌丝体原生质体的形成非常重要,在酶解过程中以氯化钠为渗透压稳定剂的效果最好,在原生质体再生时也以氯化钠为渗透压稳定剂效果最好。因此,选择0.8mol/L的氯化钠作为原生质体的制备时的最佳渗透压稳定剂,原生质体数量达到3.12×105个/mL,其次是0.6mol/L硫酸镁,原生质体数为2.76×105个/mL。

3 讨论

3.1 渗透压稳定剂是原生质体制备和再生的重要参数。菌株不同,所需要的渗稳剂的种类、浓度不同,因此,需要进行条件选择。目前常用的渗稳剂有蔗糖、甘露醇、山梨醇等有机物和氯化钾、氯化钠、硫酸镁等无机物。本实验菌株选用0.8mol/L的氯化钠溶液作为渗透压稳定剂效果较好。

3.2 原生质体制备中是否能得到原生质体的高形成率及高再生率,破壁酶的种类及浓度是最关键的条件参数,本实验选用脱真菌细胞壁的有效酶制剂——蜗牛酶和纤维素酶来水解细胞壁,联合使用可提高原生质体数量,加快细胞水解进程,增强原生质体活性,酶浓度过高,细胞壁酶解快而且彻底,但是原生质体再生细胞壁比较困难,反之,过低酶浓度,细胞壁脱壁慢而且不完全,原生质体形成数量不高。并且本研究所选用的酶系统和酶的使用剂量,原生质体的形成率与再生率与刘玲[13]、李维[15]等人的研究相比并不理想,有待于进一步研究。

3.3 适当预处理可在一定程度上破坏真菌细胞壁外层大分子高级结构,改善通透能力,促进细胞壁水解酶向内壁层扩散,缩短酶作用时间,提高原生质体制备效率,本实验选用0.3%的β-巯基乙醇进行预处理,但原生质体的再生率提高并不明显,需进一步研究。