水产养殖中病害预防论文提纲

论文题目：中华鳖环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）的克隆、表征及表达分析

摘要：中华鳖是我国重要的淡水养殖品种,近二十年来发展迅速,养殖规模逐渐扩大。随着集约化养殖的发展,各类疾病频发,严重制约了中华鳖养殖业的健康发展。目前中华鳖疾病主要是采用化学药物防治,而养殖过程中化学药物的不规范使用将会导致较大的食品安全和环境安全问题。免疫防治是动物疾病环保、安全的防控手段,逐渐成为水产动物病害防治的研究热点,但目前关于中华鳖病害免疫防治的研究资料较少,限制了免疫防病技术在其养殖中的应用。开展中华鳖免疫相关基因的研究将有助于了解中华鳖免疫机制,运用免疫学相关知识和技术预防疾病,减少疾病暴发,保障中华鳖养殖业的健康可持续发展。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）具有DNA感受器的作用,可以识别来源于病毒、细菌及自身胞质异样DNA并促进环磷酸鸟苷-腺苷（cyclic GMP-AMP,cGAMP）的生成,进而激活干扰素刺激蛋白（stimulator of IFN genes,STING）、促进Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）和其它细胞因子的分泌,从而调控脊椎动物的免疫功能。1.利用RACE技术克隆出中华鳖cGAS基因,全长为1716bp,编码519个氨基酸,表达蛋白分子量为57.09kDa,等电点为9.73,无跨膜区域,为胞内蛋白。中华鳖cGAS蛋白存在Mab-21保守结构域,与爬行类cGAS亲缘关系最近,与鸟类亲缘关系最远。构建了中华鳖cGAS基因原核表达载体,表达重组蛋白55 kDa,免疫新西兰大白兔制备了多抗。Western-blot结果表明重组蛋白可与特异性抗体反应,具有良好的免疫效果。2.qRT-PCR结果显示,cGAS基因在中华鳖脾脏、肠道、肾脏、肌肉、肝脏、胃、皮肤、肺、血细胞和心脏等组织中均能表达,表达水平存在组织特异性,表达量从高到低依次是:脾脏、肠道、肾脏、肌肉、肝脏、胃、皮肤、肺、血细胞和心脏。在嗜水气单胞菌、Poly（I:C）和LPS三种外源物刺激下,cGAS表达量均呈现先上升后下降的趋势,但是在不同组织、不同刺激下cGAS表达水平存在差异。3.Western Blot检测发现,嗜水气单胞菌刺激后,cGAS蛋白在脾脏和肠道中显著增加,其中脾脏中cGAS蛋白在48 h表达水平达到最高值,肠道中6h达到最高值。Poly（I:C）刺激后,无论在脾脏还是肠道,cGAS蛋白的表达水平均在24 h达到最高。LPS刺激后,cGAS蛋白在肠道中12h表达水平最高。结果表明中华鳖cGAS蛋白对嗜水气单胞菌、Poly（I:C）和LPS均有较强的免疫反应。4.免疫荧光结果显示,嗜水气单胞菌刺激24h后,cGAS蛋白在中华鳖肠道的表达量明显上升。

关键词：中华鳖;cGAS;基因克隆;表达分析;免疫荧光;嗜水气单胞菌;Poly（I:C）;LPS

学科专业：养殖

致谢

摘要

Abstract

略缩词表

第一章 绪论

1.1 中华鳖研究概述

1.1.1 中华鳖生物学特性与分布

1.1.2 中华鳖的养殖现状

1.1.3 中华鳖的疾病与免疫研究

1.2 先天免疫

1.2.1 先天免疫系统

1.2.2 模式识别受体

1.3 cGAS基因的研究概况

1.3.1 cGAS基因的发现

1.3.2 cGAS基因的结构特点

1.3.3 cGAS-STING信号通路调控模式

1.4 cGAS基因的研究进展

1.5 本研究目的与意义

1.6 技术路线图

第二章 材料与方法

2.1 材料与仪器

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验主要试剂

2.1.3 实验所用溶液及配制

2.1.4 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 cGAS目的片段获得

2.2.2 cGAS基因全长克隆

2.2.3 cGAS基因序列和系统进化树分析

2.2.4 cGAS蛋白原核表达

2.2.5 cGAS基因的组织分布

2.2.6 外源刺激物对cGAS mRNA表达的影响

2.2.7 外源刺激物对cGAS蛋白表达的影响

2.2.8 石蜡切片免疫荧光

2.3 数据统计分析

第三章 结果与分析

3.1 cGAS基因序列信息分析

3.2 cGAS氨基酸序列结构与分析

3.3 cGAS蛋白三级结构预测

3.4 cGAS氨基酸多序列比对分析

3.5 cGAS基因系统进化分析

3.6 cGAS基因在不同组织中的分布

3.7 外源刺激下cGAS基因的表达变化

3.8 原核表达

3.9 外源刺激下cGAS蛋白表达量变化

3.10 cGAS的免疫荧光分析

第四章 讨论

第五章 小结

5.1 研究结果

5.2 研究创新点

5.3 不足与展望

参考文献