H5亚型禽流感

H5亚型禽流感（精选八篇）

H5亚型禽流感 篇1

1 材料与方法

1. 1 定点调查样品采集

选择西宁市市郊一活禽屠宰场( 谷田屠宰场) 、湟中县一规模养殖场( 绿源养殖场) 设为定点调查点,在两个场每月( 2015 年1—6 月份) 分别采集鸡口腔、泄殖腔棉拭子和鸡全血各45 份,鸡全血进行离心分离取血清,- 20 ℃保存备用。

1. 2 随机样品抽查采样

按照西宁市春季动物防疫要求对西宁市大堡子镇、彭家寨镇、总寨镇、二十里铺镇4 个乡镇的禽类散养户、规模养殖场和市区内的一处活禽交易市场进行随机采样,每个乡镇采集50 份禽类全血样品,活禽交易市场采集30 份鸡口腔、泄殖腔棉拭子和30 份禽全血,全血样品离心分离血清,于- 20 ℃保存。

1. 3 样品病原学检测

对所采集的口腔、泄殖腔棉拭子样品进行H5 亚型禽流感病毒、H7 亚型禽流感病毒、新城疫病毒核酸RT - PCR检测。

1. 3. 1 病毒RNA提取1) 待检测样品、阴性和阳性对照各取100 μL,置于1. 5 m L的离心管内,分别加入600 μL裂解液,充分颠倒混匀,室温静置3 ~5 min。

2) 将液体吸入吸附柱中,13 000 r / min离心30 s。

3) 弃去收集管中的液体,加入600 μL洗液,13 000 r / min离心30 s。此步骤进行2 次。

4) 弃去收集管中的液体,13 000 r / min空柱离心2 min。

5) 将吸附柱移入新的1. 5 m L离心管中,在柱中央加入30 μL洗脱液,13 000 r/min离心30 s,离心管中的液体即为模板RNA。

1.3.2 RT-PCR扩增待检测样品、阴性对照、阳性对照的每份总体积为20μL,其中16.8μL的RT-PCR反应液,1.2μL的酶混合液,2μL的模板RNA。进行PCR扩增,其中H5、H7的反应条件为:42℃45 min,95℃3 min;循环95℃30 s,50℃40 s,72℃40 s,共35次;再72℃延伸10 min。新城疫病毒的反应条件为:42℃45 min,94℃3 min;循环94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,共35次;再72℃延伸7 min。

1.3.3琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增完毕后利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,并在紫外凝胶成像仪下观察结果。

1. 4 样品免疫抗体检测

采用血凝和血凝抑制试验进行H5 亚型禽流感免疫抗体、H7 亚型禽流感抗体检测及新城疫免疫抗体检测。

2 结果

2. 1 定点监测样品检测结果

1 080 份定点监测样品中包括540 份口腔、泄殖腔棉拭子和540 份血清。棉拭子和血清是一一对应的( 即同一只鸡分别采集棉拭子和全血) ,其中540 份棉拭子样品的H5 亚型禽流感病毒、H7 亚型禽流感病毒、新城疫病毒的病原学监测全部为阴性;540 份血清样品的H5 亚型抗体检测合格534 份,H7亚型抗体全部为阴性,新城疫抗体检测合格532 份。

2. 2 随机样品检测结果

230 份禽类全血随机样品中,西宁市市郊辖区内的4 个乡镇兽医站各采集50 份,合计200 份( 其中185 份为鸡血,15 份为鹌鹑血) ,全部进行抗体检测,30 份为活禽交易市场的鸡棉拭子样品和30 份鸡全血样品,分别进行病原学和抗体检测。230 份血清样品的H5 亚型抗体检测合格224 份,H7 亚型全部为阴性,新城疫合格223 份; 30 份活禽交易市场的棉拭子样品的H5 亚型禽流感、H7 亚型禽流感、新城疫病原学监测全部为阴性。

3 讨论

通过定点检测及春季防疫要求中的随机抽样检测,2015 年上半年在西宁市未发现禽类有禽流感、鸡新城疫的病毒携带或感染,这与近年来采取的一系列行之有效的动物防疫措施是分不开的。

对于免疫抗体不合格血清样品及时进行了结果反馈,有针对性地进行了补免。其中市郊的随机抽样检测中抗体不合格样品大多为鹌鹑血清,分析原因主要是由于鹌鹑采用禽流感- 新城疫双价苗饮水免疫,而鸡类全部进行H5 亚型禽流感灭活苗,新城疫活疫苗进行肌肉注射。由于西宁市并未进行H7 亚型禽流感疫苗的注射,因此全部样品并未检出H7 的抗体,也说明西宁市禽类市场并未有H7 的自然感染。西宁市贯彻执行“预防为主”的动物防疫方针,根据国际、国内动物疫病流行趋势,及时调整动物免疫程序,对重大动物疫病高度重视,动物防疫由春、秋两次集中防疫,改为春、夏、冬三次集中防疫。同时充分发挥了兽医实验室的功能,不再仅仅是为了完成国家和青海省防疫工作而作,对所有样品及时检测、及时反馈、及时总结,为西宁市的动物防疫工作奠定了坚实而可靠的基础,确保西宁市重大动物疫病防控工作更有效、有序地进行。

参考文献

[1]谢芝勋,谢丽基,刘家波,等.禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯,2008,119(3):410-413.

[2]徐业芬,商鹏,王宏辉,等.西藏林芝某鸡场鸡新城疫抗体水平检测[J].中国兽医杂志,2012,48(4):49-50.

县防控H7N9亚型禽流感工作汇报 篇2

一、加强宣传工作。4月3日通过12316惠农短信平台向广大养殖户和工作在一线的畜牧兽医工作人员发送了一条短信，提醒大家注意自身防护，并要求乡镇畜牧兽医站在春防期间，加强对禽流感的防控工作，确保疫苗免疫到位。4月9日将印发防控H7N9亚型禽流感的宣传单，下发到各养殖场户，禽类经营、加工从业人员和畜牧兽医一线工作人员手中。

二、做好家禽登记普查。要求各乡镇要结合当前春防集中免疫工作，对各地的.规模养禽场进行普查，对养殖规模蛋禽存笼1000羽以上、肉鸡(鸭)年存笼羽以上、鹅存笼500羽以上的养殖场全部要进行登记造册和备案，摸清家禽养殖状况。该工作于4月10前完成。

三、强化疫情监测排查。4月8日，我县防重办工作人员全部下到各乡镇进行疫情监测排查，同时要求各乡镇要立即对辖区内的禽类规模养殖场进行一次全面的疫情排查和监测，并开展流行病学调查工作。发现出现发热、呼吸道症状等异常情况，严格执行疫情报告制度，并按规定处置。

四、做好消毒灭源工作。4月9日，将对县城南北市场进行一次全面彻底的集中消毒灭源工作。要求各养殖场户和屠宰加工点在近期内开展一次全面彻底的集中消毒灭源工作，全县集中消毒灭源工作确定在4月10日至13日。

五、加强检疫监督执法。从4月9日起，对外地调入家禽严格做好查证验物监管工作。各乡镇将在最近一次逢墟日组织一次集中检查，重点检查家禽养殖、屠宰、加工、流通等环节和活禽交易市场等场所的防疫条件，确保动物卫生监督各项措施落到实处。

H5亚型禽流感 篇3

1材料与方法

1.1家禽血清

共1223份禽血清,2015年采自东莞市15个规模家禽养殖场和东坑镇、虎门镇的散养家禽,其中鸡血清945份,鸭血清155份、鹅血清90份,鸽血清33份。以翅静脉采血,以3500r/min离心15min分离获得待检血清,-20℃保存备检。

1.2试剂

1.2.1 1%鸡红细胞悬液

采集实验室饲养的3只禽流感和新城疫非免疫的健康公鸡的血液与阿氏液等体积混合,用p H值7.2的0.01mol/L PBS液洗涤3次,每次以1000r/min离心10min,洗涤后用PBS液配成体积分数1%鸡红细胞悬,4℃保存备用。

1.2.2 H5亚型禽流感抗原(Re-6)和阳性血清 H5亚型禽流感抗原(Re-6)和阳性血清,购自哈尔滨维科生物科技有限公司,批号分别为2013004,2013001。

1.2.3主要耗材和仪器 96孔“V”型反应板,离心机,8道移液器,微量震荡器。

1.3方法

按照《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T18936-2003)规定的血凝与血凝抑制方法操作。以完全抑制4U抗原的血清最高稀释倍数作为HI的滴度。HI效价小于或等于3log2判阴性,HI效价等于4log2为可疑,进行重复试验,HI效价大于或等于5log2判阳性,判定为抗体合格。根据东莞市动物疫病监测方案规定,家禽免疫后21d进行免疫效果监测,HI试验免疫抗体大于或等于5log2的样品判为免疫抗体合格。

2结果

2.1不同时间家禽免疫抗体合格率比较

2015年共检测家禽血清1223份,H5亚型禽流感抗体阳性1071份,抗体阳性率为87.57%,其中第一季度抗体阳性率为90.00%,第二季度抗体阳性率为73.26%,第三季度抗体阳性率为94.20%,第四季度抗体阳性率为90.59%,详细结果见表1。

2.2不同养殖场所家禽免疫抗体合格率比较

在检测1223份家禽血清中,其中检测散养家禽血清254份,H5亚型禽流感抗体阳性179份,抗体阳性率为70.47%;检测规模养殖场家禽血清969份,H5亚型禽流感抗体阳性892份,抗体阳性率为92.05%,详细结果见表2。

2.3不同家禽种类免疫抗体合格率比较

在检测1223份家禽血清中,检测鸡血清945份,H5亚型禽流感抗体阳性858份,抗体阳性率为90.79%;检测鸭血清155份,H5亚型禽流感抗体阳性129份,抗体阳性率为83.23%;检测鹅血清90份,H5亚型禽流感抗体阳性65份,抗体阳性率为72.22%;检测鸽子血清33份,H5亚型禽流感抗体阳性19份,抗体阳性率为57.58%,详细结果见表3。

3讨论

3.1使用灭活疫苗是防控高致病性禽流感的最有效措施,东莞市的家禽养殖以小规模场和散养为主,家禽的存栏量比较少,多年来一直按照农业部的部署落实高致病性禽流感的强制免疫。从本次家禽H5亚型禽流感抗体血清学调查可以看出,我市的家禽H5亚型禽流感抗体水平较高,达到了87.57%,远高于农业部规定的免疫合格率大于等于70%的要求。近年来,随着我市加强动物防疫队伍建设,建立了市、镇、村动物防疫队伍,落实动物防疫责任制,严格执行“政府保密度,业务部门保质量”的政策,采用“动物防疫管理信息系统”动态监控养殖场的免疫情况,养殖场实行二次免疫制度,散养户实行春、秋、冬大防集中免疫,常年补免,做到村不漏户,户不漏针,构筑了高致病性禽流感的免疫屏障。

3.2从监测的场点来看,规模场的H5亚型禽流感的抗体阳性率明显高于散养户。规模养殖场严格实行二次免疫甚至三次免疫,家禽抗体处于较高的抗体水平。散养户由于分布广,防疫意识较差,通常只在集中免疫时免疫一次,抗体水平偏低,不足于抵抗野的侵袭,给动物疫病防控工作带来很大难度,疫情风险比较大,是防疫监测的重点对象。

3.3从不同时间的监测结果来看,以第三季度的抗体阳性率最高,依次为第四季度、第一季度、第二季度,第二季度最低只有73.26%。可能是第二季度,天气比较炎热,养殖户产生麻痹心理,以为气温高,不会发生疫情,放松了免疫措施的落实。

3.4从不同种类家禽监测结果来看,鸡的H5亚型禽流感抗体阳性率最高达到90.79%,依次为鸭、鹅、鸽子,抗体阳性率分别为83.23%、72.22%、57.58%,鸽子的抗体阳性率最低。陈华等对2009~2013年山东家禽H5亚型禽流感抗体监测结果也表明,鸡的抗体阳性率明显高于水禽。目前,我市使用的禽流感疫苗分为鸡的疫苗和水禽专用苗。免疫的效果不同可能与不同种类的家禽对禽流感的疫苗免疫应答不同。水禽养殖的规模化程度不高,放牧或半放牧的饲养方式,免疫难度大,免疫效果难以保证。根据调查鸽子进行灭活禽流感免疫后,会影响产蛋,种鸽场的养殖户不愿意免疫,可能是造成鸽子抗体水平比较低的原因。

参考文献

[1]Y.M.Saif,等.禽病学[M].第11版.北京:中国农业出版社,2005:147-166.

[2]朱闻斐,等.H7亚型禽流感病毒概述[J].病毒学报,2013,29(3):245-249.

[3]张秀美,等.关注禽流感病毒的变异及其公共卫生学意义[J].山东畜牧兽医,2008,29,(7):1-4.

H5亚型禽流感 篇4

1 材料与方法

1.1 样品

随机抽取延平区20个乡镇 (街道) 的23个规模场鸡血清样品603份;10个规模场鸭血清样品216份;75户散养户鸡血清样品476份;65户散养户鸭血清样品332份;共计血清样品1 627份。

1.2 试剂

哈尔滨维科生物技术开发公司生产的禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原 (批号:2012002、2013002) , 禽流感病毒H5亚型阳性血清 (批号:2013001) 。

1.3 检测

按国标GB/T 18936-2003《高致病性禽流感诊断技术》规定进行检测和判定。

2 结果与分析

2.1 不同饲养规模的禽流感H5亚型抗体合格情况

所得数据采用SPSS16.0统计软件进行卡方检验分析, 经卡方检验表明:不同饲养规模免疫抗体水平差异不显著 (P>0.01) , 散养户免疫抗体合格率较高为92.45%, 规模场只达到90.48% (见表1) 。

2.2 不同饲养规模的鸡禽流感H5亚型抗体合格情况

所得数据采用SPSS16.0统计软件进行卡方检验分析, 经卡方检验表明:不同饲养规模的鸡免疫抗体水平差异不显著 (P>0.01) , 散养户免疫抗体合格率较高为95.03%, 规模场是91.92% (见表2) 。

2.3 不同饲养规模的鸭禽流感H5亚型抗体合格情况

所得数据采用SPSS16.0统计软件进行卡方检验分析, 经卡方检验表明:不同季度饲养规模的鸭免疫抗体水平差异不显著 (P>0.01) , 散养户免疫抗体合格率较高为89.46%, 规模场为83.80% (见表3) 。

份、%

份、%

份、%

份、%

份、%

2.4 不同季度的禽流感H5亚型抗体合格情况

所得数据采用SPSS16.0统计软件进行卡方检验分析, 经卡方检验表明:不同季度免疫抗体水平差异不显著 (P>0.01) , 但春、秋两季免疫抗体合格率都达到国家要求 (见表4) 。

2.5 不同品种禽流感H5亚型抗体合格情况

所得数据采用SPSS16.0统计软件进行卡方检验分析, 经卡方检验表明:不同品种免疫抗体水平差异极显著 (P<0.01) , 鸡的免疫抗体合格率较高为93.61%, 鸭的免疫抗体合格率只有87.23% (见表5) 。

3 结论

3.1 免疫抗体合格率超过国家要求

无论规模场和散养户, 延平区禽流感H5亚型免疫抗体合格率都超过国家要求, 禽流感防控工作扎实有效, 说明延平区动物防疫体系建设取得相当成效, 为确保不发生区域疫情提供了有力保证。

3.2 鸡的免疫抗体合格率比鸭高

因为鸡场的整体管理水平比鸭场的要高, 免疫程序相对科学, 所以免疫抗体水平高, 免疫效果好;而鸭场管理粗犷, 卫生条件差, 免疫程序不科学, 所以免疫效果不理想。因此为了确保免疫质量, 要按国家免疫计划的要求, 在首次免疫后3~4周需加强免疫1次。

3.3 散养户免疫抗体合格率高于规模场

H5亚型禽流感 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与菌株 H5N1和H5N2亚型AIV灭活抗原、H7和H9亚型AIV灭活抗原、禽网状内皮增殖症病毒 (REV) , 均由中国动物卫生与流行病学中心提供;禽白血病病毒 (ALV) 、新城疫病毒 (NDV) F48E9、鸭瘟病毒 (DPV) F34、鸭肝炎病毒 (DHV) 强毒参考株, 均购自中国兽药监察所;传染性支气管炎 (IB) H52弱毒疫苗, 乾元浩生物股份有限公司生产;传染性喉气管炎 (ILV) 弱毒疫苗, Bio Laryngo 公司生产;大肠杆菌O46分离株, 由西南民族大学动物医学实验室保存。

1.1.2 主要仪器 7300型荧光定量PCR仪 (ABI公司, 美国) 、凝胶成像系统Gel Doc2000 (Bio-Rad公司, 美国) 、紫外分光光度计Cary50Probe (Varian公司, 美国) 、Hybaid PX2 PCR仪 (Thermo Electron 公司, 美国) 、高速冷冻离心 (Eppendorf公司, 德国) 。

1.1.3 主要试剂 TaKaRa Real-time PCR core kit、 RNAiso Reagent、 Taq DNA聚合酶、Gel Extraction Mini Kit, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司; RNA PCR Kit (M-MLV) , 购自博瑞克生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针的设计及合成

参考 GenBank 中登陆的H5亚型AIV的HA基因核苷酸序列, 利用 DNASTAR 生物软件进行同源性分析比较, 选出 H5亚 型 HA 基因高度保守且特异的核苷酸区域, 利用 Primer 5.0 和 Oligo 6.0 软件设计引物和探针 (探针长24 bp, 位于上、下游引物之间, 5′由JOY 标记, 3′由 TAMRA 标记) , 引物及探针均由宝生物工程 (大连) 有限公司合成。

1.2.2 阳性标准品的制备

按照RNAiso Reagent说明书从H5N1亚型AIV灭活抗原中提取总RNA, 并按照RNA PCR Kit试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA, 以cDNA为模板, PCR扩增HA基因片段。采用50 μL反应体系:10 mmol dNTPs 2 μL、250 mmol MgCl2 2 μL、10 μmol/L上下游引物 (HAP1, HAP2) 各1 μL、TaqDNA聚合酶 (5U/μL) 0.5 μL、5×PCR Buffer 10 μL、cDNA 5 μL, 用去离子水补至50 μL。反应条件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 20 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 35个循环;72 ℃ 5 min;4 ℃结束反应。2%琼脂糖凝胶电泳, PCR产物用胶回收试剂盒回收, 2%琼脂糖凝胶电泳检测, 纯化的PCR产物送宝生物工程 (大连) 有限公司进行测序。测序结果符合预期的PCR产物即为H5亚型AIV HA基因特异的阳性标准品。

1.2.3 AIV H5亚型TaqMan RRT-PCR检测方法的建立

反应条件的优化:采用TaKaRa Real-time PCR core kit 推荐的25 μL反应体系, 以出现最高的荧光值 (ΔRn) 、最小的Ct值为指标, 分别对退火温度 (52～62 ℃) 、Mg2+浓度 (1～20 mmol) 、 引物浓度 (0.2～1.0 μmol) 及探针浓度 (0.04～0.24 μmol) 进行优化。

标准曲线的建立:用紫外分光光度计测定阳性标准品260 nm处光吸收值 (A260) , 计算DNA拷贝数, 随后将标准阳性样本进行连续10倍系列稀释 (1×10-1～1×10-9) , 用荧光定量PCR仪进行检测, 建立标准曲线。

特异性检测:AIV H5N1、AIV H5N2、AIV H7、AIV H9、NDV、DHV、DPV、ALV、REV、IBV 总RNA提取及cDNA合成同1.2.2。用酚-氯仿法提取 DPV、ILTV和大肠杆菌O46的DNA, 分别用优化的RRT-PCR条件进行检测, 对阳性样本PCR产物进行测序。

可重复性及再现性评价:对同一阳性标准品设4个重复管, 用RRT-PCR进行检测, 评价其重复性;将该标准阳性样本置于-20 ℃冰箱中保存, 分别于第10, 20, 30天重检, 评价其再现性。

2 结果

2.1 引物的特异性检测结果

研究设计的针对H5亚型AIV HA 基因的特异性上、下游引物序列为5′-CGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGAC -3′和5′-TCCATAAGGATAGACCAGCTACCA -3′, 探针序列为5′- (JOY) TGCCAGTGCTAGGGAACTCGCCAC (TAMRA) -3′, 扩增片段长度为150 bp。经BLAST工具检索, 与GenBank 中登陆的82个H5 亚型的AIV 分离株HA基因序列同源性为100%, 与其他基因序列无同源性。从H5N1 亚型AIV 灭活抗原中扩增出与预期大小一致的片段, 见图1。PCR产物的测序结果证实扩增出的片段为H5亚型AIV HA基因的特异序列。

1～2.阳性RT-PCR产物;M.DNA 分子质量标准。

2.2 RRT-PCR的优化条件

优化出的25 μL最佳反应体系:5×PCR Buffer (Mg2+free) 5 μL, 上、下游引物 (10 μmol) 各1 μL, dNTP Mixture (10 mmol) 1 μL, Mg2+ (250 mmol) 0.80 μL, TaqMan 探针 (10 μmol) 0.80 μL, Taq DNA聚合酶 (5 U/μL) 0.25 μL, 模板2 μL, 用水补至25 μL。最佳反应条件为95 ℃2 min;95 ℃15 s, 60 ℃20 s, 72 ℃40 s, 40个循环。

2.3 标准曲线

RRT-PCR对H5亚型AIV HA基因的最低检测限为每个反应 21个拷贝, 在2.1×101～2.1×107个拷贝反应范围内有很好的线性关系, 相关系数为0.992, 扩增效率为107.2%, 见图2、图3。

2.4 特异性检测结果

TaqMan RRT-PCR能从H5N1和H5N2阳性样本中检出阳性扩增信号, 而对其他无关病原发生非特异扩增, 见图4。测序结果显示, TaqMan RRT-PCR阳性扩增产物与H5亚型AIV HA基因片段核苷酸序列同源性为100%, 对含有其他被检家禽病原的样本检测均为阴性。

1～6.AIV H5N1和H5N2亚型灭活抗原;7～16.分别为AIV H7、AIV H9、NDV F48E9、 DPV F34、DHV、ALV、 REV、 IBV、 ALTV和大肠杆菌;NTC.无模板对照。

2.5 重复性与再现性

RRT-PCR检测标准阳性样品的批内变异系数为2.01%, 批间变异系数为4.93%, 结果见表1。

3 讨论

RRT-PCR 是近年来出现的一种新技术, 已经广泛用于包括 AI 在内的多种家禽疾病诊断及病原研究。目前已有多篇检测AIV的荧光定量PCR方法的研究报告, 如卢亦愚等[4]建立了基于TaqMan 探针RRT-PCR 检测 H5 亚型 AIV 的方法, 最低可检测到100 拷贝;秦智锋等[5]研制了基于TaqMan-MGB 探针的多重RRT-PCR检测试剂盒, 可同时检测AIV 3个亚型 (H5、H7、H9) , 对H5亚型检测的灵敏度为1 000个拷贝。邹冬辉等[6]的研究表明, RRT-PCR 与病毒分离率呈正相关, 较鸡胚分离法更敏感。本方法完全可取代传统的病毒培养方法用于AIV的定量检测, 可大大缩短病毒检测时间, 同时也避免了病原扩散的危险。本研究建立的 TaqMan RRT-PCR 灵敏度高, 最低可检21个拷贝, 无需病毒培养, 可直接从病料中检出 H5 亚型 AIV RNA, 可在4 h内完成从样本的处理到报告结果的全过程, 可用于 H5 亚型AIV 的筛检及流行病学调查。

参考文献

[1]唐秀英, 田国斌, 赵传珊, 等.中国禽流感流行株的分离鉴定[J].中国预防兽医学报, 1998, 20 (1) :1-5.

[2]CHANG WL, DAVID LS.Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5and H7subtypeavian influenza virus[J].Journal of Virological Methods, 2004, 119:151?158.

[3]PHAML HM, KONNAIL S, USUIL T K S, et al.Rapid detection and differentiation ofnewcastle disease virusby real-time PCR with melting-curve analysis[J].Arch Virol, 2005, 150:2429?2438.

[4]卢亦愚, 严菊英, 冯燕, 等.TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒[J].中国病毒学, 2006, 21 (5) :472-476.

[5]秦智锋, 吕建强, 肖性龙, 等.禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立[J].病毒学报, 2006, 22 (2) :131-136.

H5亚型禽流感 篇6

目前已知的所有亚型的A型流感病毒都存在于野生水禽体内, 野生水禽是这些病毒的天然贮存库。A型流感病毒可以从不同物种的动物中分离到, 并且这些病毒在不同物种的动物中具有不同的发病率和死亡率。更重要的是, A型流感病毒可以引起对人类具有潜在致死性的呼吸性疾病。这些病毒一直以很高的发病率感染着人类并且引起了全世界对潜在人流感大流行的关注。

1 我国H5N1亚型HPAI疫情

1.1 家禽疫情

我国自2004年1月26日报道广西壮族自治区隆安县第一起H5N1亚型HPAI疫情之后, 短时间我国大面积发生高致病力禽流感疫情, 20d内16个省出现49起疫情, 范围广泛, 涉及的禽鸟种类繁多, 同时有深圳野生动物园的黑天鹅发生死亡。我国政府立即采取免疫与扑杀相结合的防制策略使疫情得到了有效控制, 2004年下半年, 疫情趋于稳定。

2005年上半年, 个别省份出现H5N1亚型HPAI, 至下半年10月, 辽宁省黑山县突然发生大量家禽死于H5N1亚型HPAIV感染, 疫病迅速蔓延至周边市县。病毒特性研究表明, 其与当年上半年我国青海湖野鸟死亡病毒亲缘关系是否密切, 说明该起疫情由野鸟引进当地。2005年, 中国内地共有13个省份发生32起高致病性禽流感疫情, 其中青海发生1起候鸟疫情, 发病家禽16.3万只, 死亡15.5万只, 扑杀2257.1万只。青海、新疆、西藏、内蒙古、安徽、湖南、辽宁、湖北、山西、宁夏、云南、江西、四川13省。全年共接到疫情报告42起, 确诊32起, 排除10起。

2006年2月4日, 山西省阳泉市种鸡场发生禽流感疫情。该鸡场具有20年历史, 是阳泉市规模最大的养鸡场。严格执行免疫程序、禽流感H5平均抗体水平较高且较整齐的情况下, 鸡群短时间内发生大量死亡。这与之前其他省份的H5N1亚型HPAI疫情发生情况有所不同。鸡群各种疫苗免疫抗体均达到标准, 在此前提下, 感染H5亚型禽流感病毒并发生大面积急性死亡的可能性不大, 但从病料中分离到了H5N1亚型禽流感病毒, 对此次疫情进行了确诊。在对该病毒各基因的遗传进化及抗原性系统分析发现, 其与近年来引起我国同亚型疫情的病毒同源率差异较大, 并具有抗原变异性, 定义为“山西鸡型”抗原变易株。随后的疫情诊断及流行病学调查数据表明, 该“山西鸡型”抗原变易病毒广泛流行于山西、宁夏等省的免疫鸡群, 引起产蛋大幅下降和高达30%的死亡率。

2006年, 中国内地共有7个省份发生10起家禽高致病性禽流感疫情。死亡家禽4.7万只, 贵州、山西、安徽、新疆、宁夏、湖南、内蒙古7省, 扑杀家禽294万只。另外, 发生候鸟疫情1起, 涉及青海、西藏2个省, 共死亡候鸟3641只。

2007~2009年, 我国家禽发生了数量有限的几起高致病性禽流感疫情。

1.2 野鸟疫情

2005年5月迁徙至我国青海湖的野鸟发生H5N1亚型HPAI, 这是世界流感史上首次野鸟发生HPAI。4月30日, 我国青海省青海湖保护区管理局工作人员首先在蛋岛发现个别斑头雁出现异常, 5月4日, 3只斑头雁不明原因死亡, 而后又相继在鸟岛及其周边地区发现了大量死鸟。5月8日, 青海湖鸟岛、泉湾等地共发现150只死亡斑头雁。5月10日, 青海省农牧厅将取样检测结果为疑似禽流感的病料送往国家禽流感参考实验室, 经诊断为H5N1亚型HPAIV感染, 此次疫情持续近2个月, 导致6000多只野鸟死亡。

2006年4月23日, 青海省玉树州玉树县湿地斑头雁开始因H5N1亚型HPAIV感染而发病死亡, 之后果洛、海北2个州和西藏那曲、班嘎、安多、当雄、申扎等多个地区出现野鸟的死亡。至6月1日, 青海、西藏2省 (区) 累计发现死亡候鸟1168只, 死亡野禽种类不仅有斑头雁、棕头鸥、鱼鸥、鸬鹚、赤麻鸭、潜鸭、猫头鹰、燕鸥、天鹅、黑颈鹤、喜鹊, 还发现新增白鹭、草原雕、野鸭、鹞鹰和乌鸦。截至10月份共死亡候鸟3641只。

至今, H5N1亚型HPAI已遍布亚洲、欧洲和非洲30多个国家, 涉及包括家禽和野鸟等几十种鸟类, 预示着这一致命病毒随着鸟类迁徙已扩展到世界其他地区。

2009年, 青海湖野鸟死亡200多只, 研究者发现该病原并非为几年前的Clade2.2分支病毒, 而是东南亚及我国南方家禽中存在的Clade2.3.2分支病毒, 该篇研究报告发表在新出现传染病杂志上 (Emerging infectious disease) 。因为随着野鸟的迁徙, Clade2.2分支的病毒已经在迁徙路线多个国家和地区引起家禽甚至人类的发病和死亡。一些国家及时采取了疫苗免疫的防治策略, 新分支病毒同样会被野鸟携带到世界各地, 它的出现为全世界H5N1高致病性禽流感的防控提出了新的课题。Clade2.3.2分支病毒的发现也证实了禽流感的防控是一项十分艰巨的任务, 任重而道远。

2 猪群疫情

迄今为止, 包括中国在内, HPAI H5N1亚型流感病毒在世界上还未在猪群内引起大范围疫情暴发。但是, 在2001年和2003年的主动监测过程中, 在我国福建省的猪群中分离到了HPAI H5N1亚型流感病毒。尤其是在2001年和2003年, 在同一个猪场分离到了两株病毒。对其序列分析显示这两株病毒与先前报道的鸭病毒A/duck/Zhejiang/2/00 (H5N1) 非常相近并且有很大的同源性, 这表明HPAI H5N1亚型鸭源病毒可能已经传染了猪并且在这些动物中呈隐性传播。这一事件引起了人们的关注, 因为猪一直被认为是人和禽流感病毒发生重组的混合器。

3 中国人群中H5N1亚型病毒的感染

1997年, 在香港报到了第一例人感染H5N1亚型流感病毒的病例, 当时18个感染的人中有6人死亡。这成为了第一个报道人感染禽流感病毒死亡的事件。此后没有人感染病例发生, 直到2003年, 两个香港人感染了此病, 其中一人死亡。自从2003年, 当新的HPAI H5N1亚型疫情暴发时, 在中国大陆, 2005年之前还没有人感染H5N1病毒感染的报道。2005年之后, 40个人感染其中26人死亡。对2005年9月到2006年7月 (未发表的数据) 从13例死亡及3个未死亡的人体内分离的16株病毒的全基因序列和抗原性分析显示, 在这些病毒的M2和NA蛋白中不含有针对金刚烷类和奥司他韦抗药性的突变位点, 尽管其中有8个人在疾病过程中曾接受抗病毒药物治疗。

从中国南方分离的15株人流感病毒的HA基因属于2.3.4亚类, 它们彼此之间以及与在同一时期同一地理位置分离到的H5N1家禽病毒很相似, 这表明感染的家禽是人感染流感的传染源。相比而言, 在中国北方新疆自治区分离到的一株人流感分离株的HA基因与青海湖样病毒的HA非常接近。这16株人源流感病毒的HA蛋白裂解位点处的氨基酸序列与中国南方和北方分离株不同;然而, 它们在HA的裂解位点处都含有多个碱性氨基酸, 这也是高致病性禽流感病毒的标志。

抗原性研究显示从中国南方分到的人源病毒彼此之间很相似 (未发表的数据) 。然而, 它们的抗原性与从印度尼西亚、越南、土耳其分离到的H5N1亚型的病毒不同 (未发表的数据) 。所以, 目前WHO推荐的流行疫苗株A/Vietnam/1203/04 (H5N1) 仅仅能保护在中国南方流行的H5N1亚型病毒。

2005年10月~2008年4月发生在中国的26例人感染H5N1病毒, 17人已经死亡。利用抗病毒药物进行治疗挽救了更多人的生命, 即相比未接受抗病毒药物的治疗14个病人中有1个存活而言, 接受治疗后12个病人中有8个可以存活。

当前流行的HPAI H5N1亚型病毒并不会有效地在人群中传播。不过, 人与人之间的传播的可能性病例也曾报道过。在2007年12月, 中国江苏省便发生了一例:一个24岁的人死于H5N1病毒的感染, 同时他的52岁的父亲也被感染, 但经过及时的抗病毒药物治疗和接种免疫血清后康复了。从这两个人体内分离的病毒除了在NS基因上有一个非同义性核苷酸替换外, 其它的都相似, 而这个替换使得NS2蛋白的82位的谷氨酸变为甘氨酸。

4 中国H5N1亚型HPAIV系统进化特征

H5N1亚型HPAIV首先于1996年分离自中国广东省的一病鹅体内。1997年, 这些病毒在香港鸡群中引起了疫情的暴发, 并且传染给了人类, 造成6人死亡。1997年在香港家禽中引起疫情并且传染给人的这些H5N1病毒 (;样病毒) 的HA基因可能来自于GS/GD/1/96, 剩下的7个病毒基因片段则来自于其它的禽类病毒。

自1999年以来, 在中国南方沿海各省一直都可以在健康的鸭群体内分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒。2004年初, 这些病毒在16个省的鸭、鹅及鸡群中引起了疫情的暴发, 2005年暴发地更多。从那时起, 在青海和西藏地区的野生水鸟 (2006年4月) , 广东的商品鸭 (2007年9月) 及2006年6月、2007年3月的家禽中均有疫情暴发的报道。2008年的1月、2月、3月在中国的不同地区的家禽中有更多疫情暴发的报道。

自从1999/2000年HPAI H5N1病毒在中国南方鸭群中重现后, 它一直在进行着高频率、大范围的重组, 结果产生了一些不同的基因型。这些基因型中, 以2002年的Z基因型为主。在2005年底, 在中国南部检测到一个新的亚系的病毒-福建样病毒。这些病毒在中国南方占主导地位, 并且在香港、老挝、马来西亚、泰国引起了疫情的暴发。

大多数的H5N1亚型高致病性禽流感病毒的HA基因属于GS/GD/1/96 (H5N1) 系, 所有的H5N1亚型HPAIV的HA都在其裂解位点处有连续的碱性氨基酸 (-RRKKR-) , 这也是高致病性禽流感病毒的特征。尽管在进化树中HPAI H5N1的HA基因存在于不同的组中, 但它们仍被认为是一个群。

根据它们的HA序列, HPAI H5N1病毒可以分为10个亚群。大多数组属于亚群0 (来自于香港和中国的早期祖先病毒, 1996~2002) , 亚群2.1 (印度尼西亚的禽和人分离株, 2003~2007) , 亚群2.2 (2005年青海湖疫情及蒙古祖先株, 2005~2007东欧、西欧、中东、非洲的禽和人分离株) , 亚群2.3 (2003~2006中国、香港、越南、老挝、马来西亚禽和人分离株) , 亚群2.4 (2002~2005中国云南, 广西省禽病毒分离株) 和亚群2.5 (2003/2004韩国、日本、中国及2006中国汕头禽病毒分离株) 。

HPAI H5N1分离株的NA基因可以分为两个群。一个群包含1997年的人和家禽分离株、以及2005年从越南水禽的蛋表面分离的病毒株。这个群的NA基因在其茎部有19个氨基酸的缺失 (54~72位) 。第二个群的NA可以分为两个亚群, 即NA蛋白为GS/GD/1/96样 (例如, 含有全长的NA茎部, 无氨基酸缺失) 和在NA茎部有20个氨基酸 (49~68位) 缺失的GS/GD/1/96源病毒, 这个亚群病毒NA的颈部缺失与第一群的病毒茎部19个氨基酸的缺失位置不同, 但有重叠的部分。

中国的HPAI H5N1病毒的PB2, PB1, PA和NP基因的进化树非常相似, 均可分为2个群。其中的一个群包含有1997年从香港的人及家禽中分离到的病毒, 以及2005年从越南水禽的蛋表面分离到的病毒。第2个群可以进一步分为几个亚群。这两个群之间的同源性还不到90%, 而亚系之间的则具有90%~95%的同源性。

同聚合酶和NP基因相似, 1997年H5N1香港流感病毒的M基因也形成了一个独立的群, 然而剩下的中国的H5N1 HPAI病毒则构成了另外一个群, 此群也进化为多个亚群。A/duck/Guangdong/40/00病毒的M基因与其它的H5N1 HPAI病毒完全不同, 它形成了一个独特的亚群。

中国HPAI H5N1鸭病毒的NS基因分成了两类等位基因, A和B。GS/GD/1/96和其它的HPAI H5N1鸭病毒的NS基因属于B类, 而剩下的NS基因, 包括1997年的香港人流感病毒则属于A类。A类又可以进一步分为两个分支。由A类的一个分支的病毒推断得到的氨基酸序列显示其在80~84位有5个氨基酸的缺失。

H5亚型禽流感 篇7

瞬时表达是指外源基因进入受体细胞后未整合进受体细胞基因组而立即转录,并出现基因产物,是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间相互作用的重要手段。瞬时表达不需要整合到染色体上,因此具有简单、快速、周期短、准确、表达效率较稳定、转化率高的特点,得到了广泛的应用。本研究通过扩增H5亚型禽流感病毒NS1基因,连接pCAGGS载体,提取重组质粒进行测序并将重组质粒通过脂质体转染293T细胞,运用间接免疫荧光方法检测目的基因的产物,使得NS1基因在293T细胞中取得很好的瞬时表达效果,为深入研究NS1蛋白的结构和功能、变异规律及建立禽流感感染与免疫鉴别方法提供工作基础。

1 材料和方法

1.1 质粒和细胞株

人肾上皮细胞系293T,由农业部动物流感重点开放实验室提供;含AIV NS1基因的重组质粒NS1-T,由农业部动物流感重点开放实验室构建,保存。

1.2 主要试剂

DL-2 000 Marker、DL-15 000 Marker、Taq DNA聚合酶,购自宝生物工程(大连)有限公司;Lipofectamine转染试剂盒,购自Invitrogen公司;DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胰酶,购自Gibco公司;胎牛血清(FBS),购自Hyclone公司;质粒提取试剂盒,购自Axygen公司;异硫氰酸荧光素标记羊抗鼠IgG抗体(FITC-IgG),购自Santa Cruz公司。

1.3 重组质粒的制备及酶切鉴定

用NS1基因片段连接pCAGGS载体,经Trans 109感受态细胞转化,扩增培养。参照质粒提取试剂盒说明书提取、纯化重组质粒,并经SacⅠ、XhoⅠ酶切鉴定。

1.4 脂质体法转染293T细胞

转染前将处于对数生长期的细胞经胰酶/EDTA常规消化后铺于6孔板中,培养12 h;加入200 μL Opti-MEM并与10 μL脂质体轻轻混匀,静置15 min,此为混合液1;将5 μg重组质粒与200 μL Opti-MEM混匀,此为混合液2;将混合液2缓慢加到混合液1中,静置30 min;期间将细胞培养液弃去,用Opti-MEM洗3次;之后将脂质体-重组质粒混合物加到6孔板中的1个孔中,并补加1 mL Opti-MEM,置于37 ℃、CO2培养箱中培养,12 h后吸去培养基,加入Opti-MEM进行换液,转染36 h。

1.5 间接免疫荧光检测目的蛋白

转染后,小心取出6孔板,每孔加4%多聚甲醛1 mL,37 ℃固定30 min;PBS洗3次,加500 μL 5%Triton打孔,室温作用20 min;PBS洗3次,加5%脱脂乳,37 ℃封闭30 min;PBS洗3次。取鼠NS1阳性血清、鼠阴性血清与农业部动物流感重点开放实验室制备的针对NS1蛋白的单克隆抗体作为一抗,用PBS稀释到工作浓度,滴加在6孔板相应孔内,于湿盒内37 ℃作用1 h;取出后用PBS洗涤3次,每次5 min,同时振摇;以1∶200稀释FITC标记羊抗鼠IgG作为二抗,体积为450～500 μL,室温作用1 h;取出后用PBS洗涤3次,每次5 min,同时振摇;加入100 μL PBS,检测荧光信号。

2 结果

2.1 重组质粒的酶切鉴定结果

NS1-pCAGGS质粒经Sac Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切和PCR鉴定,在约700 bp和4 700 bp处出现目的条带,与预期结果相符,见图1。

M1.DL-2 000 Marker;M2.DL-15 000 Marker; 1. NS1-pCAGGS酶切产物。

2.2 间接免疫荧光法检测结果

阳性血清及单克隆抗体转染组的NS1-pCAGGS转染细胞的细胞膜上可见大量特异的绿色荧光,见180页彩图2A和2B;而阴性血清对照组未见有绿色荧光,见180页彩图 2C)。表明NS1基因在 293T细胞中得到了表达。

3 讨论

禽流感自1878年在意大利首次被Perroneito报道以来,陆续在世界各地均有出现。作为一种感染禽类的烈性传染病,对养禽业危害严重,同时可通过种间屏障传给人类,2003年至2012年12月期间,世界卫生组织通报有610例实验室确诊感染H5N1亚型禽流感,分布于15个国家,360人死亡,禽流感的防控具有重要的公共卫生意义。在禽流感的防控上主要采取疫苗免疫接种的方法,尤其在我国对H5亚型高致病性禽流感采取强制免疫措施。进行免疫效果评价的重要依据为检测免疫后个体的抗体水平,而野毒感染后期也会刺激机体产生抗体。目前,如何区分机体内抗体是由疫苗免疫还是野毒感染产生是禽流感研究的一个热点。禽流感病毒NS1蛋白大量存在于感染的细胞中,在细胞感染流感病毒的早期,病毒在繁殖、复制过程中可发现细胞核内有大量的NS1聚集[4,5],另外还可以在细胞质内发现。由于NS1蛋白不存在于成熟的病毒粒子中,因此理论上在感染鸡群血清中可以检测到NS1抗体,在免疫鸡群血清中NS1抗体水平很低或者不存在[6]。

瞬时表达转染目的基因通常在48 h之内就可以完成,短时间内能够迅速表达出小量蛋白,具有简单、快捷的特点,这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达[7]。利用阳离子脂质体作为基因载体,其介导基因转移的过程如下:阳离子脂质体与带负电的DNA结合形成脂质体/DNA复合物,脂质体过量而使复合物带正电,由于静电作用与带负电的细胞膜结合,通过与细胞膜融合或胞吞的作用进入细胞内,之后脂质体与DNA分离通过新陈代谢并被排出细胞外,DNA进入细胞核,从而产生目的基因编码的蛋白[8]。

本试验通过阳离子脂质体对禽流感病毒NS1基因进行转染,通过间接免疫荧光对转染结果进行检测,结果表明NS1蛋白获得了较高效率的表达,并且经过农业部动物流感重点开放实验室制备的单克隆抗体对其进行了进一步的验证,为今后深入研究NS1蛋白的结构和功能、变异规律及对禽流感感染与免疫鉴别研究提供理论基础。

参考文献

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[7]包红梅,姜永萍,李泽君,等.禽流感H5亚型HA基因在Cos-7细胞中的瞬时表达与检测[J].中国预防兽医学报,2004,26(5):321-323.

H5亚型禽流感 篇8

1 材料与方法

1.1 疫苗

为哈尔滨维科生物技术开发公司生产的禽流感灭活疫苗 (H5N1亚型, Re-6株) 。

1.2 禽流感HI抗原及阴、阳性血清

购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.3 试验鸡

为50周龄的正常产蛋的蛋鸡。

2 方法

2.1 安全性试验

2.1.1 注苗

取100只蛋鸡, 腿部肌肉接种疫苗, 每只1.0m L, 再取50只为对照组, 注射相同剂量的生理盐水。

2.1.2 观察

注苗鸡和对照鸡一并连续观察14d, 观察试验鸡的临床症状, 检查疫苗吸收的情况, 统计不良反应的试验鸡数量及死亡数量, 同时对死亡的鸡进行剖检, 确认死亡的原因。

2.4 剖检

在观察14d后, 各组各剖杀10只鸡, 观察脏器的病理变化, 并和对照组进行对比。

2.5 产蛋率的统计

统计观察的30日内产蛋数, 统计产蛋率, 并和对照组进行对比。

2.2 效力试验

2.2.1 注苗

取100只蛋鸡, 腿部肌肉接种疫苗, 每只0.5m L, 再取50只为对照组, 注射相同剂量的生理盐水。

2.2.2 采血

在免疫后3周、5周、7周、13周, 免疫组和对照组一并采血, 并分离血清, 置4℃冰箱备用。

2.2.3 HI抗体测定

2.2.3. 1 血凝 (HA) 试验 (微量法)

(1) 在微量反应板的1～12孔均加入0.025mL PBS, 换滴头。

(2) 吸取0.025mL病毒悬液 (如感染性鸡胚尿囊液) 加入第1孔, 混匀。

(3) 从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔, 混匀后吸取0.025mL加入第3孔, 如此进行对倍稀释至第11孔, 从第11孔吸取0.025mL弃之, 换滴头。

(4) 每孔再加入0.025mL PBS。

(5) 每孔均加入0.025mL 1% (V/V) 鸡红细胞悬液 (将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入) 见附录B (规范性附录) 。

(6) 振荡混匀, 在室温 (20℃～25℃) 下静置40min后观察结果 (如果环境温度太高, 可置4℃环境下) 。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。

(7) 结果判定将板倾斜, 观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝 (不流淌) 的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位 (HAU) 。

2.2.3. 2 HI效价测定

(1) 根据2.2.3.1试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点, 终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如, 如果血凝的终点滴度为1:256, 则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64 (256除以4) 。

(2) 在微量反应板的1～11孔加入0.025mL PBS, 第12孔加入0.05mL PBS。

(3) 吸取0.025mL血清加入第1孔内, 充分混匀后吸0.025mL于第2孔, 依次对倍稀释至第10孔, 从第10孔吸取0.025mL弃去。

(4) 1～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL, 室温 (约20℃) 静置至少30min。

(5) 每孔加入0.025mL 1% (V/V) 的鸡红细胞悬液混匀, 轻轻混匀, 静置约40min (室温约20℃, 若环境温度太高可置4℃条件下进行) , 对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。

2.2.3. 3 结果判定

以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

3 结果

3.1 安全试验

3.1.1 临床观察

在观察的14d内, 试验鸡的注苗部位均没有炎症反应, 疫苗的吸收情况也正常, 用手触摸注苗部位, 吸收正常, 对照组和免疫组均没有鸡出现死亡, 详见表1。

3.1.2 剖检结果

所有试验鸡在注苗后, 各组取10只, 于注苗14日进行剖检, 观察了注苗鸡的肝脏、脾脏、法氏囊、胸腺的病理变化, 注苗的蛋鸡各个脏器均无病理变化, 发育状况正常, 和对照组无差异, 详见表2。

3.1.3 产蛋结果

在观察期结束后, 对试验鸡进行产蛋统计, 实验组1个月产蛋2864枚, 对照组30日产蛋为1438枚, 试验组和对照组的产蛋率分别为95.5%和95.8, 产蛋率差异不显著。

3.2 效力试验

疫苗免疫后3周, HI抗体平均值为6 log2, 在7周后, 抗体升至高峰HI抗体平均值为9.7 log2, 在13周时, 抗体值没有下降, 详见表3。而对照组抗体则一直为阴性。

4 讨论