DNA快速提取

DNA快速提取（精选十篇）

DNA快速提取 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料:

兔毛,自行收集,作为阴性对照。绵羊毛(原毛)、山羊绒(加工品,蓝色)、70%绵羊毛和30%山羊绒毛衣料(肉色)、浅绿色毛衣料、深墨绿色毛衣料、灰色毛衣料、墨绿色毛衣料、灰色格子西装布料、灰色西服布料均由作者单位轻纺实验室收集。

1.1.2 试剂:

2×Taq PCR MasterMix购自厦门泰京生物技术有限公司。组织和毛发DNA提取试剂盒[与DNA IQTM系统结合使用,内含蛋白酶K、二硫疏糖醇(DTT)]为Promega公司产品。螯合树脂(Chelex-100)为Sigma公司产品。18S rDNA片段的引物,18S-1:5′-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3′和18S-2:5′-AATTTGCGCATTGTGCGTCA-3′,PCR产物大小为137bp[4]。山羊和绵羊成分的引物,Yang-1:5′-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3′和Yang-2:5′-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3′,PCR产物大小为294bp[5];OV1:5′-TATTTGGTCTCCCCCTCGTT-3′和OV2:5′-CCTCCTCATAAAGGAATGGC-3′,PCR产物大小为292bp[6];Yang-A:5′-CACAGCCCTCGCCATAGT-3′和Yang-B:5′-AGTTGTCTGGGTCTCCGAGTAG-3′,PCR产物大小为199bp[7]。所有引物委托北京赛百盛基因技术有限公司合成。引物用TE溶液(pH8.0)稀释至10μmol/L,-20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取:

以兔毛、绵羊毛、山羊绒、70%绵羊毛和30%山羊绒毛衣料为试验材料。将样品剪碎,经分析研磨机打散、混匀,再尽量剪断。各称取5mg于1.5mL离心管中,按以下方法提取DNA。方法一(Chelex-100法):参考文献[8]做以下3种处理:1)加100μl Chelex-100(50mg/mL);2)加90μl Chelex-100,10μl蛋白酶K(18mg/mL);3)加80μl Chelex-100,10μl蛋白酶K,10μl DTT(1mol/L);56℃温浴6h,剧烈振荡10s;100℃煮沸8min,振荡10s;12 000r/min离心3min,取上清,即为DNA溶液。方法二(试剂盒法):参照说明书中毛干线粒体DNA的提取方法。

1.2.2 18S rDNA片段的PCR检测:

PCR反应体系为:2×Taq PCR MasterMix 10μl,引物各0.4μl,DNA模板4μl,ddH2O 5.2μl。PCR反应条件为:94℃ 3min;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 30s,40个循环;72℃ 5min。取15μl PCR产物,经20mg/mL琼脂糖凝胶电泳(98V,40min)检测。

1.2.3 扩增山羊和绵羊源性成分的引物筛选:

以方法二提取的兔毛、绵羊毛、山羊绒、70%绵羊毛和30%山羊绒毛衣料的DNA为模板,PCR反应体系和产物检测方法同1.2.2。Yang-1、Yang-2的PCR反应条件同1.2.2。OV1、OV2的PCR反应条件为:94℃ 3min;94℃ 20s,56℃ 40s,72℃ 40s,40个循环;72℃ 3min。Yang-A、Yang-B的PCR反应条件为:95℃ 3min;94℃ 30s,60℃ 20s,72℃ 20s,40个循环;72℃ 5min。

1.2.4 山羊和绵羊源性成分的PCR检测:

根据1.2.3筛选结果选用扩增山羊和绵羊源性成分的引物和反应条件。以试剂盒法提取其他供试材料的DNA,PCR扩增18S rDNA片段、山羊和绵羊源性成分。

2 结果与分析

2.1 DNA的18S rDNA片段PCR扩增结果

采用Chelex-100法和试剂盒法,提取兔毛、绵羊毛、山羊绒、70%绵羊毛和30%山羊绒毛衣料的DNA,用所有真核生物均具有的18S rDNA片段的引物进行PCR扩增,以检验是否提取到DNA,结果如图1所示。方法一处理1)、处理2)和方法二提取的4种试验材料DNA均扩增到较亮的目的片段,而方法二的4种试验材料均为明亮条带;方法一处理3)的4种试验材料均为浅带。结果表明,方法一处理3)的提取效果最差,方法二的提取效果最好。

1~4:方法一处理1);5~8:方法一处理2);9~12:方法一处理3);13~16:方法二;1、5、9、13;兔毛;2、6、10、14:绵羊毛;3、7、11、15:山羊绒;4、8、12、16:70%绵羊毛和30%山羊绒毛衣料;17:空白对照(ddH2O);M:DNAmarkerⅠ。

2.2 扩增山羊和绵羊源性成分的引物筛选结果

查询相关文献,发现既能扩增山羊源性成分又能扩增绵羊源性成分的引物有多对,因此我们以试剂盒法提取的DNA为模板,对搜索到的3对扩增山羊和绵羊源性成分的引物进行了筛选,结果如图2所示。引物OV1、OV2的扩增效果明显不如其他2对引物,而引物Yang-A、Yang-B的扩增效果优于引物Yang-1、Yang-2,尤其是对绵羊的扩增效果更好,这与文献[6]的研究结果一致。

1~4:引物Yang-1、Yang-2;5~8:引物OV1、OV2;9~12:引物YangA、Yang-B;1、5、9:兔毛;2、6、10:绵羊毛;3、7、11:山羊绒;4、8、12:70%绵羊毛和30%山羊绒毛衣料;M为DNAmarkerⅠ。

2.3山羊和绵羊源性成分的PCR扩增结果

取的4种材料DNA中的山羊和绵羊源性成分,结果如图3所示。兔毛作为阴性对照,均无目的条带。方法一的3种处理提取的DNA或目的条带浅或根本无目的条带,而蓝色的山羊绒经3种处理提取的DNA均未扩增到条带,相比较处理3)扩增效果最差。方法二提取的DNA均扩增到明亮的目的条带结果再次表明方法一处理3)的提取效果最差,方法二的提取效果最理想,这与18S rDNA片段的扩增结果一致。

用方法二即试剂盒法提取其他试验材料的DNA,并用PCR扩增18S rDNA片段、山羊和绵羊源性成分,结果如图4所示,供试材料均扩增到18s rDNA片段、山羊和绵羊源性成分的目的片段。结果表明应用试剂盒法均提取到供试材料的DNA,所有供试材料中均含有山羊绒和或绵羊毛。将所有供试材料(除兔毛外)置普通显微镜下观察,均显示山羊绒和或绵羊毛的特殊表面形态供试材料的检测结果与显微镜观察结果的符合率为

3 讨论

动物毛纤维中DNA含量极其微量,核DNA主要存在于毛囊部位,发干中几乎没有核DNA。有关动物毛DNA提取方法有一些报道,方法多种,如PCR缓冲液法、SDS-蛋白酶K法等,但大多从毛囊部位提取DNA[8,9]。由于羊绒羊毛织品中几乎不存在毛囊,且织品的含毛量并不是100%,因此DNA提取显得较困难。国外关于羊绒羊毛织品DNA提取、分子生物学鉴别方面的报道极少[3]。国内在这方面都为综述性报道[1,10,11],研究报道还是空白,本文在国内首次报道了羊绒羊毛织品DNA提取方法。

动物毛纤维的毛干是线粒体DNA的丰富来源,本文扩增18S rDNA片段、山羊和绵羊源性成分的引物序列是位于真核生物、山羊和绵羊的线粒体中。另外,本文所用的试剂盒可用于毛囊、毛干、组织等的DNA提取,而本文是参照毛干线粒体DNA的提取方法,且取样量大,而不是如高林林等[12]报道的仅用几根毛干。因此,本文采用试剂盒法可成功提取到羊绒羊毛织品的DNA。

应用试剂盒提取羊绒羊毛织品DNA,整个过程只需2h左右,比SDS-蛋白酶K法大大节约了时间。因此,试剂盒法是一种快速、高效的适用于羊绒羊毛织品DNA提取的方法。

摘要：目的:建立一种快速、高效的羊绒羊毛纺织品DNA提取的方法。方法:采用chelex-100法的3种处理、试剂盒法分别提取羊绒羊毛织品的DNA,用18S rDNA片段、山羊和绵羊源性成分PCR扩增结果来比较提取效果。结果:试剂盒法提取DNA的效果优于chelex-100法,整个提取过程约需2h。9种供试材料均提取到DNA,且含有山羊和/或绵羊源性成分,与显微镜观察结果的符合率为100%。结论:建立的试剂盒法是一种快速、高效的适用于羊绒羊毛织品DNA提取的方法,为应用分子生物学方法鉴别山羊绒和绵羊毛奠定了基础。

关键词：羊绒羊毛织品,DNA提取,山羊和绵羊源性成分,聚合酶链式反应(PCR)

参考文献

[1]金美菊,阮勇,石东亮,等.羊绒与羊毛纤维的鉴别检测综述[J].山东纺织科技,2007,48(4):28-30.

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[3]Selvi Subramanian,T.Karthik,N.N.Vijayaraaghavan.Single nucleotidepolymorphism for animal fibre identification[J].J Biotechnol.,2005,116(2):153-158.

[4]潘良文,陈家华,丁燕,等.进口肉骨粉中牛成分检测研究[J].生物技术通报,2001,(5):23-26.

[5]GB/T 20190-2006.饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法[S].

[6]潘良文,沈禹飞,张舒亚,等.肉骨粉中羊成分检测方法研究[J].检验检疫科学,2004,14(2):15-18.

[7]李林,徐江涛,张永强,等.PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成份种类[J].中国动物检疫,2004,21(4):29-31.

[8]胡钰娟,孔维佳,韩月臣,等.提取大鼠毛发核酸3种方法的比较[J].临床耳鼻咽喉科杂志,2004,18(5):288-291.

[9]黄娅琳.一种简便的DNA提取方法在动物毛发检验中的应用[J].中国司法鉴定,2008,(2):25-27.

[10]何兰芝,陈莉萍,王雪梅.山羊绒与羊毛纤维鉴别检测综述[J].上海纺织科技,2008,36(10):44-46.

[11]张小莉,池海涛,张经华,等.羊绒和羊毛纤维检测技术研究进展[J].毛纺科技,2009,(3):56-59.

DNA提取问题集 篇2

默认分类 2009-12-31 18:59:50 阅读155 评论0字号：大中小

提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰，DNA质量一直不高，如何消除多糖的影响？ 参考见解：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高，可用以下方法试一试：

1、在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。

2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。

3、沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀 物，将清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下 DNA 部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还 有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖。

上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA。曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。血样4度保存了2月，现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA，有什么解决办法？ 参考见解：按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来，下面是参考方法：

1、首先洗出白细胞，最好有1毫升以上血液。

2、加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。

3、加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴过夜。

4、用等体积的（酚，氯仿，异戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min离心收集水相。

5、取水层，加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥将DNA溶于适量水中。

CTAB法提取水稻基因组DNA，TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测，点样孔附近有一条明显的主带。用MBI 公司产的限制性内切酶酶切过夜，鉴定时发现DNA已经被完全切烂，只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。换用NEB 公司产的酶，更换EP管，灭菌水之后重复几次，结果还是如此。拿其他人的DNA 做对照，酶切结果正常。用异丙醇将DNA 重新沉淀，换了TE溶解，检测主带仍旧清晰，可是用酶切之后DNA还是被切烂。为什么？

参考见解：

1、公司的酶不行。

2、如做酶切，DNA最好不用异丙醇（因其不易挥发）而用无水乙醇沉淀。

3、酶量大或作用时间太长了。

建议重提DNA，取少许用超纯水溶解（非TE），按照说明书进行酶切。要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解；

要得到全血基因组DNA，可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗？这样做，与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异？ 参考见解：

1、觉得还是先分离细胞好，因为DNA和RNA大都是在细胞核内，有红细胞反而不太好。从血里面提RNA，用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的，效果还是不错的。

2、现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA，用密度梯度离心，只是富积淋巴细胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的话，没必要。

3、如果对基因组的要求不高，可以试试这个方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加无菌重蒸水500μl；10 000r/分钟离心3分钟，弃净上清；加20μl 5mol/L KI，旋涡振荡30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡30秒；10 000r/分钟离心5分钟，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加异丙醇60μl，轻轻混匀，10 000r/分钟离心5分钟，弃上清；加冷无水乙醇1000μl，10 000r/分钟离心5分钟；弃去无水乙醇，37℃烤干；50μl无菌重蒸水或TE，混匀溶解备用。

从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗？

参考见解：可以的，国外有好多相关试剂盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的吗？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以吗？每次在用酚氯仿异戊醇抽提后，上层里面都是絮状的蛋白质，离心几次都沉淀不下来，请问是哪里出了问题？

参考见解：一般来说，蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁，二者作用各异，不可替代。对于实验中的蛋白问题，建议离心后先用竹签挑出蛋白，小心吸取上层清液，再重复抽提几次试试。

一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K，这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化，不是很难除去吗？那DNA是不是不纯？可以用来酶切吗？

参考见解：蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白，而是消化细胞，在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物细胞的较易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、消化组蛋白，释放出DNA。

2、消化DNAse，提高DNA分子量。

建议还是加蛋白酶k为好，这样提出来的 DNA分子量会高一点，且更纯。提白粉孢子的总DNA，白粉孢子比较小，直接在研磨中加液氮研磨可以吗？

参考见解：液氮研磨的方法应该可行的，做动物组织，植物组织多采用这种方法，植物纤维一样可以用液氮研磨，要有耐心，边加液氮边研磨，研磨好后再抽提，应该是可以的。在CTAB法提取DNA时，有一些品种没有DNA析出，是什么原因？ 参考见解：

1、用预冷的异丙醇来沉淀试试，同时研磨的时候要研的非常非常的细。

2、没有看到析出物并不代表没有沉淀，可以继续下一步试验，溶解的时候少加一点儿。

3、高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。可能DNA就这样留在沉淀里了。提取DNA配方

CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌

冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，怎样更好的抑制内源核酸酶的活性？ 参考见解：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取，虽然总DNA提出来了，可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来，请有没有什么好的办法可以解决这个问题？

参考见解：环境特别是土壤的样品成分复杂，尤其是有腐殖酸具有和DNA类似的性质，因此用一般的国内试剂盒无法提纯。应当选用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗涤后硅胶膜上仍有杂色残留？

参考见解：细胞裂解不充分，裂解液和样品要快速充分混匀。洗涤产物中DNA量很少或没有？ 参考见解：

1、样品中细胞或者病毒浓度低。

2、裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分。

3、蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分。

4、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。

5、在上柱前，裂解物中没有加乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇。

6、DNA没有有效洗脱，提高洗脱效率，可将离心柱在加入洗脱液后在室温静止至少1min，再离心。

提取水果DNA 篇3

实验工具：温度计、碗、烧杯、试管、无针注射器、玻璃棒(或筷子)、过滤网、滤纸(或纱布)等。

尽可能地捣烂香蕉吧

将100克香蕉(约为半根)放在碗里，先用勺子碾碎，然后用木棒捣烂它!这一步骤里，请充分发挥你的实力，让香蕉完全变成香蕉泥，这样才能使细胞充分破碎。但如果你打算提取其他水果蔬菜的DNA，那么就需要借助厨房料理机来充分破碎哦。

配制提取液

香蕉的DNA存在于细胞核中。要释放DNA，必须要打破细胞壁、细胞膜以及细胞核的层层包裹。在“捣烂香蕉”这个步骤中，我们已经成功地破坏了细胞。由于细胞膜是由磷脂构成的，我们可以使用洗涤剂来帮助DNA与细胞膜分离。加入少许食盐，有助于消除包裹在DNA上的蛋白质。

提取DNA

加热到60℃有助于破裂的细胞加速释放出DNA。由于水果中都会含有一些破坏DNA的物质(也叫做酶)，加热可以使这些酶失效。然而在高温下放置太长时间也会破坏DNA，所以我们要在15分钟后将混合液放置在冰水中冷却。

菠萝汁的妙用

在提取水果DNA的过程中，加入蛋白酶可以消除蛋白质对DNA的影响，提高DNA的纯度。菠萝里含有的菠萝蛋白酶也可以分解蛋白质。我们平时吃菠萝的时候，口腔的刺激感就是菠萝蛋白酶等物质在捣乱。在盐水中浸泡可以使菠萝蛋白酶失效，菠萝的口感就会好很多。所以实验中一定要用新鲜的，没有泡过盐水的菠萝来榨汁哟!

Hello，DNA

DNA可以溶解在水中，但不溶于冷的酒精。如果用铁丝或竹签搅动，这些絮状物会缠绕在上面。快看，那些酒精中的白色物质就是香蕉的DNA啦!

DNA快速提取 篇4

生物遗传多样性研究、DNA指纹比对、系统发育分析等需要制备足量的大分子基因组DNA。近年来,国内外真菌分子生物学研究者针对具体的实验材料,考虑真菌细胞的化学组成结构,结合实验室的设备实际,发展了一些经济实用、行之有效的细胞破壁方法,如利用氯化苄提取稻瘟病菌DNA[5],以玻璃珠振荡代替传统液氮研磨提取雅致枝霉、深黄伞形霉的基因组DNA[6],以手电钻研磨法高效提取蜜环菌总DNA[7],以微波法提取曲霉菌DNA[8]。

我们过去在植物、真菌的分子生物学试验中,较多地使用液氮冷冻研磨供试材料[4],这是经典有效的细胞破壁方法,但缺点是操作繁琐,容易引起人为冻伤。当不同的研究样本较多、工作量较大时,如果冷冻研磨的材料未能及时进入后处理,那么大分子DNA就可能出现降解。用传统DNA提取方法需要大量的菌丝体培养物,而松茸在自然界与宿主共生形成外生菌根,其菌丝体不仅分离培养困难,而且在人工培养基上生长缓慢,培养两个月以上才能收获直径约1cm的菌落,积累的菌丝体十分有限。为了满足难培养珍稀共生食用真菌松茸的遗传多样性的研究需要,在暂时难以克服人工培养松茸缓慢问题的前提下,如果必须从微量的培养物中制备足量的大分子基因组DNA,改进DNA的提取方法显得非常必要。本文发展了松茸菌丝体冻融破壁的方法,可使细胞内的DNA复合物释放出来,有利于进一步采用萃取、沉淀等手段分离纯化满足实验要求的高质量DNA。该法省去了繁琐的研磨操作,既简便又安全,同时减少了样品转移过程中的损失,提高了收率。本文报道的冻融破壁方法,提取的DNA分子完整,适合一般真菌分子生物学的研究需要,不仅适用蕈菌松茸,而且用其它真菌包括酵母菌、丝状霉菌等做试验,同样取得了令人满意的效果。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

培养基药品购自DIFCO(USA);化学试剂购自Sigma(USA)、Merck(FRG)或联工化学(台湾);引物购自Operon(USA);Taq DNA polymerase 购自Protech(台湾);Photography film 667购自Polaroid (USA)。主要仪器包括Microcentrifuge, KM-15200(Japan);Temperature controlled centrifuge, 2k-15(Germany);Water bath, BL-20(台湾);DNA electrophoresis cell, Bio-Rad (USA);Mini-gel electrolohoresis unit, mupid-2 (Japan); Thermocycler, phc-3, Techne (British)。

1.2 供试培养物编号与来源

Tr1、Tr2:松口蘑Tricholoma matsutake (S.Ito et Imai)Sing. 不同分离菌株菌丝体,从松口蘑新鲜子实体分离[9];M1、M2:不同丝状真菌(霉菌)菌丝体,学名未鉴定,从松口蘑共生植物云南松根际土壤分离;Y1、Y2:不同酵母细胞,学名未鉴定,从松口蘑共生植物云南松根际土壤分离;R1、R2:立枯丝核菌第四融合群Rhizoctonia solani AG4菌丝体,中兴大学植物所保存菌株。

1.3 冻融破壁法提取微量培养物基因组DNA

取10~30mg培养菌体,加入600μl 裂解缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl, pH8.0;50mmol/l EDTA, pH8.0;1.4mol/L NaCl; 3%CTAB),震荡30s,液氮冷冻30s,70℃水浴融解2min。重复上述震荡、冷冻、融解过程3次。加入等体积氯仿/异戊醇(24/1),轻摇30s,12 000g离心2min。收集上清液,重复上述萃取1~2次,至上清颜色变淡、界面无杂质为佳。收集上清液,以等体积异丙醇沉淀,静置-20℃下30~60min,3 000g离心3min。DNA沉淀用70%乙醇洗后沥干,溶于50μl TE缓冲液(10mmol/l Tris-HCl, pH8.0;1mmol/l EDTA),置-20℃下保存。使用前按Sambrook J等[10]方法对DNA进行定量,配至所需浓度。

1.4 随机引物PCR指纹制备

25μl PCR组分:1×PCR buffer、100μmol/ldNTPs、2mmol/l MgCl2、0.4μmol/l primer、0.5u Taq DNA polymerase、10ng template DNA, 用ddH2O定容。分别选用松口蘑RAPD分析(曾东方,等.2001)[9]筛选的随机引物OPC 9: 5′-CTCACCGTCC-3′; OPC11: 5′-AAAGCTGCGG-3′,采用严谨PCR循环参数:94℃ 2min, 39℃ 2min, 72℃ 2min一个循环。然后94℃ 10s, 42℃ 30s,72℃ 1min 38个循环。最后72℃ 5 min。

取10μl PCR 产物,加2μl Loading buffer (0.25% bromophenol blue, 0.25% Xylene cyanol FF, 30% glycerol in water) (Sambrook J等,1989)[10],混合上样于1.5%Agarose gel中,置0.5×TBE buffer (45mmol/l Tris, 45mmol/l boric acid, 1mmol/l EDTA, pH8.0)中,以3v/cm电泳至溴酚蓝近前缘为止。把gel移至0.5μg/mL EtBr溶液中染色15~20min,R.O.H2O退染30min,透射紫外光观察,Polaroid成像系统记录。

2 结果与讨论

使用冻融破壁法提取微量培养物基因组DNA,结果见图1,显示得到高分子质量的DNA样品。经分析测量,所提DNA样品溶液浓度在30~50μg/ml,可满足100次以上的PCR实验用量。供进一步的PCR分析与DNA指纹制备,结果见图2,显示DNA条带清晰,指纹图谱完整,重复性强,很好地揭示出不同物种DNA水平的遗传多样性。

图中Lane 1,3:Tr1,Tr2;Lane 4,5: M1, M2;Lane 6,7:Y1,Y2;Lane 8,9:R1,R2;Lane 2:λDNA/H+E。样品编号参见1.2节Sample No. refer to 1.2。

图中Lane 1: 100bp ladder;Lane 2-9:Tr1-2,M1-2,Y1-2,R1-2 by OPC9;Lane 10-17:Tr1-2,M1-2,Y1-2,R1-2 by OPC11;样品编号参见1.2,1.4节Sample No. refer to 1.2,1.4。

将细胞在液氮低温下急剧冷冻,然后在室温下缓慢融化,如此反复多次,可使细胞壁破裂。这种冻融破壁法的机理,可能源自冷冻、热融、CTAB裂解的综合作用,其中,冷冻过程会促使细胞膜的疏水键结构破裂,从而增加细胞的亲水性能;同时胞内水结晶形成冰晶粒,引起细胞膨胀而破裂。将释放出来的细胞内容物用萃取、沉淀、离心等手段,可分离纯化出满足实验要求的高质量细胞总DNA。

本文报道的冻融破壁法的特点是采用液氮冷冻与室温融化交替处理松茸菌丝体,微量的培养物细胞充分破裂,细胞内的DNA复合物得以释放,与液氮冷冻研磨的破壁方法相比,本法省去手工研磨,因而更简便、安全。另外,利用本文报道的方法制备的细胞基因组DNA质量完整,很少降解,完全适用于进一步的真菌分子生物学研究,这要得益于它对传统DNA分离提取方法的改进,主要技术关键在于冻融破壁之前先把细胞样品置于缓冲液的保护中,抑制了DNA酶的活性,避免了DNA在反复冻融处理中的降解,故该法不仅可行,而且可靠。

将研究发展的冻融破壁法制备真菌基因组DNA及其PCR指纹,不仅适用于珍稀共生担子菌松茸Tricholoma matsutake (S.Ito et Imai)Sing.,而且适用于供试的其它真菌类群如酵母菌、丝状霉菌,提示本文报道的研究方法可能有较宽的应用范围,有待进一步研究、发展。

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dna的粗提取与鉴定 篇5

1、析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2、用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3、DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：

1、提取鸡血细胞的细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。 5 min

2、溶解细胞核内的DNA

3、析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢

4、过滤：取黏稠物

5、再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3 min

6、过滤：取滤液。

7、提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5 min

8、DNA的鉴定：沸水浴5min((1)无变化(2)蓝色)

上节课我们通过几个验证性实验，证明了DNA是主要的遗传物质。那么DNA是什么样的物质呢?今天我们就通过实验将它提取出来，进行观察和鉴定。

通过预习，我们知道选用鸡血细胞液作为实验材料。在制备鸡血细胞液时，所用的柠檬酸钠有防止血液凝固的作用。

制备过程中，一定要用刚宰杀的.鸡的新鲜血，并且要与抗凝剂充分混合，防止凝血。我们采用静置一天的方法，获得鸡血细胞液。

大家在动手做实验之前先要明确几个需要注意的问题。

1、要严格按照实验指导的方法步骤去操作。

2、实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，使用时玻璃棒不要碰到烧杯底，在不同的步骤中玻璃棒的用法不同，每一步的用法参照黑板上的指导去操作。

3、在DNA的鉴定中，所用的二苯胺是一种有毒性的试剂，大家在使用时注意不要让药液接触到皮肤或身体的其他部位，也不要近距离观察。

下面在实验进行过程中，要思考每一操作步骤要达到什么目的。

在进行步骤1时，利用搅拌的5分钟，做如下提问：

为什么要加蒸馏水?加入蒸馏水后细胞将会怎样?

(让细胞内溶液的浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破)

为什么要用力搅拌?

(可以加速血细胞和细胞核的破裂)

所以下一步骤过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质。

在进行步骤3时，要向全班明确：这一步骤是这个实验成败的关键，注意加蒸馏水的方法和使用玻璃棒的方法，千万不能太快太猛，防止打碎DNA。

观察滤取出来的黏稠物的颜色。

有的同学提取的黏稠物较少，原因可能是在溶解DNA时不充分，也可能是析出黏稠物时搅拌的快了。

将黏稠物再溶解时一定要充分，多搅拌。以免有DNA损失。

加入冷酒精时动作要慢。

当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌。至不再增加时，取出吸干上面的水分。仔细观察丝状物呈什么颜色?(黄色)

这些丝状物要用二苯胺鉴定。使用二苯胺时要注意不要接触到药液。进行沸水浴时，在实验室较为通风的地方集体进行。

利用沸水浴的5 min。

步骤3中加入蒸馏水的目的?与步骤1有什么区别?

(步骤3中加蒸馏水是使NaCl溶液的浓度逐渐降至0.14mol/L，使DNA的黏稠物析出。而步骤1加蒸馏水是为了让细胞吸水胀破)

步骤7为什么要加50mL的冷酒精?

(因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出。悬浮于溶液中)

现在大家从水浴锅中拿出试管，比较两个试管中溶液的颜色有什么不同?

(有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色)

这一鉴定结果说明什么问题?

(提取出的丝状物是DNA)

那么你看到的丝状物的粗细是不是DNA分子的直径呢?

(不是。DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA分子聚在一起形成的)

下面请同学们将实验用具，按原样摆放整齐，实验桌要保持清洁。

藜麦基因组DNA提取方法的比较 篇6

关键词：藜麦；DNA提取方法；分子检测；SSR；SSCP

中图分类号： S512.901 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0042-04

收稿日期：2013-08-10

基金项目：国家自然科學基金（编号：31301372）；浙江省重大科技专项计划（编号：2011C12030）；浙江农林大学创新训练计划（编号：201301004）。

作者简介：陆敏佳（1992—），女，浙江嘉兴人，研究方向为种子科学。E-mail：1035660826@qq.com。

通信作者：蒋玉蓉，博士，主要从事植物分子育种和种质创新研究。E-mail：yurongjiang746@126.com。藜麦（Chenopodium quinoa Willd），又称南美藜、藜谷、奎奴亚藜等，是一年生的藜科草本作物，原产于南美洲安第斯山脉海拔2 800～4 200 m的地区，分布于12°N～39°S的范围，在安第斯山脉已有5 000多年的种植历史，被印加人称为“谷物之母”[1]。藜麦蛋白质含量高，具有近乎完美的氨基酸组成，含有较高的钙磷铁，是联合国FAO唯一认定的完美营养食品，被誉为“未来的超级谷物”“营养黄金”“有机谷类之王”等[2-3]。研究表明，长期食用藜麦，对心脏病、高血压、高血糖、高血脂等有很好辅助治疗作用，此外还有增强免疫力、修复体力、补充营养、减肥等功效[4-5]。联合国大会宣布2013为“国际藜麦年”，旨在让世界更多地关注藜麦的生物多样性和营养价值在提供粮食和营养安全等方面所发挥的作用。藜麦的营养和开发利用价值在最近几十年才得到人们的广泛认识和重视。目前，藜麦的研究主要集中在生物学特性[6-7]、化学成分[8-9]、抗逆性等生理学特性[10-11]方面。与国外相比，我国对藜麦的研究还较少，尤其在藜麦分子生物学方面的研究几近空白。获取高质量的DNA样品是植物分子生物学研究的基础，而研究者对不同植物以及相同植物不同部位的DNA提取、处理方法又有所区别[12-16]，目前尚无关于藜麦基因组DNA提取方法的报道。本研究用改良的CTAB法、SDS法、高盐低pH值法3种不同方法分别提取藜麦的幼叶、茎、根部基因组DNA，同时进行SSR和SSCP等分子标记检测，旨在筛选出一种快速、简便且可获得高质量DNA分子的提取方法，为进一步开展藜麦分子生物学研究提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为藜麦品种PI596293，由浙江农林大学农学院提供。叶片的采集：取种植于田间的藜麦幼嫩叶片。茎、根部的采集：取PI596293种子置于发芽纸上，在25 ℃气候箱中培养12 d，分别取茎、根部用于DNA提取。

1.2主要试剂

试验试剂：EDTA、Tris、CTAB、PVP 40、SDS、β-巯基乙醇等均购自Sigma 公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇、氯化钠、醋酸钠、醋酸钾等为国产分析纯；TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker 购自TaKaRa 公司；引物由华大基因公司合成。

1.3DNA提取方法

分别取约0.15 g藜麦幼嫩的叶、茎、根于2 mL离心管中（设3次重复），用长柄镊子夹住离心管管盖放入液氮中速冻5 s，取出并用插有玻璃棒的电钻快速充分研磨。

1.3.1CTAB法加入600 μL预热的CTAB提取液[含0.1 mol/L Tris-HCl（pH值8.0）、0.02 mol/L EDTA（pH值8.0）、2%CTAB、2%PVP40、1 mol/L NaCl、0.2%β-巯基乙醇]，置于65 ℃水浴50～60 min，期间颠倒混匀数次；冷却至室温后加入等体积的氯仿-异戊醇-无水乙醇（76 ∶4 ∶20），颠倒混匀后于10 000 r/min离心10 min；吸上清液，加2倍体积的冰乙醇颠倒混匀，再将絮状DNA挑出并用70%乙醇洗涤2次；风干后加入80 μL ddH2O溶解，4 ℃冰箱保存。

1.3.2SDS法加入800 μL预热的提取缓冲液[含 0.5 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl（pH值8.0）、0.05 mol/L EDTA（pH值8.0）、0.01 mol/Lβ-巯基乙醇]，再加入80 μL 20%SDS（使终浓度为2%），振荡混匀后置于65 ℃水浴中 30 min，不停颠倒混匀；取出静置至室温，加入0.3 mL 5 mol/L 的醋酸钾混匀，冰浴20 min后在 10 000 r/min 条件下离心10 min；加入等体积氯仿-异戊醇（24 ∶1），颠倒混匀后于12 000 r/min离心10 min；取上清液，加入0.7倍体积的预冷冰异丙醇，轻轻颠倒混匀后于-20 ℃放置20 min；12 000 r/min、常温离心10 min，收集沉淀，用70%乙醇洗2次；风干DNA并溶于60 μLddH2O中，于4 ℃保存备用。

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1.3.3高盐低pH值法加入预热的1 mL提取缓冲液（含0.1 mol/L NaAc、0.05 mol/L EDTA、0.5 mol/L NaCl、25% PVP、3% SDS、1%β-巯基乙醇），于65 ℃水浴30 min；取出静置至室温后于10 000 r/min离心10 min；取上清液，加入 2/3 体积的25 mol/L KAC（pH值4.8），冰上放置30 min后于10 000 r/min离心10 min；取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇（24 ∶1），反复颠倒混匀后于10 000 r/min离心10 min；取上清液，加入0.6倍体积的-20 ℃异丙醇，轻轻混匀后置于-20 ℃沉淀20 min；8 000 r/min离心10 min，所得沉淀用70%乙醇洗2次；DNA风干后溶于60 μL ddH2O中，置于 4 ℃ 冰箱备用。

1.4DNA纯度、浓度及得率检测

用NanoDrop/ND1000核酸蛋白质分析仪分别测定DNA样品浓度、D260 nm/D280 nm值（≈1.8表示为纯DNA；>1.9表示有RNA污染；<1.6表明样品中存在蛋白质或酚污染）。同时计算产率，即DNA得率，公式为：DNA得率（μg/g）=DNA量（μg）/取材量（g）。各取3 μLDNA溶液，进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并拍照。

1.5基因组DNA的PCR检测

参考Jarvis等的研究结果[17]，设计了SSR引物KCAA003、KAAT009。引物KCAA003的上游序列（5′→3′）为ACCTTTCGGCTGCTCAGATA，下游序列（5′→3′）为TGCTGATGTTGTTGCAGATG；引物KAAT009的上游序列（5′→3′）为AGTTGCCAACATGCAGAGC，下游序列（5′→3′）为CGACGACGCAAGACATTAGA。PCR反应体系：1.5 μL 10×PCR buffer、1 μL模板DNA、0.3μL SSR引物、0.25 μL dNTPs（10 mmol/L）、0.15 μL Taq酶、11.5 μL ddH2O。扩增程序为：94 ℃预变性5 min：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物用15%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用凝胶成像系统拍照。

1.6SSR分子检测

取1 μL PCR扩增产物用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，恒功率80 W，检测时间30 min。电泳结束后，将胶浸入固定液（10%乙醇、0.05%冰醋酸）中，在摇床上固定10 min，用蒸馏水冲洗2遍；然后用0.2% AgNO3染色 20 min，再用蒸馏水漂洗1～2次（不得超过30 s）；最后用显色液（含30 g/L NaOH，13.6 mL/L甲醛）显色至条带清晰，再用蒸馏水洗脱3次停显。

1.7SSCP分子检测

将PCR扩增产物与变性上样液（含98%去离子甲酰胺、pH值为8.0的10 mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰、0.025%溴酚蓝）按1 ∶5的比例加入0.5 mL微量离心管中，混匀。将样品在98 ℃变性10 min后立即取出，置于冰浴中骤冷 10 min。取约5 μL变性样品上样，用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶于4 ℃恒温电泳（恒功率80 W，12 h）检测。然后进行固定、银染和显影，方法步骤同上。

2结果与分析

2.1DNA质量的凝胶电泳检测

用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量是一种常用的检测手段[18]。由图1可以看出：用1%琼脂糖凝胶电泳检测不同方法提取的藜麦基因组DNA的结果表明，不同组织中提取的DNA都能扩增出明显的条带，但叶片中的DNA浓度明显高于茎和根。3种方法所提取的DNA样品的浓度、纯度及得率见表1。综合分析试验可知：改良的CTAB法提取的DNA得率最高，叶片、茎、根中的DNA得率分别为824.5、209.3、254.1 μg/g；改良的SDS法提取的DNA得率次之，分别为4960、207.2、231.4 μg/g；而高盐低pH值法提取的DNA得率最低，分别为322.6、112.0、156.2 μg/g。3种方法提取的叶片DNA得率均为茎、根部的2倍以上，凝胶检测结果与分光光度计的检测结果一致。由表1还可以看出：CTAB法提取的DNA D260 nm/D280 nm介于1.7～1.8之间，说明蛋白、酚类、多糖等杂质和RNA都去除得较干净；SDS法提取的DNA D260 nm/D280 nm值表明，该法提取的基因组DNA质量较好，基本无RNA和蛋白混杂；而高盐低pH值法的D260 nm/D280 nm值表明，该法提取的叶片DNA可能有RNA污染或有降解。

2.2分子检测

2.2.2SSCP分析SSCP（single strand conformation polymorphism，单链构象多态性）是以构象为基础的检测基因组中单核苷酸变异（SNP）的一种方法，具有快速、简便、灵敏等特点，可将双链水平无法检测的DNA微小差异在单链水平上检测出来[19]。由图4可见，通过显影，不同方法提取的不同组织DNA的PCR产物在变性后均能在12%凝胶中跑出清晰条带。

3结论与讨论

植物基因组DNA的提取方法目前有CTAB、SDS、高盐低pH值法、尿素法、柠檬酸钠法等[20]。建立简单快速且能获得高质量DNA的提取方法，对利用SSR和SSCP等分子标记研究和揭示藜麦种质资源遗传多样性和遗传特征显得尤为重要。藜麦含有多糖、多酚及其他次生代谢产物[21-23]，这些次生物质在DNA提取过程中会与核酸形成复合物，影响DNA的质量和产量。本试验结果表明，改良的CTAB、SDS和高盐低pH值法提取的藜麦不同组织部位的DNA均能满足 PCR-SSR 和SSCP等后继的分子生物学分析。但不同方法提取叶片DNA的产率显著高于根和茎部，因此宜采用叶片进行藜麦基因组DNA的提取。

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本研究表明，改良的CTAB法提取的基因組DNA产率最高，且较有效地去除了蛋白质和多糖物质，能够获得较纯的DNA，这与在其他植物中DNA提取方法比较的研究结果一致[20，24-26]。本试验在改良的CTAB和高盐低pH值提取液中加了PVP-40、PVP（聚乙烯吡咯烷酮），它们是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，因而能够有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它们可以与多糖结合，因此通过离心可以有效去除多糖，从而提高DNA的纯度[27]，然而后者提取的DNA产率相比较低。

本研究所用的3种方法都用电钻粉碎取代了手工研磨，节约了劳动力和成本。相比而言，改良的CTAB法叶片的DNA得率高，而提取时间比其他2种方法少20～30min左右，可大量节省科研工作时间，对将来开展藜麦图谱构建、QTL分析等有很好的辅助作用。本研究提取的对象是藜麦幼嫩组织，下一步将对其老叶的DNA提取方法作改进研究。

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番茄基因组DNA提取探讨 篇7

番茄是较早构建遗传连锁图谱的作物,目前基于番茄培育种和各种野生种杂交构建了许多分子图谱,因此获取高质量的DNA是番茄分子生物学和基因工程研究的前提。现对CTAB及SDS 2种方法进行比较,旨在为番茄基因组DNA的提取方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物材料为番茄幼嫩叶片。供试药品有:CTAB提取缓冲液:2%CTAB(W/V),100mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol·L-1EDTA(pH 8.0),1.4mol·L-1 NaCl,2%(V/V)α-巯基乙醇。高压灭菌后备用。

SDS提取缓冲液:2%SDS(W/V),100mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol·L-1EDTA(pH8.0),150mmol·L-1 NaCl,20%SDS溶液;5mol·L-1 KAC;3mol·L-1 NaAC,2%(V/V)α-巯基乙醇。高压灭菌后备用。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法提取番茄基因组DNA

取番茄幼嫩叶片0.1g,装于1.5 mL离心管中液氮研磨,每管加入700μL65℃预热的CTAB提取缓冲液,混合均匀,65℃水浴锅中保温30min;水浴锅中取出置于冰上冷却,加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),上下颠倒混匀,4℃,12 000r·min-1离心10min;取上清液加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1),轻轻混匀,4℃,12 000r·min-1离心10 min,取上清液加入1/10体积3 mmol·L-1 NaAc(pH 5.2)和等体积异丙醇,轻轻混匀,-20℃放置20 min,4℃,12 000r·min-1离心10min,弃掉液体;用70%乙醇冲洗,4℃,7 500r·min-1离心5min,弃掉液体,真空抽干,加入200μL灭菌纯水溶解。

加入2μL(10 mg·mL-1)RNaseA酶液,在37℃条件下保温30min,然后氯仿-异戊醇(24∶1)抽提1次,离心、沉淀、干燥,最后将DNA溶解在30μL灭菌纯水,于-20℃保存备用[3,4]。

1.2.2 SDS法提取番茄基因组DNA

取番茄幼嫩叶片0.1g,装于1.5mL离心管中液氮研磨,每管加入700μL65℃预热的SDS提取缓冲液,70μL的20%SDS溶液,混合均匀,65℃水浴锅中保温30min;水浴锅中取出置于冰上冷却,取上清液加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),轻轻混匀,4℃,12 000r·min-1离心10min;取上清加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1),4℃,12 000r·min-1离心10 min;取上清液加入1/10体积的NaAC和等体积异丙醇,-20℃放置10min;4℃,12 000r·min-1离心10min,弃掉液体;用70%乙醇冲洗,4℃,7 500r·min-1离心5min,弃掉液体,真空抽干,加入200μL灭菌纯水溶解[3,4]。去RNA方法同上。

1.2.3 DNA检测方法

DNA浓度检测:以无菌水作为空白对照,测定各样品OD260及OD260/280值,计算样品中的DNA浓度并判断DNA的纯度。DNA电泳检测:0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性及RNA污染程度。PCR检测:PCR反应体系:25μL反应体系,10×Taq Buffer2.5μL,Primer 1(10pmol·μL-1)1μL,Primer2(10pmol·μL-1)1μL,dNTP 2μL,Taq polymarase(5 U·μL-1)0.2μL,Template DNA 1μL;PCR反应条件:94℃预变性5min,30个下列循环:94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸1min;72℃延伸7min,4℃保存。

2 结果与分析

2.1 DNA样品紫外分光光度计分析

DNA的浓度及纯度见表1。可知,由OD260/280值说明2种方法提取的DNA纯度较高,且提取量差异不显著。

2.2 DNA样品电泳分析

DNA在0.8%的琼脂糖凝胶电泳上检测结果见图1和图2。可知,由CTAB和SDS 2种方法提取的番茄基因组DNA都有清晰的主带,无降解,无RNA污染,DNA质量较好。

2.3 PCR检测

将提取的番茄基因组DNA用于PCR分析,由图3可见,PCR扩增条带清晰,说明所提取的DNA可以满足PCR要求。

3 结论

番茄成熟及衰老叶片中含有较多的多酚类物质,叶片中糖含量较高,对提取的DNA质量有影响,经试验证明通过在提取液中加入2%聚乙烯比咯烷酮有助于抑制多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性。但选择材料时应尽量选取幼嫩叶片,因其含有较完整的DNA,从而提高DNA的质量。在加入酚-氯仿-异戊醇抽提液时,注意抽提液体积,若抽提液体积过小,抽提离心后在固体层下方会产生一个空隙,在取离心管的过程中造成震荡使上层提取缓冲液漏下,造成DNA浪费。DNA沉淀时可加入2倍体积的乙醇或等体积的异丙醇,异丙醇能与自由水紧密结合,结合了溶解DNA的水分子使DNA沉淀,可常温沉淀离心,但沉淀容易将盐成分一起沉淀不易除去;无水乙醇易于从DNA沉淀中除去,需-20℃放置10～20min。因此可根据实际情况进行选择。

采用CTAB及SDS 2种方法对番茄幼嫩叶片DNA进行提取,试验结果说明2种方法均能得到完整且纯度较高的DNA,所得DNA用于PCR反应可得到清晰的扩增条带。

摘要：以番茄幼嫩叶片为材料,通过CTAB和SDS 2种方法对番茄基因组DNA提取进行了比较研究。结果表明:2种方法均能提取完整且纯度较高的DNA,所得DNA用于PCR反应可得到清晰的扩增条带。

关键词：番茄,DNA,提取

参考文献

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人外周血DNA提取方法比较 篇8

1 实验方法及注意事项

1.1 传统方法

提取DNA传统方法按照《分子克隆实验指南》进行[8], 该法是Stafford和Blin根据Cross-Bellard等方法改良而成。

1.2 改良方法

改良方法所用DNA小量抽提试剂盒 (纯化柱式) 购自碧云天生物技术研究所。

1.2.1 全血的运输及保存

提取DNA的全血需用EDTA抗凝, 用量为2mL或以上, 运输过程中应避免采血管反复颠倒和 (或) 强力震荡等, 以免发生溶血;取回的全血4℃保存待用, 一般存放时间不宜超过24h, 以免影响DNA的提取;如需长期保存, 可将其保存于-80℃低温冰箱中 (经低温保存后的全血提取DNA需要较长的操作时间) ;全血在保存过程中应避免反复冻融。

1.2.2 实验前期准备

DNA提取过程中, 操作人员需穿戴实验服、口罩和手套, 实验所需移液器、枪头、EP管和Eppendorf管等实验耗材需经高压灭菌消毒, 并提前预热水浴锅和恒温箱。

1.2.3 血清的分离及注意事项

实验开始前, 首先要详细记录每个采血管对应患者的基本信息, 将标记好的采血管置于离心机中, 离心条件:4℃、1000rpm、5min;离心后抽提上层血清, 置于-80℃低温冰箱留存待用;血清分离时, 操作人员动作要缓慢, 操作时尽可能抽净上层血清, 保留中间层的白细胞和下层的红细胞;初学者操作时不可过分追求吸净上层血清, 以免将中间的白细胞层吸走而影响DNA提取。

1.2.4 红细胞的裂解及注意事项

本文以采取2mL全血提取DNA为例, 向吸去上层血清的采血管中加入红细胞裂解液5mL, 用一次性吸管或移液器反复吹打, 8min后将其置于离心机中, 条件为:4℃、1000rpm、5min。可重复一次。离心后弃掉上清液, 加1mL红细胞裂解液, 用一次性吸管吹匀, 转入已标记好的1.5mL Ep管中, 裂解5min, 离心 (条件同上) , 弃上清液;以上步骤操作时间一般不宜超过15min (离心时间不计算在内) 。

1.2.5 DNA的提取及注意事项

向Ep管中加入PBS缓冲溶液1mL, 用移液器或一次性吸管将沉淀打散至絮状, 离心 (条件同上) , 离心后弃上清液, 加入200μL PBS缓冲溶液, 涡旋摇散沉淀至絮状, 加20μL蛋白酶K, 立即涡旋混匀, 然后加裂解液B 200μL, 立即涡旋混匀;此步骤应注意不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合, 加样过程中要注意防止样品及试剂的污染。

后将Ep管置于70℃恒温箱中10min, 恒温后加入200μL无水乙醇, 立即混匀;将Ep管中液体用移液枪转入标记好的DNA纯化柱中, 此过程必须将沉淀全部转移到DNA纯化柱中, 否则会严重影响DNA提取效果。接下来将DNA纯化柱置于废液收集管上, 离心, 条件:17℃、8000rpm、1min。离心后弃废液收集管内液体, 并回收废液收集管;后向纯化柱内加入500μL洗涤液Ⅰ, 离心 (条件同上) , 离心后弃废液收集管内液体, 回收废液收集管。加入600μL洗涤液Ⅱ, 离心, 条件:17℃、12000rpm、1min;离心后弃废液收集管内液体, 回收废液收集管;空离一次 (条件同上) , 离心后弃废液收集管。

在DNA回收过程中我们采用两步法, 充分回收DNA, 将DNA纯化柱转入标记好的第一组Ep管中, 加60μL水, 置于水浴中, 条件为55℃、3min, 水浴后离心 (条件同上) , 离心后将Ep管放入-80℃低温冰箱保存待用;将DNA纯化柱转入标记好的第二组Ep管中, 加60μL水, 置于水浴箱中, 条件为55℃、3min, 水浴后离心 (条件同上) , 离心后将Ep管放入-20℃冰箱保存待用;实验器材使用后均需酒精擦拭消毒。

1.2.6 实验操作的注意事项

在实验操作过程中, 使用移液器吸取试剂时不要把移液器枪头伸入液体过多, 以刚刚没入液面为宜, 保证能吸到液体即可, 避免造成浪费。PCR实验精度较高, 加入试剂量多为微升计, 如移液器枪头伸入试剂过多, 粘附于枪头的试剂就会较多, 会导致实验试剂的极大浪费。

2 DNA样本的质量

为了获得更多的DNA样品, 实验过程中采用二次洗脱法以增加DNA产量, 第二次洗脱可以获得第一次洗脱时50%~80%的DNA量, 这对于PCR实验至关重要;DNA样本的纯度和含量将影响电泳后条带的明亮程度, 经二次洗脱得到的DNA样本, 电泳后条带亮度略微发淡, 与首次洗脱得到的DNA样本比较, 条带亮度有明显的差别, 所以DNA浓度越高, 扩增产物量越大, 电泳后条带越亮;在我们的研究中, 二次洗脱DNA样本主要用于验证DNA提取质量以及实验初期条件的摸索。

2.1 琼脂糖电泳检测

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的两种DNA纯度, 紫外灯照射显示, 用改良法提取的DNA电泳带齐整, 荧光显示较强, 识别度高;传统的酚、氯提取方法提取的DNA电泳带欠齐整, 有拖尾现象, 荧光显示较弱。

2.2 PCR扩增效果

在模板浓度、反应体系、反应条件及引物相同的条件下, 对改良及传统提取的DNA为模板分别进行PCR扩增, 结果显示以改良法提取的DNA为模板, PCR的扩增效果明显好于传统的酚、氯DNA提取的方法, 而且这种差距伴随扩增产物片段的增加更加明显。

3 DNA样本的存储

根据实验需要提取的DNA样品应作分装处理, 近期实验用少量DNA样品冻存于-20℃冰箱中, 其余样品冻存于-80℃低温冰箱;DNA样品切忌反复冻融, 若DNA样品长期存放于-20℃环境或实验过程中反复多次冻融, 则易发生降解, 从而造成PCR扩增后产物在电泳时产生涂抹条带或者没有条带, 或阳性检出率降低等结果。

4 结语

DNA提取技术是分子生物学、遗传学和分子流行病学等实验研究中不可或缺的一种实验技术, 在基因相关研究领域中具有重要地位, 因此, 熟练掌握DNA提取实验的基本原理、实验操作方法、影响因素和注意事项等是非常重要的。

从上述我们对改良及传统抽提DNA方法的对比分析可以看出, 传统提取DNA法不仅操作费时费力, 样本需求量大, 而且获得的DNA纯度、总量以及PCR扩增效果等都存在欠缺, 所以有必要进行改进, 我们采用的DNA小量抽提试剂盒法操作简单、省时省力, 同时结果更为稳定, 是目前提取DNA较好的方法。

参考文献

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动物组织中DNA提取方法的优化 篇9

生物化学实验中脱氧核糖核酸的提取是许多高校生物学科学生必做的实验。其主要的方法一般采用苯酚法、氯仿法和去污剂法[1],或者是这几种方法的组合,其主要思路是两条:第一,利用核蛋白在不同浓度的盐溶液中溶解度的不同,将RNA核蛋白与DNA核蛋白分开;第二,利用有机溶剂,并辅以其他物理作用使蛋白质变性,形成凝胶,与核酸分开。此外,在整个提取过程中,为了避免DNA被降解破坏,要防止过酸和过碱等化学因素、高温和机械力等物理因素以及核酸降解酶的作用。

自1996年以来,我校一直采用北京大学李建武等编著的《生物化学实验原理和方法》[1]一书,其中的“猪脾脏DNA提取与二苯胺测定法”是必做实验。尽管该DNA提取方法较为成熟,但材料用量大,来源相对困难,还需冰箱内过夜,提取时间太长,而且提取过程稍有不慎很容易失败,所以笔者结合李如亮主编的《生物化学实验》[2]和陈钧辉主编的《生物化学实验》[3],从选择合适的提取材料入手,比较了几种DNA提取方法的优缺点,优化组合成了一种操作简便、省时、无需昂贵药品的新方法。

一、优化后的实验流程

1. 取新鲜的动物组织(一般为肝脏或脾脏)5克,剔去结缔组织,用0.15 mol/L NaCl-0.015mol/L柠檬酸钠溶液洗去血水,剪碎并研磨。

2. 用40mL0.15 mol/L NaCl-0.015mol/L柠檬酸钠溶液将肝糜转移至离心管,3000r.p.m离心10min。

3. 弃去上清夜,收集沉淀,重复第②步,再弃去上清液(重复洗涤可使RNA核蛋白与DNA核蛋白尽可能分开,又可以脱去血色素,使产品洁净)。

4. 沉淀物悬于25mL pH 8.0的0.15mol/L NaCl-0.1mol/L EDTA中。

5. 缓慢滴加10%SDS溶液3mL,边加边搅。

6.60℃恒温水浴保温10 min,不断搅动,溶液变为粘稠并略有透明。

7. 取出,冷却,加5mol/L NaCl 8mL,使Na Cl终浓度达到约1 mol/L。

8. 加入40mL氯仿-异丙醇(24:1)混合液,在室温下激烈摇动20min。

9.3000r.p.m离心5min.离心后的混合物分为三层。

10. 吸取上清夜,放到30m L95%的乙醇中,用玻璃棒轻轻缠出DNA丝状物。

为了得到较纯净的DNA,根据需要可重复第⑦~⑩步骤。

以上操作流程是一种氯仿法、去污剂法与加热法相结合的方法。

二、实验材料的选择

分别选择猪脾脏、猪肝脏、兔肝脏和大白鼠肝脏各5克为实验材料,根据以上流程进行平行操作,提取得到DNA,对实验结果进行比较,结果如表1。

三、提取方法的比较

1. 核酸降解酶抑制剂的选用

在DNA提取过程中为了防止组织中广泛存在的核酸降解酶的作用,往往在处理材料时就加入酶抑制剂,常用的是柠檬酸盐和乙二胺四乙酸盐。李建武等编著的《生物化学实验原理和方法》一书中的“猪脾脏DNA提取与二苯胺测定法”只用0.05 mol/L的柠檬酸钠作为核酸降解酶抑制剂,我们发现实验结果不稳定,如果将0.015 mol/L柠檬酸钠和0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠在以上流程的第①~④步中依次使用,可得到较好的实验结果,如表2。

2. 蛋白质变性剂的选用

为了使蛋白质和DNA得到有效的分离,常用的蛋白质变性剂是苯酚、氯仿、去污剂[4~7],或者是它们的组合。除了以上优化后的流程中用氯仿、去污剂与加热相结合的方法外,这里再列出以下几种常用的提取流程,并进行比较:

(1)苯酚法:

①取新鲜的动物组织5克,剔去结缔组织,用0.15mol/L NaCl-0.015 mol/L柠檬酸钠溶液洗去血水,剪碎并研磨。

②用40m L0.15 mol/L NaCl-0.015mol/L柠檬酸钠溶液将肝糜转移至离心管,3000r.p.m离心10min。

③弃去上清夜,收集沉淀,重复第②步,再弃去上清液。

④沉淀物悬于25mL pH 8.0的0.15mol/L NaCl-0.1mol/L EDTA中。

⑤加入5mol/L NaCl 8mL,使NaCl终浓度达到约1 mol/L。

⑥加入90%苯酚40mL,在室温下剧烈震荡20min。

⑦3000r.p.m离心5min.离心后的混合物分为三层。

⑧吸取上清夜,放到30mL 95%的乙醇中,用玻璃棒轻轻缠出DNA丝状物。

(2)氯仿法:

在氯仿、去污剂与加热相结合的优化流程中减少了第⑤,⑥步。

(3)氯仿与去污剂相结合法:

在氯仿、去污剂与加热相结合的优化流程中减少了第⑥步。

以猪肝脏为实验材料,采用以上列出的四种方法,分别提取得到DNA,真空干燥后称重,结果见表3。

再分别将DNA产品配置成一定浓度的溶液,利用二苯胺反应对DNA沉淀物含量进行定量测定,对以上四种方法进行了比对,结果如表4。

四、讨论与结论

1. 实验材料的确定

由表1得出:①取5克组织足以提取到理想的DNA的量。所以每组学生称取5克材料即可,这样可以减少研磨时间;②实验的几种材料中DNA含量比较接近。考虑到猪肝脏是一种价格便宜、更容易获得的材料,所以我们在教学中选用猪肝脏作为实验材料。

2. 实验流程的确定

由表2看出,0.015 mol/L柠檬酸钠和0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠依次使用比只用0.05 mol/L柠檬酸钠能更好地抑制核酸降解酶的活性,实验结果也就更好。

表3、表4中的数据与提取过程中有机溶剂沉淀蛋白质的次数有关,反复沉淀的次数多了,DNA产品损失就大;沉淀的次数少了,蛋白质分离就不彻底。为了平行操作,每种方法都反复两次。

由表3、表4显示,采用氯仿法提取得到的DNA产品最多,但是其中的DNA含量最低,说明蛋白质没有脱干净;氯仿、去污剂和加热相结合法中尽管多了去污剂和加热沉淀蛋白质这两步,其提取得到的DNA产品仍然比苯酚法多,且DNA的含量远远高于后者;在氯仿和去污剂法相结合的方法中,是否增加加热这一步对DNA产品的多少影响不大,但是增加了加热这一步后,DNA的含量明显提高了,说明60℃加热使蛋白质变性,而核酸基本没有受损。

综上所述,将0.015 mol/L柠檬酸钠和0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠依次作为核酸降解酶的抑制剂,用氯仿、去污剂和加热相结合沉淀蛋白质的流程是合理的,实验结果是理想的。

摘要：为了提高生物化学实验的教学效率,对脱氧核糖核酸几种提取方法中的几个关键步骤作了定性定量分析,对整个流程加以优化,简化了操作步骤,缩短了实验时间,经过几年的实践,已成功运用于该校本科生生物化学实验教学环节,取得了良好的教学效果。

关键词：动物组织,DNA,蛋白质,变性剂,提取

参考文献

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[2]李如亮.生物化学实验[M].湖北:武汉大学出版社,1998.

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[6]张楚富.生物化学原理[M].北京:高等教育出版社,2003.

DNA快速提取 篇10

1 材料和方法

1.1 试剂和药品

液氮;2×CTAB提取缓冲液(表1):5 mol/L Na Cl,0.5 mol/L EDTA(p H值8.0),1 mol/L Tris-HCl(p H值8.0),β-巯基乙醇;氯仿/异戊醇(体积比为24∶1);无水乙醇;70%乙醇;双蒸水(dd H2O)。药品均为分析纯。

注:2×CTAB提取缓站液用H2O定容,最终总体积为100 m L,最终各试剂在此缓冲液中的浓度如下:CTAB,2%;5 mol/L Na Cl,1.4 mol/L;0.5 mol/L EDTA,20 mmol/L;1 mol/L Tris-HCl,100 mmol/L;β-巯基乙醇,2%。

1.2 仪器设备

低温离心机、恒温水浴锅、研钵、微量加样器等。

1.3 材料来源

以鸢尾(Iris tectorum)为原材料,其采于西北大学校园。

1.4 操作步骤

1.4.1 准备工作。

具体如下:(1)将水浴锅温度升至65℃;(2)将CTAB提取缓冲液置于水浴锅中预热;(3)在-20℃冰箱中预冷无水乙醇;(4)在4℃冰箱中预冷70%乙醇。

1.4.2 操作要点。

具体如下:(1)称取0.2 g幼嫩叶片置于灭菌干燥钵中,加入约30 m L液氮,轻轻捣碎叶片。等液氮即将挥发完时,快速研磨至粉状(越细越好),把粉末转移至有标号的2 m L Eppendorf管中。(2)向管中加入800μL 65℃预热的CTAB提取液。(3)将Eppendorf管置于65℃水浴锅中,保温50 min,每隔5 min用手轻微颠倒混匀1次。(4)取出样品管待冷至室温后,加入700μL氯仿/异戊醇(24∶1),来回颠倒混匀10 min,动作应轻柔。11 000 r/min室温离心6 min分层。(5)用剪去端部约0.8 cm的1 m L吸头将上清液转移至另一2 m L Eppendorf管中,重复步骤(4)。(6)用剪去端部的1 m L吸头转移上清液500~600μL至一1.5 m L Eppendorf管中。(7)向管中加入2倍体积的预冷无水乙醇约1 000μL,轻轻上下摇动样品管,DNA将从溶液中析出。如样品中DNA含量较少,会观察到管中含有白色悬浮的DNA颗粒;如样品中DNA含量较高,则可观察到白色絮丝状的DNA悬浮于溶液中。(8)将样品管置于低温离心机中12 000 r/min离心10 min,倒上清液,用预冷的70%乙醇400μL清洗DNA沉淀,室温放置5 min。(9)倒上清液,再加70%乙醇400μL。静置5 min后,在室温下干燥。(10)干燥后加入100μL双蒸水或0.1×TE缓冲液,放在4℃冰箱中保存(-20℃长期保存)。

2 结果与分析

2.1 用紫外分光光度计检测DNA含量

分别采用李宇伟等[1]、杜欣[2]、笔者的CTAB法提取DNA,260/280 OD比值分别在3.34~4.71、2.58~3.92、2.15~2.38。260/230 OD比值分别为1.11~1.64、1.30~1.42、1.60~1.64。表明笔者的方法所提DNA中RNA、蛋白等杂质较少。一般来讲,RNA不影响DNA的特性分析,在提取获得的DNA样品管中加入2μL RNase,即可除去RNA。

2.2 用改进方法提取DNA的电泳图样

鸢尾DNA提取液电泳结果如图1所示,7~9在高分子量区的DNA电泳条带最清晰,最整齐均匀,质量较好。

注:M为分子量标准;1~3为李宇伟等[1]的CTAB法提取DNA;4~6为杜欣的CTAB法提取DNA;7~9为改进后的CTAB法提取DNA。

2.3 以改进方法提取的DNA为模板进行PCR扩增

由图2可以看出,该法获得的鸢尾DNA可以完全满足PCR扩增的要求。

3 讨论

鸢尾叶片含多酚、蛋白质、脂类、多糖和色素等不利于DNA提取的物质,利用常规CTAB法难以获得高质量的DNA。李宇伟等[1]的CTAB法在65℃水浴时间是30~60 min,杜欣的CTAB法水浴时间是30 min。但通过试验发现,水浴30 min并不能完全破碎细胞膜和释放DNA。适当延长水浴时间如增至50 min,可使细胞膜裂解较完全,从而释放出更多DNA。李宇伟等[1]采用酚、氯仿多次抽提来除去蛋白质、色素等杂质,但试验表明抽提2次即可,因为抽提次数的重复并不一定改善DNA的纯度,有时反而增加负面作用[5]。杜欣采用氯仿/异戊醇对样品抽提的时间为5 min,而试验发现适当延长氯仿/异戊醇和提取液的接触时间,可减少蛋白质等杂质的干扰,该结果也验证了肖婷婷等[3]的观点。肖婷婷等[3]用CTAB法提取鸢尾DNA时加入异丙醇后置-20℃过夜,李宇伟等[1]加入无水乙醇后在-20℃静置2 h,而试验表明这一步骤并不是必须的,通过上下摇动样品管,使DNA从溶液中析出,也可以达到相同的效果。该文论述的提取方法对前人的CTAB法进行了优化,具有简便、快速、经济、纯度高、蛋白质和色素污染少等优点,可用于RAPD、ISSR、SSR等以PCR扩增为基础的试验需要。

摘要：鸢尾属植物中酚类、多糖含量较高,DNA提取较为困难。在前人工作基础上,改进了提取植物DNA的CTAB方法,通过延长水浴时间、氯仿/异戊醇(24∶1)2次抽提、适当延长氯仿/异戊醇与提取液接触时间等一系列改进,简化了提取步骤,大大缩短了提取时间。所提取的DNA纯度高,可满足以PCR扩增为基础的试验需要。

关键词：鸢尾属,DNA提取,改良CTAB法,PCR

参考文献

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