凯氏定氮法测定蛋白质含量的改进

2023-01-10

蛋白质是复杂的含氮有机化合物, 主要是由各种氨基酸构成, 它是谷类、食品、饲料以及各种农副产品的重要成分, 也是重要的营养成分[1~2]。现在国际上通用1883年发明的凯氏定氮法[3]测定蛋白质中的含氮量, 以此来推算出蛋白质的含量[4]。由于含氮量包含非蛋白质组成的其他有机态和无机态氮, 所以测得的蛋白质含量为粗蛋白含量。实验中发现, 仪器有一些不足, 如尾气排入环境中造成污染;氨气吸收瓶处使用的斜口玻璃管容易倒吸等, 实验结果重现性较差。为此, 我们用碱液吸收SO2, 防止了环境污染;用倒扣的漏斗代替斜口玻璃管, 阻止了吸收液倒吸现象的发生。从而提高了试验结果的准确度。

1 实验部分

1.1 仪器

凯氏定氮仪 (KDN—08B, 上海新嘉电子有限公司) , 消化炉, 分析天平 (AG135, METTLERTOLEDO) , 容量瓶, 移液管, 酸式滴定管, 烧杯。

1.2 试剂药品

硫酸铜, 硫酸钾, 无水碳酸钠, 硫酸铵, 氢氧化钠, 硼酸, 浓硫酸, 溴甲酚绿, 甲基红所用试剂均为分析纯;双蒸水;粗蛋白溶液 (试验提取物) 。

2 实验步骤

2.1 溶液的配制

准确称量10.60g无水碳酸钠, 用双蒸水定容至1000m L;准确称量1.140g硫酸铵, 用双蒸水定容至1000m L;准确称量0.1000g甲基红和0.5000g溴甲酚绿, 分别用乙醇定容至100m L;配制2%硼酸溶液1000m L;配制40%Na OH溶液1000m L;配制0.1mol·L-1盐酸溶液1000m L, 用已配制的无水碳酸钠标定其浓度。

2.2 消化

2.2.1 取样

取10.00m L待消化液于消化管中, 硫酸铜∶硫酸钾1∶15为催化剂, 然后取10.00m L浓硫酸加入消化管中, 摇匀。

2.2.2 消化

将消化管放入消化炉内, 加上密封圈和排污管, 将排污管的一端用橡胶管与吸收瓶 (内为加入酚酞的稀氢氧化钠溶液) 相连, 吸收瓶的另一出口与真空泵相连。其装置见图1。

接通电源, 开始消化。在有蒸气的时候, 打开真空泵, 充分消化即可。

2.3 蒸馏

2.3.1 仪器准备

分别用橡皮管与各个进出水接口连接。出口水、排口水用橡胶管连接后置入水池内, 冷却水接口与自来水连接, H2O、Na OH输入接口与橡胶管连接后分别置入蒸馏水、氢氧化钠盛器桶内, 并关闭排水开关阀门。

2.3.2 蒸馏

(1) 用倒扣漏斗作接收管。

(1) 打开电源开关, H2O开关, 蒸馏水自动进入发生炉内, 达一定液位高度, 液位控制器自动停止加水, 进入电加热状态。

(2) 在500m L的烧杯中加入2%硼酸50m L和2~3滴混合指示剂, 将此烧杯套在接收管处的倒扣的漏斗上, 并让漏斗口微浸没在硼酸溶液中。

(3) 取消化冷却后的消化试管置入适量双蒸水后, 使消化管固定在蒸馏消化管托盘架上, 开启Na OH开关, 加入50m L氢氧化钠溶液。

(4) 蒸汽发生炉内蒸馏水经1~2分钟加热后, 沸腾并产生蒸汽进入消化管内进行蒸馏, 待接受烧杯中液面达到150m L时, 将接受瓶取下滴定, 用双蒸水冲洗出气口。

(5) 重复上述步骤, 平行试验5次。

(2) 用斜口玻璃管作接收管。

将仪器中的接收管改为斜口玻璃管, 按 (1) 实验步骤, 平行试验5次。

2.4 滴定

用浓度为0.1014 mol·L-1的盐酸标准溶液, 滴定 (1) 烧杯内的溶液, 待溶液颜色由蓝绿色变为淡紫色时为止, 记下消耗的盐酸体积, 按照以下公式计算:

粗蛋白质 (g) = (V-V0) ×N×0.014×P

V为实验用去的盐酸溶液体积, m L;

V0为空白试验用去的盐酸溶液体积, m L;

N为盐酸溶液的物质的量浓度;

0.014为每毫升盐酸的物质的量;

P为蛋白质换算系数 (6.25) 。

(空白测定:不加样品作空白测定)

3 实验结果与讨论

3.1 氮的回收率试验

准确称取90℃烘至恒重的优级纯硫酸铵配制成标准溶液, 取10.00m L标准硫酸铵溶液进行消化、蒸馏和滴定, 进行氮的回收率实验, 分别利用漏斗和斜口玻璃管作吸收管测定。从中可知, 利用漏斗作吸收管时平均回收率为99.70%, 而利用斜口玻璃管作吸收管时的平均回收率仅为96.95%。操作过程中发现, 利用斜口玻璃管作吸收管时凯氏定氮仪不能连续操作使用, 若连续操作不仅容易倒吸使测定的数值不准确, 而且影响后续样品的测定。

3.2 海带多糖样品中氮的测定

准确量取10.00m L海带多糖的粗提液进行消化, 蒸馏和滴定, 分别用漏斗和斜口玻璃管作吸收管测定。利用漏斗作吸收管时相对标准偏差为0.6%, 而利用斜口玻璃管作吸收管时的相对标准偏差达到4.5%。

可见, 用漏斗代替斜口玻璃管, 无论测定标准样品 (NH4) 2SO4还是测定海带多糖提取液中的含氮量, 相对标准偏差较小。

4 结语

近年来, 随着凯氏定氮仪加热设备的不断改进, 蒸汽的流量不断增加, 但是吸收设备一直没有进行相应的改进, 从而引入仪器误差。因此, 利用倒扣漏斗代替现有的的斜口玻璃管作接收管时试验重现性较好, 而且实验可以连续进行, 不会因为水的热膨胀而发生倒吸现象。而利用斜口玻璃管作接收管时, 试验重现性较差, 如果连续进行容易发生倒吸, 且连续做到第三个试验时仪器倒吸现象开始变得显著。如果继续试验, 则会因为水的热膨胀而进入消化管使实验无法进行。消化时在消化仪和真空泵之间增加碱液吸瓶吸收消化产生的SO2, 可减少实验室的空气污染。

摘要：对凯氏定氮法测定蛋白质含量进行改进。消化过程用碱液吸收瓶, 防止SO2排入大气中造成的环境污染;蒸馏过程用倒扣的漏斗防止倒吸。测定结果表明, 硫酸铵中氮的平均回收率由96.95%提高到99.70%, 相对标准偏差由4.5%下降到0.6%;海带多糖中粗蛋白含量测定的相对标准偏差由4.3%下降到0.6%。改进的方法提高了测定的准确性。

关键词：凯氏定氮法,蛋白质含量,改进