槟榔炭疽菌生物学论文

摘要：过氧化氢酶（Catalase）广泛存在于生物体内，主要功能是清除植物细胞内光呼吸、线粒体电子传递及脂肪β-氧化等过程中产生的H2O2，从而保护细胞免于过氧化氢酶的毒害。下面是小编整理的《槟榔炭疽菌生物学论文(精选3篇)》，仅供参考，希望能够帮助到大家。

槟榔炭疽菌生物学论文 篇1：

槟榔黄化病病原研究及防控中存在的问题及展望

Areca catechu L.是一种典型的热带作物，在中国和印度等主要种植国的经济地位是“小槟榔，大产业”。2015年，印度槟榔种植业产值达到300亿印度卢比（约合人民币28.8亿元，笔者注），成为边远地区3000万农民的主要经济来源。在中国，海南省槟榔种植面积和总产量均占全国的95%以上。2015年底槟榔产值已超越天然橡胶，跃居为海南第一大支柱产业。截至2018年，全省种植面积超过11万hm2，产值达287.3亿元，成为海南省中东部地区230多万农民（约占海南省常住总人口的1/4）的主要收入来源之一，在海南“精准扶贫”战略实施中起着重要作用。

槟榔黄化病（yellowleafdiseaseofarecanut，YLD）是一种由植原体引起的毁灭性病害。印度和中国分别于1914年和1981年首次发现YLD，其发生和流行已给两国槟榔产业造成了严重威胁。此外，该病在斯里兰卡也有少量发生。在中国，有部分学者对该病病原尚存在争议或质疑。与此同时，近年来椰心叶甲犅狉狅狀狋犻狊狆犪犾狅狀犵犻狊狊犻犿犪等重要病虫害频繁发生，加上除草剂的不当施用和气候等因素的影响，给病害田间诊断和防控带来一系列问题。槟榔黄化病现已成为严重威胁中国槟榔产业可持续发展的瓶颈，引起了海南省政府以及社会各界的普遍关注。为此，有必要对上述问题做出回应、分析和总结，以便更好地解决槟榔黄化病带来的问题。本文旨在进一步系統梳理病原及防控中存在的误区和问题，理清主次并提出新形势下的槟榔黄化病综合防控建议。
1 槟榔黄化病研究现状

1.1 槟榔黄化病的发生

最早的槟榔黄化病记录可追溯到20世纪初期。1914年，印度Kerala（喀拉拉邦）部分地区首次发现YLD。1949年Kerala中部几个地区种植的槟榔开始发病，至60年代，YLD 已在该邦普遍发生。1987年，YLD 在Karnataka（卡纳塔卡邦）的DakshinaKannada以及Sullia地区危害，3年后该病引起的产量损失达50%。目前，YLD 已给印度槟榔产业造成了严重损失。

在中国，YLD 自1981年在海南屯昌县乌坡镇（原海南药材场）首次出现以来，该病现已扩散至三亚、陵水、琼海等12个市县（本课题组未发表数据）。2008年，全省槟榔染病面积达0.2万hm²，至2017年超过1.33万hm²（本课题组未发表数据）。目前，万宁、屯昌等重病区发病率高达90%，造成减产70%～80%，严重者绝产。据不完全统计，该病给海南省造成的经济损失超过20亿元/年。

1.2 槟榔黄化病病原研究

印度学者对YLD病原或病因的深入研究始于20世纪中期，经过20多年的艰苦探索，至1971年才发现植原体与黄化病相关。印度学者的探索可分为两个阶段。第一阶段为探索期（1914年-1970年），从非生物因素角度分别排除了营养、水分、pH 等与黄化病的直接相关性;也从生物角度排除了螨虫、真菌、根部细菌以及线虫与黄化病的相关性。期间，尽管发现接种病毒可以引起槟榔以及指示植株豇豆、洋刀豆等发病并进行了组织病理学方面的研究，但并未发现病毒与黄化病相关的证据。第二阶段为进展期（1971年-迄今），Nayar通过组织培养从感病槟榔叶片中获得一种微生物，电镜观察后发现是一种类菌原体（mycoplasmalikeorganism，即植原体），此为首次发现植原体与黄化病相关。该发现开启了槟榔黄化病病原研究的大门。目前，印度学者已通过各种试验证据确认该国的YLD 病原为植原体。其常规证据包括电镜观察、迪纳氏染色、血清学、媒介昆虫甘蔗斑袖蜡蝉Proutista

moesta接种及菟丝子传病;分子检测证据包括巢式PCR、real-timePCR、环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）。目前，已发现印度槟榔黄化植原体存在3个组或亚组，分别为16SrⅪ-B 亚组、16SrⅠ-B组和16SrⅪⅤ组。由此可见，印度槟榔黄化植原体具有多样性。Ponnamma证实槟榔黄化病可通过甘蔗斑袖蜡蝉传播。由于媒介昆虫与植原体存在高度专化性，3个组或亚组的植原体是否均可通过甘蔗斑袖蜡蝉传播尚待进一步研究。

对于槟榔黄化病，我国科研人员同样也经历了较长时间的探索过程。1981年屯昌县槟榔出现该病后，俞浩等认为是一种生理性病害，系由于土壤缺钾引起。吴影梅提出寄生性线虫可能是槟榔黄化病直接病原或间接起到加速病害发生的作用，并对广东、海南2 省槟榔园中的线虫种类进行了调查，最近，依然有学者或公司认为线虫与槟榔黄化病的发生相关，但迄今为止国内尚未见二者具有相关性的报道。1995年，金开璇等采用电镜技术，在黄化病病株中发现了类菌原体和类细菌，最早提出中国槟榔黄化病为类细菌（束顶型）和类菌原体（黄化型）复合侵染所致。然而，罗大全等在随后进行的电镜试验中并未观察到类细菌，仅观察到植原体，且发现注射2种四环素族药物后病株病情发展被不同程度抑制，由此提出“植原体是黄化型黄化病的病原之一”。随后罗大全等通过病原PCR 检测，发现黄化型病样可扩增到植原体特异条带，而对照无扩增条带，这与电镜观察、四环素注射和大田流行规律研究结果一致。2010年，车海彦、周亚奎等对槟榔黄化植原体进行了巢式PCR 扩增、测序及系统发育分析，根据16SrRNA 序列分别将其划分为16SrⅠ-G亚组和16SrⅠ-B亚组。

1.3 槟榔黄化病病原研究存在的问题及争议

关于槟榔黄化病病原，目前依然存在一些需要解答或解决的问题。首先，束顶型黄化病病原尚未明确。金开璇等将中国槟榔黄化病划分为黄化型和束顶型2种症状，并提出束顶型症状是类细菌引起，但罗大全等通过电镜未观察到类细菌。因此，束顶型症状是否由植原体引起尚待进一步研究。其次，印度槟榔黄化植原体分属于3个组（16SrⅠ、16SrⅪ 和16SrⅪⅤ），中国仅报道了1个组（16SrⅠ），中国黄化植原体在16Sr组水平上是否也存在多样性尚有待进一步研究。最后，国内槟榔黄化病的传播途径尚无试验证据。尽管我们在海南也发现了甘蔗斑袖蜡蝉，然而在染病槟榔园很难发现该虫，这给该虫的植原体检测、验证工作带来了困难。此外，我们还发现了另外一种刺吸式口器昆虫，植原体检测呈阳性（本实验室未发表资料），该虫是否为YLD的媒介昆虫尚需研究。槟榔黄化病能否通过槟榔种子、带菌种苗等调运远距离传播也尚不明确。

目前，国内部分学者对槟榔黄化病病原尚存在质疑。首先，此前国内仅有2个课题组成功检测到槟榔黄化植原体，部分课题组因未能检测到植原体，从而质疑甚至彻底否定“植原体是槟榔黄化病的病原”这一试验结论，并认为该病是病毒病或根部病害所致。实际上，植原体检测对试验技术要求比较高，采样或试验技术等问题均可能导致槟榔黄化植原体检测失败。本课题组在引进一名有植原体检测技术背景的专业人员后，于2018年-2019年用了近一年的时间通过采样部位选择、基因组DNA 提取等优化才实现槟榔黄化植原体的稳定检测。其次，尽管印度学者已通过菟丝子、甘蔗斑袖蜡蝉接种试验证实槟榔黄化病病原为植原体，但依然有部分学者提出必须用植原体接种、验证其致病性。此前，学界一直认为植原体无法在人工培养基上培养。尽管2012年意大利学者Contaldo等获得突破，成功获得植原体菌落，其结果未被其他实验室重复出来。因此，用经典的柯赫氏法则验证槟榔黄化植原体致病性可能会面临植原体培养、接种等技术难题。此外，染病槟榔通常多从树冠倒数第2～3片叶表现黄化症状，而此部位的巢氏PCR检出率为30.6%（49个黄化样品中仅有15个检测到植原体）、实时荧光PCR检出率仅为26.7%～46.7%（车海彦博士论文，未公开发表）。有学者认为“槟榔园黄化植株检出率需达到90%以上才能确认植原体与黄化病具有相关性”。我们认为该观点显然是错误的。因为检测是病害诊断技术，检出率是衡量植株群体带菌率高低的依据（文衍堂，个人联系），不是衡量两个事物相关性的依据。同时，试验结果证实采用现有技术（real-timePCR和巢式PCR）很难达到90%检出率的目标，这首先受real-timePCR 和巢式PCR 检测灵敏度的制约。其次，研究发现植原体在棕榈科寄主植物槟榔（车海彦博士论文，未公开发表）和椰子体内分布不均，这可能是造成检出率较低的原因。总之，在槟榔黄化病研究中需要摒弃上述片面甚至错误认识的干扰。
2槟榔黄化病防控中存在的问题

2.1槟榔黄化病田间诊断存在干扰

迄今，科研人员在槟榔黄化病病原研究上取得了丰硕成果，然而该病的防控依然极具挑战性。调查发现除黄化病外，炭疽病、细菌性条斑病、叶斑病、褐根病和红根病、病毒病及椰心叶甲等病虫害、生理性缺素、干旱、肥害、除草剂等均可引起槟榔叶片变黄。在黄化病区，通常是1种或多种病虫害与黄化病同时发生;加上营养和气候等因素干扰，“真假”黄化病并存情况较多，易造成混淆，给黄化病识别带来了许多困扰，大大增加了槟榔黄化病防控的难度。因此，中国槟榔黄化病问题更具复杂性。上述因素中椰心叶甲和除草剂问题最为突出。我们调查发现在陵水、万宁等重病区，已有大面积槟榔园遭受黄化病以及椰心叶甲共同为害，导致树势迅速下降，树冠缩小、枯黄甚至植株死亡，产量损失严重，重病园几近绝产，造成疫区许多农户“谈黄色变、谈黄恐慌”，由此丧失种植信心，致使黄化槟榔园失管情况非常突出。椰心叶甲已成为黄化病综合防控中需要优先考虑和解决的问题。吴童童等调查发现生产上除草剂的使用非常普遍，且除草剂使用历史越长、频率越高时，园中槟榔长势越差。其他因素与槟榔黄化病症状或危害上有一定程度的相似性，但较易区分。如炭疽病、细菌性条斑病、叶斑病、病毒病等为典型叶斑类病害，褐根病和红根病等根部病害从最外层叶片开始出现黄化症状、折断垂挂至植株死亡。芽腐病也多见于琼中县。营养元素缺乏或过量以及肥害、除草剂以及干旱、台风等引起的黄化同样与槟榔黄化病症状有明显区别，前者采取施肥、灌水、科学施用除草剂、养殖（牛、羊、鸡）、间种其他作物等措施后通常几个月至一两个生长季即可得到明显改观甚至恢复正常生长状态，而后者无论采取何种防控措施均无法恢复到健康状态。总之，槟榔黄化病田間诊断时需要认真分析，综合考虑，逐项排除，方能做出准确判断并采取相应的防控措施。需要指出的是田间诊断仅是根据病株的表观症状做出判断，不能排除其他因素引起的黄化植株是否感染植原体，因为处于潜育期的植株并不表现症状，对于这些病株只能通过检测手段确诊。

2.2 槟榔黄化病防控难度大

目前，海南省槟榔黄化病防控难度极大，主要有以下原因。首先，近几年陵水县、万宁市、琼海市等重病区输出种苗较多，给黄化病随种苗传播提供了方便。第二，槟榔植株高大，人工喷药费工费时，且成本较高。因此，生产上急需研发精准施药、智能机械化施药设备及配套技术。第三，健康种苗保障体系建设不足，这包括健康种苗培养基地建设和槟榔黄化植原体快速、高效检测技术研发和单位资质授权。第四，科研单位研发的高效栽培、防控技术及配套产品储备尚显不足，已开发的技术、产品在生产上应用度亟待提高;科研单位与企业合作也明显不足，未充分发挥后者的强大推广能力。第五，集成防控技术和措施时需要计算投入产出比。只有防控后挽回的损失明显高于防控投入，防控措施才能获得推广。否则仅靠省、市（县）或厅、局财政经费支持、补贴，各级政府会面临非常大的经费压力。最后也是最重要的问题就是，广大农户一直以来都是把槟榔作为“懒人植物”，管理（肥、水、草）粗放、病虫害防控意识淡薄，广种薄收情况很普遍;砍除病株是一项防止植原体及其类似病害进一步扩散的有效措施，在柑橘黄龙病防控上已被广泛接受，然而在槟榔黄化病防控上尚未得到广泛认同;相反，可治、治愈的观念却很普遍，这明显地阻碍了砍病树等清除毒源措施的贯彻。
3 槟榔种植业前景、黄化病发展趋势分析及黄化病防控建议

3.1 槟榔种植业前景及黄化病发展趋势分析

根据近5～6年的槟榔种植发展动态、消费市场以及宏观政策，我们预计槟榔种植面积会继续增加。2014年-2018年槟榔价格一直处于较高水平，农户种植积极性高涨，在海南省，除中东部地区外，西部地区也在快速发展槟榔产业。目前，全国槟榔消费群体不断扩大，现已发展至北方多个省份。与此同时，海南省省政府正在加快推进“大力提升热带高效现代农业”的战略性产业规划，积极扶植槟榔产业。因此，未来槟榔种植范围、面积会持续增大。迄今，对于植原体病害尚无有效治疗药剂。在中国，槟榔黄化病抗性种质材料研究、媒介昆虫鉴定、生物学特性和传毒机理的研究尚处于初期阶段。在此背景条件下，我们预期未来5～10年内槟榔黄化病会随着种植面积的扩大继续扩散、加重。

3.2 槟榔黄化病防控建议

槟榔黄化病的有效治理事关海南省“精准扶贫”“乡村振兴”战略的实施，需要从多个层面采取综合防控措施。我们建议强化政府职能作用，推动“政府科研院所高等院校企业农户”联动，多层次多角度联合攻关。首先，建议政府充分发挥导向和宣传作用，加强新型农民职业培训，提高其种植管理水平和防控意识，夯实防控基础。政府部门的作用还体现在检疫工作的强力执行和砍除病株措施的落实和补偿。其次，建议科研院所和高等院校组织精干队伍对全省各市县黄化病进行普查，摸清其分布、发病面积及病情轻重等基本信息;研发早期快速诊断及高效监测技术;以黄化病为攻关核心，探明传播途径、发生规律，深入开展致害机理研究。防控关键技术方面，研发传播途径阻截、生物防治、化学防治等关键技术;研发生物防治与化学防治的田间协调病虫兼控技术;研发适合产地生态环境和栽培模式的农药替代产品、新剂型、化学防治替代技术，集成农药减施增效技术模式。栽培技术方面，研发高标准、高质量、集约化的种植管理技术，积极开展抗性种质资源收集、筛选及鉴定，研发健康种苗标准化繁育及种苗检测技术，保障种苗市场;研发专用肥、增效助剂和保水剂，建立合理的水肥综合管理技术体系;开展水肥需求规律、林下种养模式研究，集成槟榔园不同生态栽培模式及配套技术。再次，对于相关企业，充分发挥其信息收集、示范与推广方面的作用，熟化科研院所和高等院校研发的各项技术，集成农民易接收、可复制、可推广的黄化灾害防控及高效栽培关键技术。最后，建议广大农户加强田间管理，修建水肥一体化设施，主动砍除病株，采取林下种养、多种经营等措施，减少因槟榔黄化病造成的经济损失、扩展收入来源。

总之，除非采取切断传播途径等综合措施，否则黄化病必然会随着槟榔种植业持续扩展继续向非病区及新种植区蔓延，造成的经济损失也将持续增大。因此，只有通過上述5方紧密协作，才能达到减轻或杜绝病害蔓延、危害，保障产业健康发展。
4 展望

目前，第三代检测技术- 微滴式数字PCR（dropletdigitalPCR）已成功应用于植原体检测，结果显示该技术比real-timePCR和巢式PCR检测灵敏度高2～3个数量级。采用微滴式数字PCR技术有望提高槟榔黄化植原体检出率，也有望实现健康种苗的保障和病害早期诊断，从而达到病害“早发现、早诊断、早防控”的目的。在槟榔黄化病田间防控上，由于植原体病害为典型的虫传病害，媒介昆虫在植原体病害传播中具有“双寄主”角色，应对其生物生态学、传毒特性进行深入研究。尽管迄今尚无有效治疗药剂，但枣疯病和椰子致死性黄化病（墨西哥尤卡坦科学研究中心DanielZizumbo-Villarreal博士，个人联系）的抗性品种选育、小麦蓝矮病的媒介昆虫控制（西北农林科技大学吴云锋教授，私人联系）、柑橘黄龙病“三板斧”措施（控制柑橘木虱、挖除感病植株和培育无病毒苗木，华南农业大学邓晓玲教授，私人联系）防效已被证实，槟榔黄化病防控可大胆借鉴上述植原体或类似病害的相关措施。迄今，我们在槟榔黄化病流行规律、监测预警技术、健康种苗培育、健康栽培措施等方面已有一定进展（另文发表）。例如，我们在黄化病防控调查中发现林下间种胡椒、牧草以及林下养牛、鸡等对于减轻槟榔黄化病危害有较好的促进作用和增收作用，但对减轻黄化病为害的机理有待深入研究。在理论研究上，为了深入研究植原体生物学特点、致病机理、植原体寄主互作等基础问题，国内外学者从基因组学、蛋白组学、效应因子、致病因子、免疫膜蛋白等不同层次开展了研究，并取得了可喜的进展。例如，Oshima等发现翠菊黄化植原体OY菌株全基因组没有戊糖磷酸循环和ATP合成酶亚基，具有退化性进化的特点。Sugio等发现植原体效应蛋白SAP11能够通过控制寄主植物发育和防御性激素生物合成从而增强传播介体叶蝉犕犪犮狉狅狊狋犲犾犲狊狇狌犪犱狉犻犾犻狀犲犪狋狌狊的产卵能力。上述研究有望为防控槟榔黄化病提供新的策略和方法。

最后，借用《科学》杂志编辑EvelynStrauss的文章“植原体研究现已开始百花齐放”（Phytoplasmaresearchbeginstobloom），槟榔黄化病科研攻关和有效防控需要政府、科研机构、企业和农户齐心协力，通过持续不懈的努力，中国槟榔产业的持续健康发展一定能够得到有效保障。

作者：唐庆华　宋薇薇　于少帅等

槟榔炭疽菌生物学论文 篇2：

槟榔Catalase基因的克隆及亚细胞定位

摘  要：过氧化氢酶（Catalase）广泛存在于生物体内，主要功能是清除植物细胞内光呼吸、线粒体电子传递及脂肪β-氧化等过程中产生的H2O2，从而保护细胞免于过氧化氢酶的毒害。为了解槟榔过氧化氢酶基因的相关信息，利用植物总RNA提取试剂盒提取槟榔叶片总RNA，通过同源克隆和RACE技术获得槟榔全长cDNA，并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明：获得ArCAT1（MN692600）、ArCAT2（MN692601）、ArCAT3（MN692602）3个同源基因，其序列全长均为1476 bp，编码492个氨基酸。遗传进化分析显示，ArCATS与同为棕榈科的油棕（Elaeis guineensis）、海枣（Phoenix dactylifera）等植物的过氧化氢酶氨基酸序列具有较高的相似性，其中与油棕的亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明，ArCAT1蛋白定位于过氧化物酶体中，而ArCAT2和ArCAT3既定位于过氧化物酶体又定位于细胞核中。这为进一步研究Catalase基因在槟榔中的生物学功能奠定基础。

关键词：槟榔;过氧化氢酶;亚细胞定位;基因克隆

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.002

过氧化氢酶是抗氧化酶中首先被发现的一类末端氧化酶，Loew[1]将其命名为Catalase，是由4个相同肽链亚基组成的四聚体血红素酶，它也是一种高度保守的金属酶，具有保守的活化中心和铁血红蛋白结合位点，存在于许多好氧和厌氧生物中，包括细菌、真菌、植物和动物细胞，在植物体内主要存在于过氧化物酶体、乙醛酸循环体和细胞质中，少数分布在线粒体中[2]，主要功能是清除植物细胞内光呼吸、线粒体电子传递及脂肪β-氧化等过程中产生的H2O2，从而保护细胞免于过氧化氢酶的毒害[3]。通过提高植物体内抗氧化酶活性，增强抗氧化代谢水平，可提高植物自身的抗逆性[4]。Catalase与超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸酶（APX）被称为抗氧化酶保護系统[4]。近年来，已有研究结果发现，Catalase在植物生长发育、逆境胁迫防御应答、氧化衰老等生理过程中起着至关重要的作用[2]。Catalases家族由多基因编码，其表达和活性受许多因素的影响，如温度、光照、干旱、高盐、重金属等及生物因子等的影响[2]。目前已经在烟草[5]、拟南芥[6]、玉米[7]、南瓜[8]和水稻[9]等被子植物中发现了3种过氧化氢酶基因。在烟草中发现的3种过氧化氢酶中，CAT1负责清除光呼吸产生的H2O2，CAT2则清除氧化胁迫产生的H2O2，CAT3主要清除乙醛酸循环体中产生的H2O2[10]。

槟榔（Areca catechu L.）是槟榔属棕榈科槟榔亚科槟榔族槟榔亚族的常绿乔木，是一种典型的热带植物，一般生长于高温高湿的热带雨林中，在低海拔、温差变化不大的地区会生长得更好，原产于马来西亚，中国主要分布在云南、海南及台湾等热带地区、亚洲热带地区。槟榔含有生物碱、鞣质、黄酮、萜类等多种化学成分，是重要的中药材，具有祛痰止咳、消积、下气、行水、消肿、截疟、消食醒酒、宽胸止吐、驱虫等作用，是我国重要的四大南药资源之一，经济价值很高，在南方一些少数民族还有将果实作为一种咀嚼嗜好品，可御寒和消除紧张劳动后的疲劳，槟榔树易发生的病害有叶斑病、叶枯病、炭疽病、疫病、果穗枯萎病、叶细菌性条斑病、芽腐病、黄化病等[11-14]。已有研究结果表明，Catalase参与了许多植物的抗病反应，过表达Catalase可提高植物的抗逆性，通过增强抗氧化酶活性及增强活性氧代谢来增强植物的耐受性，但未见槟榔树在此方面的研究报道。本研究利用槟榔叶片提取RNA，通过同源克隆和RACE技术获得槟榔过氧化氢酶全长cDNA，并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位，这为进一步研究过氧化氢酶基因在槟榔中的生物学功能和培育优质抗性的槟榔品种奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

以‘热研1号’槟榔（Areca catechu L.）为供试材料，采自中国热带农业科学院椰子研究所的槟榔园。将槟榔叶片剪碎后，在液氮中快速研磨至粉末状，于?80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2  方法

1.2.1  叶片总RNA的提取及cDNA合成  采用RNA Prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）提取槟榔叶片总RNA。RNA提取后，用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量核算蛋白测定仪检测RNA的质量和纯度。按照Prime ScriptTM cDNA第一链合成试剂盒说明书方法将RNA反转录成cDNA，于?20 ℃保存备用。

1.2.2  候选基因的同源克隆  利用GenBank数据库中与槟榔同为棕榈科的油棕（Elaeis guineensis）的ElCAT1（XM010919942.3）、ElCAT2（NM 001319913.1）、ElCAT3（XM010943120.3）的氨基酸序列，设计特异性引物CAT1F/CAT1R、CAT2F/CAT2R、CAT3F/CAT3R（表1），以基因组cDNA为模板，使用Prime STAR Max Premix （2） 高保真DNA聚合酶进行基因全长序列的扩增：98 ℃ 30 s;98 ℃ 15 s，53 ℃ 15 s，72 ℃ 5 s，扩增30个循环。扩增后的PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒（诺唯赞公司）回收目的基因片段，回收产物连接TA-Blunt载体（TaKaRa），并转化至DH5α大肠杆菌感受态中，挑选阳性克隆送赛默飞世尔科技有限公司进行测序。将测序正确的菌液提取质粒并于?80 ℃保存备用。

1.2.3  目的基因全长序列克隆  根据1.2.2测序所获得的CAT1、CAT2、CAT3序列，设计3RACE引物和5 RACE引物，按照FirstChoice? RLM- RACE Kit试剂盒说明书进行3 RACE PCR和5 RACE PCR，扩增后的PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后，回收产物与TA-Blunt载体连接后转化大肠杆菌DH5α，涂板之后筛选阳性单克隆送广州赛默飞世尔科技有限公司进行测序。

1.2.4  生物信息学分析  通过在线软件（http：// www.bio-soft.net/sms/index.html）对槟榔过氧化氢酶蛋白序列进行比对。

在NCBI中下载与槟榔（Areca catechu L.）同为棕榈科的油棕（Elaeis guineensis）和海枣（Phoenix dactylifera）的3种Catalase基因，利用MEGA 11.0软件，采用Neighbor-Joiniing （N-J邻近法）构建系统进化树，Bootstrap值设置为1000。

利用在线软件http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/中的INSP预测真核蛋白中的核定位信号。

1.2.5  农杆菌转化和亚细胞定位分析

（1）亚细胞定位载体的构建。根据1.2.3获得的槟榔ArCAT1、ArCAT2、ArCAT3编码基因的全长序列，利用Nimble Cloning[15]法分别连接载体pNC-Green-SubC（图1）和pNC-Green-SubN（图2），使GFP荧光蛋白分别位于基因的C端和N端，后转化至DH5α大肠杆菌感受态菌株上，挑选阳性克隆，经过菌液PCR鉴定后，挑选扩增条带最亮且与目的基因大小一致的样品送广州赛默飞世尔科技有限公司测序。

（2）农杆菌的转化。取1 μg质粒DNA加到100 μL农杆菌GV3101感受态细胞中，利用电击法转化农杆菌。加入700 μL LB液体培养基，28 ℃、180 r/min培养2 h后均匀涂布在含80 μg/mL卡那霉素和40 μg/mL利福平的平板上。28 ℃培养48 h形成单菌落。

（3）农杆菌注射本氏烟。挑取农杆菌单菌落接种于200 μL LB液体培养基中，28 ℃、180 r/min培养至OD600约为1.0。5000 r/min离心5 min弃上清，加入5 mL接种缓冲液（含有终浓度为10 mmol/L MgCl2，50 mmol/L MES，pH5.7和100 μmol/L acetosyringone）轻轻悬浮，5000 r/min离心5 min弃上清，重新加入接種缓冲液至OD600在0.3～0.4左右即可，室温静置暗处理3 h，进行接种。用一次性注射器分别吸取1 mL菌液，取针头在受体叶片上轻刺2～3个小孔，将注射器压在针孔部位，以手指抵住叶片下部，轻轻用力将注射器内菌液压送并渗透到叶片组织中，用记号笔在注射部位上做好标记。接种后的烟草25 ℃培养48 h，剪取注射部位15 mm2左右在激光共聚焦显微镜下观察，通过绿色荧光蛋白基因在烟草叶片表皮细胞中的表达和定位分布情况对目的基因进行亚细胞定位分析。

2  结果与分析

2.1  目的基因全长序列的克隆

使用相应的引物进行RT-PCR（图3）、3 RACE（图4）和5 RACE（图5）扩增，将扩增得到的片段进行拼接得到全长cDNA，并在NCBI数据库中通过Blast比对，结果显示与数据库中存在的同一科的油棕的Catalases核酸序列具有高度的相似性，同源率分别为：ArCAT1与ElCAT1为95%，ArCAT2与ElCAT2为95%，ArCAT3与ElCAT3为96%，由此推断克隆所得的序列为槟榔的Catalases编码序列，分别命名为ArCAT1、ArCAT2、ArCAT3，长度均为1476 bp，编码492个氨基酸，并将所得序列在GenBank上登录，登录号分别为ArCAT1（MN692600）、ArCAT2（MN 692601）、ArCAT3（MN692602）。分析结果发现，ArCAT1与ArCAT2、ArCAT3的氨基酸序列同源率分别为79%和90%，ArCAT2与ArCAT3编码的氨基酸序列同源率为77%;ArCAT1与ArCAT2、ArCAT3的核酸序列同源率分别为76%和85%，ArCAT2与ArCAT3的核酸同源率为76%。

2.2  ArCATS基因的生物信息学分析

通过对槟榔过氧化氢酶蛋白序列的比对，利用氨基酸序列比对分析ArCAT1、ArCAT2和 ArCAT3编码的氨基酸序列（图6），结果发现ArCAT1、ArCAT2和ArCAT3均具有与定位有关的三肽（图6，box1、box2和box3）。

从图7可看出，ArCAT1、ArCAT2、ArCAT3分别与油棕的ElCAT1、ElCAT2、ElCAT3和海枣的PhCAT1、PhCAT2、PhCAT3聚在同一分支上，其中，ArCAT1、ArCAT3分别与ElCATI、ElCAT3聚在同一亚分支上，说明槟榔和油棕的亲缘关系最近。

2.3  亚细胞定位

利用http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/中的INSP预测真核蛋白中的核定位信号，在ArCAT2和ArCAT3中均发现了核定位信号的结构域（图6中的box4）。亚细胞定位结果发现（图8），无论GFP荧光蛋白位于基因的C端还是N端，对定位的结果均无影响。在ArCAT1、ArCAT2、ArCAT3中均可观测到绿色荧光点状物，这符合过氧化物酶体的定位特征。但ArCAT2和ArCAT3比较特殊，不仅定位在过氧化物酶体中，还定位在细胞核中，这与徐娟等[16]所报道的植物细胞Catalase主要分布在过氧化物酶体、乙醛酸循环体和细胞质中结论一致，说明ArCAT2和ArCAT3可能在细胞核和细胞质中均发挥重要的功能。

3  讨论

众多研究结果表明，过氧化氢是植物发育和环境反应的重要信号分子，在烟草中发现的3种过氧化氢酶中，CAT1负责清除光呼吸产生的H2O2，CAT2则清除氧化胁迫产生的H2O2，CAT3主要清除乙醛酸循环体中产生的H2O2[5]。玉米CAT1和CAT3在籽粒发育过程中表达，而CAT2的表达在籽粒发育后期才可检测到[17]。而这些过氧化氢蛋白酶主要存在于细胞质中的过氧化物酶体和乙醛酸循环体[18]。而本研究利用http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/预测真核蛋白中的核定位信号，在ArCAT2和ArCAT3中均发现了核定位信号的结构域（图6，box4），表明ArCAT2和ArCAT3定位在细胞核中并有可能发挥着重要的功能，这有待于作进一步的研究，预期对槟榔Catalase基因（ArCAT）功能的探究提供重要的思路。

在本研究中，研究发现ArCAT1和ArCAT2中存在经典的P-T-S1基序S/N-R-L基序，而在ArCAT3中则存在T-R-F基序（图6，box2），这些三肽并不位于末端的C端而是在上游-7至-9，这种内部定位的基序可能加强过氧化物酶体的导入，但其本身并不起作用。在N-R-L基序的上游是一个Q-K-L/I/V序列（图6，box1）。据报道[19-20]，基因序列会影响它们之间的相互作用，基于目前对PTS1通路机制的了解，内部的Q-K-L序列似乎不太可能直接与PTS1受体蛋白Pex5p作用[21]。另一项研究得出结论，南瓜的过氧化物酶体中的CAT1积累需要PTS1通路机制[22]。虽然知道不同过氧化物酶体蛋白PTS1三肽表现出相当大的变异性，不过槟榔过氧化物酶的相应序列（图6，box3）不属于其列。尽管如此，研究发现为了将过氧化氢酶高效导入槟榔叶片细胞过氧化物酶体，C端三肽（图6，box3）是必需的，这一研究结论为后续槟榔过氧化氢酶基因高效遗传转化体系的建立提供了重要的科学依據。

参考文献

Loew O. A new enzyme of general occurrence in organismis[J]. Science， 1900， 11（279）： 701-702.

宋新华， 赵凤云. 植物体内过氧化氢酶的研究进展[J]. 安徽农业科学， 2007（31）： 9824-9827.

刘灵芝， 钟广蓉， 熊  莲， 等. 过氧化氢酶的研究与应用新进展[J]. 化学与生物工程， 2009， 26（3）： 15-18.

刘云芬， 王薇薇， 祖艳侠， 等. 过氧化氢酶在植物抗逆中的研究进展[J]. 大麦与谷类科学， 2019， 36（1）： 5-8.

王升平， 杨金广， 战徊旭， 等. 烟草过氧化氢酶基因CAT1的克隆及表达特征分析[J]. 中国烟草学报， 2014， 20（5）： 103-109.

Frugoli J A， Zhong H H， Nuccio M L， et al. Catalase is encoded by a multigene family in Arabidopsis thaliana （L.） Heynh[J]. Plant Physiology， 1996， 112（1）： 327-336.

Guan L Q， Scandalios J G. Molecular evolution of maize catalases and their relationship to other eukaryotic and prokaryotic catalases[J]. Journal of Molecular Evolution， 1996， 42（5）： 570-579.

Esaka M， Yamada N， Kitabayashi M， et al. cDNA longing and differential gene expression of three catalases in pumpkin[J]. Plant molecular biology， 1997， 33（1）： 141-155.

Iwamoto M， Higo H， Higo K. Differential diurnal expression of rice catalase genes： the 5-flanking region of CatA is not sufficient for circadian control[J]. Plant Science， 2000， 151（1）： 39-46.

Willekens H， Chamnongpol S， Davey M， et al. Catalase is a sink for H2O2 and is indispensable for stress defence in C3 plants[J]. EMBO Journal， 1997， 16（16）： 4806-4816.

李曉娜， 曾小红， 谢龙莲， 等. 槟榔科学研究近况分析[J]. 热带农业科学， 2017， 37（3）： 79-82.

易  攀， 汤嫣然， 周  芳， 等. 槟榔的化学成分和药理活性研究进展[J]. 中草药， 2019， 50（10）： 2498-2504.

栾  剑， 陶晓月. 关于传统中药槟榔生物活性的研究进展[J]. 安徽农学通报， 2018， 24（13）： 8-10， 12.

孙  娟， 曹立幸， 陈志强， 等. 中药槟榔及其主要成分的药理和毒理研究概述[J]. 广州中医药大学学报， 2018， 35（6）： 1143-1146.

曾妍静， 沈文涛， 庹德财， 等. 适用于Nimble Cloning系统的pCambia载体改造[J]. 生命科学研究， 2019， 23（4）： 276-280.

徐  娟， 常雁红， 罗  晖. 过氧化氢酶的研究和固定化及其应用进展[J]. 安徽农业科学， 2014， 42（34）： 12035-12038.

Redinbaugh M G， Wadsworth G J， Scandalios J G. Characterization of catalase transcripts and their differential expression in maize[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 1988， 951（1）： 104-116.

Purev M， Kim Y J， Kim M K， et al. Isolation of a novel catalase （Cat1） gene from Panax ginseng and analysis of the response of this gene to various stresses[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2010， 48（6）： 451-460.

Chen N， Teng X L， Xiao X G. Subcellular localization of a plant catalase-phenol oxidase， AcCATPO， from amaranthus and identification of a non-canonical peroxisome targeting signal[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8： 1345.

Mhamdi A， Queval G， Chaouch S， et al. Catalase function in plants： A focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models[J]. Journal of Experimental Botany， 2010， 61（15）： 4197-4220.

Oshima Y， Kamigaki A， Nakamori C， et al. Plant catalase is imported into peroxisomes by Pex5p but is distinct from typical PTS1 import[J]. Plant Cell Physiol， 2008， 49（4）： 671-677.

Lingner T， Kataya A R， Antonicelli G E， et al. Identification of novel plant peroxisomal targeting signals by a combination of machine learning methods and in vivo subcellular targeting analyses（W）[J]. Plant Cell， 2011， 23（4）： 1556-1572.

作者：梁婷 沈文涛 庹德财 言普 黎小瑛 唐庆华 周鹏

槟榔炭疽菌生物学论文 篇3：

植物源天然防腐剂来源及其抗菌物质基础

摘要随着人们健康意识的提高，非化学合成的植物源天然防腐剂逐渐受到人们的关注。主要从防腐剂的植物来源及抗菌的物质基础两方面进行探讨，并指出其在开发利用中存在的问题，旨在为植物源天然防腐剂的研究提供参考。

关键词植物源；天然防腐剂；抗菌；物质基础

Botanical Natural Food Preservative and Their Antimicrobial Material Basis

ZHANG Hailing

（School of Life Sciences， Hefei Normal University， Hefei，Anhui 230601）

Key wordsBotanical；Natural food preservative；Antimicrobial；Material basis

食品在加工、保藏、儲运过程中易受微生物侵染造成腐败，不仅使之丧失营养价值而产生损失浪费，还会引起食物中毒从而危害健康。延长食品保藏期限最为方便和经济的技术是添加食品防腐剂。过去人们大都使用合成防腐剂如苯甲酸、山梨酸及其盐类等，但经长期研究发现，这类化学合成防腐剂的过量使用会有致癌性、致畸性和易引起食物中毒等危害，还可能对人体造成积累性慢性伤害。例如日本全面禁止在食品、药品、化妆品中使用苯甲酸钠；也有相关对羟基苯甲酸酯类对人体不利影响的报道等[1-3]。

天然防腐剂因其抗菌谱广、性能稳定、安全性较高等优点，成为近年研究开发的热点。天然防腐剂主要来源于动植物提取物和微生物及其代谢产物。我国现有种子植物约25 700种，蕨类植物2 400余种，苔藓植物2 100多种，合计有高等植物30 000多种[4]，我国的植物多样性为开发天然防腐剂提供了宝贵的资源。

1植物源天然防腐剂的植物来源

1.1中草药来源

1994年出版的《中国中药资源志要》收录了分布于383科2 313属共11 020种的药用植物[5]。大量的试验证实了多数中草药对多种菌有抑制杀灭作用，同时在中草药中寻找天然防腐剂也是我国独有的研究领域。经大量试验证实，多数中草药均有较好的抑菌作用，目前中草药抑菌试验中发现黄连的抑菌能力最强，其次为大黄、黄苓、大青叶、艾叶、鱼腥草等，再其次为黄柏、玄参、连翘、知母、马鞭草、乌梅、白头翁、茵陈、蒲公英等[6]。

杨文侠等[7]采用70%乙醇为浸提剂，研究了7种药食同源植物对脐橙致腐霉菌的抑菌效果，发现脐橙经厚朴提取液处理后腐烂率减少了59.7%，防腐效果最好。高伦江[8]研究发现，余甘子果实70%乙醇提取物对细菌抑菌活性最强，其次为酵母，而对霉菌几乎没有抑菌活性，粗提物对热有较好的稳定性，抑菌效果随着食品基质pH的减小而增强，分离后得到抑菌单体物质没食子酸、槲皮素和齐墩果酸，但发现抑菌活性并没有因单体纯度提高而增强，表明粗提物中可能存在具有协同抑菌作用的物质。张雁南等[9]研究发现，丁香和甘草复配液存在协同抑菌作用，对细菌最低抑菌浓度为3125 mg/mL，对霉菌则为6.25 mg/mL，在较低质量浓度下便可达到较好的抑菌效果。但中草药复配也可能存在拮抗效应，王蝉[10]研究发现，单一中草药植物提取液的保鲜效果要强于复配提取液，可能是由于单一成分之间存在拮抗效应，使得各成分的相互作用小于单一组分加和的抑菌效果，进而降低了抑菌活性。

1.2香辛料来源

香辛料为食品烹调中常见调味料，如姜、蒜、丁香、肉桂、花椒、茴香、薄荷、桂皮等，其中含有的挥发油使得大多数香辛料都具有天然的抗菌作用。Hernndez等[11]研究发现，孜然、丁香挥发油对肉中常见的5种病原菌的抑菌浓度分别为500和750 mg/L，对肉的保鲜效果显著。刘瑜等[12]研究了3种不同部位姜挥发油对6种菌的抑菌活性，发现抑菌强弱顺序为姜皮挥发油、全姜挥发油、去皮姜挥发油，其中姜皮挥发油对6种菌的最低抑菌浓度均小于0.9 mg/mL。大蒜素是从大蒜鳞茎中分离出的具有广谱抗菌活性的硫醚化合物，也存在于洋葱和其他葱科植物中。研究发现，大蒜素对10种细菌的LD50≤15 μg/mL[13-14]。Hussein等[15]研究了大蒜素对5种鱼类病原菌的抗菌作用，发现最低抑菌浓度仅为63～500 μg/mL。

利用纳米包埋的手段可克服香辛料提取物易挥发的缺陷，包埋后的缓释作用可有效地延长提取物的保鲜作用时间。刘占东等[16]采用离子凝胶法制备了一种壳聚糖纳米粒的肉桂精油，包埋质量分数1%的肉桂精油壳聚糖纳米粒试验组的冷却肉在（4.0±0.5）℃时储藏期可达6 d，明显优于对照组3 d的储藏期。此外，不同香辛料复配以及香辛料提取物与其他天然防腐剂复配，可有效提高其抗菌强度，两者之间存在一定的协同抗菌作用。杨柳等[17]研究发现，丁香精油和肉桂精油按1∶1比例复配时，对大肠杆菌的抑菌效果要优于单一精油；吕晓楠等[18]利用乳酸链球菌与黄芩、黄连、大黄按1∶6、1∶5、1∶6复配后进行抑菌试验，结果表明复配物效价分别是乳酸链球菌的1.78、1.54、1.27倍。

1.3果蔬来源

果胶是一种水溶性天然聚合物，广泛存在于柠檬、橙、柚、柑橘、葡萄等果皮中或甜菜、苹果等废渣中，果胶的酶分解物在酸性条件下（pH<6）具有抗菌作用，主要的抗菌物质是聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸[19]。李拖平等[20]研究发现，在pH 5 的条件下，10 mg/mL 乳酸钠与5 mg/mL 的山楂果胶分解物——果胶寡糖的复配物即可完全抑制枯草芽孢杆菌的生长，防腐效果出色。李大峰等[21]发现，适度水解的柚皮果胶对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为3.75、7.50、7.50 g/L，水解过度会使得具有较高抑菌活性的低聚半乳糖醛酸进一步水解为抑菌活性较弱的D-半乳糖醛酸。邱蓉蓉[22]研究发现，石榴皮的乙醇提取物对常见的9种食品腐败菌均有抑制作用，且提取物经过高温处理及紫外线照射后抗菌活性依然没有减弱。

常见的瓜果蔬菜也具有一定抗菌活性，郭奇等[23]发现，黄瓜、南瓜、苦瓜、冬瓜和丝瓜5种瓜类蔬菜的有机溶剂提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定程度的抑菌效果，其中南瓜的乙酸乙酯提取物抑菌活性最强。Miceli等[24]研究发现，琉璃苣、芥菜叶的水浸液对常见的35株食源性细菌均有抑制作用，其中芥菜叶对革兰氏阳性细菌的抗菌效果更强，琉璃苣叶对革兰氏阴性细菌的抗菌效果更强。

1.4野生植物及其他来源

荸荠味甜多汁、清脆可口、营养丰富。Zhan等[25]研究发现，荸荠皮的乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和李斯特菌均有抑制作用，通过检测发现活性物质为10种黄酮苷元。茶多酚为茶叶中多酚类物质总称，已被GB2760—2011收录作为抗氧化剂使用，但它也具有较强的抗菌活性，其中的表没食子儿茶素没食子酸酯为其抗菌的主要活性成分[26]。甘蔗糖蜜为制糖工业副产品，Takara等[27]从中分离出2种酚类物质，发现对引起龋齿的表兄链球菌最低抑菌浓度为4 mg/mL。WANG等[28]利用丙酮提取板栗壳中含有的单宁类物质，发现其对不同细菌均有抑制作用，对大肠杆菌的最低抑菌浓度仅为97.65 μg/mL。松针的水提物对大肠杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌表现出较强抑菌活性，对5种菌的最低抑菌浓度为0.78～12.50 mg/mL[29]；松针的精油提取物表现出更强的抑菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、青霉等9种常见食品污染菌的最低抑菌浓度仅为0.20～1.56 μg/mL[30]。

此外，荷叶、艾叶、花生壳、竹叶、银杏叶、蒲公英等均有不同程度的抗菌作用。

2植物源天然防腐剂抗菌的物质基础

2.1简单酚类和酚酸

中药材当归、川穹富含阿魏酸，通常以阿魏酸为有效成分来评价其优劣，阿魏酸具有抗炎作用，在欧美国家已被批准用做食品抗氧化剂[31]。常见的草本植物龙蒿叶和百里香含有的咖啡酸，对病毒、细菌、真菌均有较好的抑制作用[32]。Zeng等[29]对松针水提取物进行分离纯化后发现，提取物中主要抑菌成分为莽草酸。

肉桂酸、儿茶酚和没食子酚都是常见的羟基取代酚，它们的羟基取代位点及数目被认为对微生物的毒性有关，有研究表明，随着羟基化数目的增加对微生物的毒性也随之增加。另有研究发现，酚氧化程度越高，对微生物抑制越强[33]。酚类对微生物的毒性机制包括氧化物对酶的抑制作用，可能是通过与蛋白质的巯基反应或通过与蛋白质的非特异性相互作用而产生[34]。

2.2醌类

在中药中以蒽醌及其衍生物为主，还有一部分不同程度的还原产物，如蒽酚、氧化蒽酚、蒽酮及其二聚体，主要存在于蓼科的大黄、何首乌、拳参、虎杖，豆科的番泻叶、决明子，百合科的芦荟，茜草科的鼠李、茜草等植物中[31]。田兵等[35]发现，从芦荟中得到的蒽醌化合物蘆荟苷是主要抗菌成分，具有较强的抑制革兰氏阳性菌能力。Kazmi等[36]研究发现，意大利番泻叶中含有的蒽醌类物质对炭疽杆菌、假白喉棒状杆菌、铜绿色假单胞菌有抑制作用，对类鼻疽伯克氏菌有杀菌作用。蒽醌类化合物对微生物的毒性机制为通过抑制菌体糖代谢中间产物的氧化及脱氢过程，并与DNA结合，抑制核酸及蛋白质合成[37]。

2.3黄酮类

黄酮类化合物泛指2个苯环通过中央三碳相互连接而成的一系列化合物，广泛分布于植物界，花、叶、果中的黄酮类常以苷的形式存在，而木质部中多为游离的黄酮类，竹叶、银杏叶、槐米、荷叶、陈皮、黄岑、葛根等都含有黄酮类化合物[38]。黄酮类化合物如槲皮素、鼠李素、黄岑苷、木犀草素和石吊蓝苷表现出抗菌活性，二氢槲皮素、山奈酚有抗病毒活性。渡边和浩[39]发现，甘草查耳酮对HIV病毒有一定抑制作用。儿茶素是黄酮类化合物在C3单元的最简化形式，在体外表现出对霍乱弧菌O1、变形链球菌、痢疾杆菌和其他细菌和微生物的抑制作用[40]。大量研究表明，黄酮类化合物对细菌的抑制效果明显，但对霉菌和酵母效果较弱。抗菌活性可能由于它们可以与细胞外可溶性蛋白、细胞膜形成复合物，许多亲脂类黄酮还可能破坏微生物细胞膜[41]。

2.4单宁类

单宁又称鞣质，是一类水溶性多酚类化合物，分为水解鞣质和缩合鞣质两大类，分子量为500～3 000，广泛存在植物的树皮、果皮、叶、果实、根茎上，对细菌、真菌和酵母菌有明显抑制作用，如柿子鞣质对破伤风杆菌、葡萄球菌、白喉杆菌有抗性，茶叶、槟榔中的缩合鞣质，丹皮、熊果、老鹳草中的水解鞣质对链球菌有抗性[37]。单宁具有抑菌作用的机制主要有以下几点：一是单宁与生物大分子（如蛋白质、纤维素、半纤维素、胶质等）的络合反应；二是单宁与金属离子的螯合作用（降低了含金属酶的活性）；三是单宁可以降低细胞膜的流动性，抑制细胞膜合成[42]。

2.5萜类

萜类是各类天然产物中种类最多的一类化合物，其中单萜、倍半萜及其含氧衍生物是植物挥发油的主要组成成分，富含挥发油的植物有菊科、木兰科、唇形科、芸香科、伞形科、姜科、樟科、禾本科等，例如菊、八角、薄荷、橙、当归、樟树、丁香等都含有挥发油，具有抗菌活性[37]。Knobloch等[43]提出了植物挥发油在水中的溶解度直接影响挥发油有效成分透过细胞壁进入菌体的能力，而抗菌性则基于在菌体细胞膜双磷脂层中的溶解度；挥发油中的类萜类降低了生物膜的稳定性，从而干扰了能量代谢的酶促反应的观点。

2.6生物碱类

狭义地讲，植物中的含氮有机化合物（蛋白质、肽类、氨基酸及维生素B除外）称为生物碱。按化学结构类型可分为异喹啉类、喹啉类、吲哚类、哌啶类、萜类、甾体类、肽类生物碱等，大多数生物碱具有抗菌作用。李杨等[44]报道了79个具有抗菌活性的生物碱，其中最受关注的为传统民间药用植物中的异喹啉生物碱，但有关生物碱的抗菌作用是否与含氮官能团相关还有待进一步研究。通过对生物碱的结构修饰也可得到更强抗菌活性的物质，Park等[45]通过对小檗碱和9-去甲小檗碱的结构修饰，在C-13位上引入不同芳香基团，使得新的衍生物具有了更好的细胞膜渗透性，显著提高了抗真菌活性。

2.7多肽类

植物抗菌肽主要为二硫键铰链多肽类，这些抗菌肽几乎都富含半胱氨酸，而且所有的半胱氨酸都具有分子内二硫键结构[46]。海洋生物为适应特殊生存环境和防御天敌，代谢出许多结构新颖、功能独特的活性肽、蛋白质和生物酶类，是寻找抗菌物质具有开发潜力的领域，Tan等[47]从红海藻中分离出七环肽ceratospongamide，其反式异构体具有很强的抗炎作用（ED50=32 nmol/L）。

3问题及展望

我国具有开发植物源天然防腐剂的资源优势，但在其研究与开发中仍存在以下问题：

①植物源防腐剂的开发需要植物学、微生物学、食品科学、毒理学、中医药学和生物化学等多门学科的理论为基础，但目前各学科交叉合作较少，在探索中做了许多重复的工作，导致天然防腐剂开发缺乏系统的理论指导。

②目前植物提取物的研究还大多集中在粗提物，防腐的作用机理、抗菌谱和可应用范围研究也不够清楚，甚至部分植物提取物中到底是何种物质起作用还不清楚，导致无法进行毒理学评价。

③在对植物源防腐剂从各方面进行研究的同时，必须对其现有标准或规定等内容不断地进行补充、完善，为植物源防腐剂的开发提供指导。

21世纪是个“绿色”的世纪，绿色食品、有机食品的发展离不开植物源防腐剂的开发和应用，开发广谱、高效、安全、低成本的植物源防腐剂将会成为下一个食品工业中的热点。

安徽农业科学2017年

参考文献

[1] 唐春红.天然防腐剂与抗氧化剂[M].北京：中国轻工业出版社，2010.

[2] ISHIWATARI S，SUZUKI T，HITOMI T，et al.Effects of methyl paraben on skin keratinocytes[J].Journal of applied toxicology，2007，27（1）：1-9.

[3] HANDA O，KOKURA S，ADACHI S，et al.Methylparaben potentiates UVinduced damage of skin keratinocytes[J].Toxicology，2006，227（1/2）：62-72.

[4] 周立刚.植物抗菌化合物[M].北京：中国农业科学技术出版社，2005.

[5] 中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京：科学出版社，1994.

[6] 钱昆，周涛.植物源天然防腐剂应用和机理研究的最新进展[J].中国食品添加剂，2006（5）：100-103.

[7] 杨文侠，邓利珍，周亮，等.植物提取液对脐橙致腐青霉菌的抑菌研究[J].食品科技，2013，38（12）：238-241.

[8] 高倫江.余甘子抑菌活性及防腐应用研究[D].重庆：西南大学，2008.

[9] 张雁南，宁志亮，陈长武，等.丁香、甘草协同抑菌作用研究[J].食品科学，2010，31（21）：65-68.

[10] 王蝉.中草药植物提取液对鸡蛋涂膜保鲜效果的应用研究[D].武汉：华中农业大学，2010.

[11] HERNNDEZOCHOA L，AGUIRREPRIETO Y B，NEVREZMOORILLN G V，et al.Use of essential oils and extracts from spices in meat protection[J].Journal of food science and technology，2014，51（5）：957-963.

[12] 刘瑜，张卫明，单承莺，等.生姜挥发油抑菌活性研究[J].食品工业科技，2008，29（3）：88-90.

[13] 梅四卫，朱涵珍.大蒜素的研究进展[J].中国农学通报，2009，25（9）：97-101.

[14] ANKRI S，MIRELMAN D.Antimicrobial properties of allicin from garlic[J].Microbes and infection，1999，1（2）：125-129.

[15] HUSSEIN A H，HASSAN W H，MOUSSA I M I.Potential use of allicin（garlic，Allium sativum Linn，essential oil）against fish pathogenic bacteria and its safety for monosex Nile tilapia（Oreochromis niloticus）[J].Journal of food agriculture and environment，2013，11（1）：696-699.

[16] 刘占东，李璐，全国芬，等.肉桂精油壳聚糖纳米粒在冷却肉保藏中的应用[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2016，44（5）：193-199.

[17] 杨柳，张一，王磊，等.香辛料精油复配抑菌效果研究[J].中国调味品，2016，41（4）：57-60.

[18] 吕晓楠，吴兆亮，赵艳丽，等.Nisin与天然植物提取物复配的抑菌性能研究[J].食品研究与开发，2009，30（11）：171-173.

[19] 刘泽鑫.植物源天然食品防腐剂的研究进展及前景[J].吕梁学院学报，2013，3（2）：40-42.

[20] 李拖平，李苏红，宋玉蓉，等.山楂果胶寡糖及其复合物对枯草杆菌的抗菌作用[J].食品工业科技，2012，33（10）：154-156.

[21] 李大峰，贾冬英，陈潇，等.柚皮果胶水解物的抗菌活性研究[J].氨基酸和生物资源，2010，32（2）：63-65.

[22] 邱蓉蓉.石榴果皮提取物对食品腐败菌的抑菌活性及机理研究[D].杭州：杭州师范大学，2016

[23] 郭奇，魏玉西，殷邦忠，等.五种瓜类蔬菜提取物的抑菌活性研究[J].食品科学，2009，30（13）：52-55.

[24] MICELI A，ALEO A，CORONA O，et al.Antibacterial activity of Borago officinalis and Brassica juncea aqueous extracts evaluated in vitro and in situ using different food model systems[J].Food control，2014，40：157-164.

[25] ZHAN G，PAN L Q，MAO S B，et al.Study on antibacterial properties and major bioactive constituents of Chinese water chestnut（Eleocharis dulcis）peelsextracts/fractions[J].European food research and technology，2014，238（5）：789-796.

[26] BANSAL S，CHOUDHARY S，SHARMA M，et al.Tea：A native source of antimicrobial agents[J].Food research international，2013，53（2）：568-584.

[27] TAKARA K，USHIJIMA K，WADA K，et al.Phenolic compounds from sugarcane molasses possessing antibacterial activity against cariogenic bacteria[J].Journal of oleo science，2007，56（11）：611-614.

[28] WANG L W，ZHAO B.Antibacterial activity of the vegetable extract from chestnut（Castanea mollissima Blume）shell[J].Asian journal of chemistry，2011，23（9）：4243-4244.

[29] ZENG W C，ZHANG Z，GAO H，et al.Chemical composition，antioxidant，and antimicrobial activities of essential oil from pine needle（Cedrus deodara）[J].Journal of food science，2012，77（7）：824-829.

[30] ZENG W C，HE Q，SUN Q，et al.Antibacterial activity of watersoluble extract from pine needles of Cedrus deodara[J].International journal of food microbiology，2012，153（1/2）：78-84.

[31] 徐任生，趙维民，叶阳.天然产物活性成分分离[M].北京：科学出版社，2012：343-345，371.

[32] BRANTNER A，MALE ，PEPELJNJAK S，et al.Antimicrobial activity of Paliurus spinachristi mill.（Christ’s thorn）[J].Journal of ethnopharmacol，1996，52（2）：119-122.

[33] SCALBERT A.Antimicrobial properties of tannins[J].Phytochemistry，1991，30（12）：3875-3883.

[34] MASON T L，WASSERMAN B P.Inactivation of red beet betaglucan synthase by native and oxidized phenolic compounds[J].Phytochemistry，1987，26（8）：2197-2202.

[35] 田兵，华跃进，马小琼，等.芦荟抗菌作用与蒽醌化合物的关系[J].中国中药杂志，2003，28（11）：1034-1037.

[36] KAZMI M H，MALIK A，HAMEED S，et al.An anthraquinone derivative from Cassia italica[J].Phytochemistry，1994，36（3）：761-763.

[37] 郑言博，马卓.蒽醌类化合物抗菌与抗肿瘤活性的研究进展[J].湖北中医杂志，2012，34（2）：74-76.

[38] 陈业高.植物化学成分[M].北京：化学工业出版社，2004：223，245，158.

[39] 渡边和浩.抗病毒药用组成物质：平1-175942[P].1989-07-12.

[40] VIJAYA K，ANANTHAN S，NALINI R.Antibacterial effect of theaflavin，polyphenon 60（Camellia sinensis）and Euphorbia hirta on Shigella spp.：A cell culture study[J].Journal of ethnopharmacology，1995，49（2）：115-118.

[41] TSUCHIYA H，SATO M，MIYAZAKI T，et al.Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavanones against methicillinresistant Staphylococcus aureus[J].Journal of ethnopharmacology，1996，50（1）：27-34.

[42] 徐进，赵声兰，陈朝银，等.细菌抗单寧作用机制及其意义[J].生物学杂质，2008，25（4）：4-6.

[43] KNOBLOCH K，PAULI P，IBERL B，et al.Antibacterial and antifungal properties of essential oil components [J].Journal essential oil research，1989，1（3）：119-128.

[44] 李杨，左国营.生物碱类化合物抗菌活性研究进展[J].中草药，2010，41（6）：1006-1014.

[45] PARK K D，LEE J H，KIM S H，et al.Synthesis of 13-（substituted benzyl）berberine and berberrubine derivatives as antifungal agents[J].Bioorganic and medicinal chemistry letters，2006，16（15）：3913-3916.

[46] 王琼，何清君.植物抗菌肽研究进展[J].四川师范学院学报（自然科学版），2000，21（2）：141-145.

[47] TAN L T，THOMAS W R，GERWICK W H，et al.Cis，cisand transceratospongamide，new bioactive cyclic heptapeptides from the Indonesian red alga Ceratodictyon spongiosum and symbiotic sponge Sigmadocia symbiotica[J].Journal of organic chemistry，2000，65（2）：419-425.

作者：张海玲