马铃薯主要病毒及检测研究进展

马铃薯具有分布范围广、适应性强、产量高和用途广泛等特点, 是全球公认的全营养食物。随着我国马铃薯主粮化战略的启动, 对保障国家粮食安全、顺应国人营养需求、缓解资源环境压力, 有着其他作物不可替代的作用。但马铃薯在生长期间易受多种病毒病侵染造成病毒性退化, 使马铃薯的品质和产量受到影响, 造成的损失巨大。现已研究出的侵染马铃薯的病毒有40多种[1], 危害我国马铃薯产区的主要病毒有马铃薯PVX、PVS、PVY、PVA、PVM、PLRV和PSTV[2,3]。这些病毒严重影响马铃薯的产量及品质。因此, 马铃薯病毒的研究也成为各国研究的重点, 马铃薯病毒的检测成为马铃薯种薯繁育中的重大难题。

1 影响马铃薯的主要病毒类型

1.1 马铃薯X病毒 (Potato Virus X, PVX)

马铃薯X病毒为害症状因品种、病毒株系以及环境条件的不同, 有些株系在冷凉条件下, 叶片出现轻微花叶, 继而发展成为褪绿斑、坏死性条斑, 有的上部叶畸形, 叶缘呈锯齿等症状;晴朗天气, 明脉、轻微花叶症状可减轻, 甚至完全消失;有些株系, 在高温条件下不表现症状, 呈隐症现象。PVX是由一条正链RNA组成的线性病毒, RNA 3, 末端是多聚腺嘌呤核苷酸, 5, 末端有m7Gpp G“帽子”结构[4]。PVX单独侵染马铃薯可减产15%左右, PVX可与多种病毒复合侵染, 严重时造成马铃薯绝收。

1.2 马铃薯Y病毒 (Potato Virus Y, PVY)

马铃薯Y病毒病 (PVY) 的田间症状复杂多变, 不同的病毒株系引致的症状差异较大, 初期出现明脉症状, 后形成系统斑驳, 叶脉两侧组织呈绿色带状斑, 叶片基部症状较为明显, 病叶侧脉呈灰褐色坏死, 表现脉和茎的变褐坏死。PVY病毒粒子为弯曲线状, RNA的5’端为VPg, 3’端为Poly (A) [5]。依据基因序列和基因组学, PVY分为PVYO、PVYN, PVYC及一系列PVYO/PVYN重组型如PVYNTN和PVYN:O[6]。马铃薯侵染PVY后, 通常减产越50%, 当它与PVX或PVA病毒混合感染时, 会造成马铃薯产生非常严重的皱缩花叶症状, 植株短小, 减产可达80%[7]。

1.3 马铃薯S病毒 (Potato Virus S, PVS)

许多马铃薯品种都带PVS, 很多时候无病症, 却出现明显的花叶和坏死斑点, 最初中上部叶片的叶脉间出现褪绿小斑点, 周边扩大后, 呈花叶症状, 褪绿部出现坏死斑点, 严重时, 叶面呈波状, 生长后期, 中、下位叶片表面变为青铜色。PVS存在着2个株系 (PVSO和PVSA) , PVS病毒还存在着对气候差异产生适应性变异[8]。一般PVS单独侵染时没有明显的症状, 导致马铃薯减产10%~20%[9]。在大田PVS通常和其他病毒混杂感染, 减产20%~30%[10]。

1.4 马铃薯卷叶病毒 (Potato Leaf Roll Virus, PLRV)

植株感马铃薯卷叶病毒 (PLRV) 病后, 由下叶开始叶缘上卷, 严重的呈管状, 卷叶波及到上部叶片, 导致株高矮缩, 叶色黄变, 病株葡匐茎短, 生成许多小型块茎。PLRV靠蚜虫以时间长、循环繁殖方式传播, 在寄主植株体内主要局限在维管束内[11]。由于韧皮部破坏, 在茎横切面可观察到黑点, 茎节部和基部尤为突出, 块茎组织则出现导管区网状坏死斑纹, 导致马铃薯品质严重受损。PLRV是单链正义RNA病毒, 属黄化病毒组[12,13]。可造成马铃薯减产30%以上。

1.5 马铃薯A病毒 (Potato Virus A, PVA)

马铃薯A病毒 (PVA) 是侵染马铃薯的主要病毒之一, 其具有丝状的病毒粒子, 长730nm左右, 直径约15nm。1914年, 第一次出现了有关马铃薯A病毒病的病害症状的报道, 正式命名直到1932年[14,15]。PVA通过汁液机械摩擦接种。薯块可持久带毒。依据不同种类和不同种植地区, 侵染该病毒的马铃薯病叶将出现药叶、叶面粗糙、边缘波浪状或不显症, 一部分敏感的品种表现出顶端坏死。该病毒通常与PVY、PVX、PVM病毒混合侵, 为皱缩状, 减产严重。

1.6 马铃薯皱缩花叶病毒 (Potato Virus M, PVM)

马铃薯M病毒 (PVM) 有正单链RNA, 发生在全国各地[16]。田间一般经机械和蚜虫传播, 常表现为叶片皱缩, 全株矮化, 还伴有叶脉透明, 通常减产9%~49%。马铃薯M病毒主要借助于汁液摩擦传毒。高海拔、低温、昼夜温差大的生态环境对病毒的繁殖有抑制作用。

1.7 马铃薯纺锤块茎类病毒 (Potato Spindle Tuber Viroid, PSTV)

马铃薯纺锤块茎病毒 (PSTV) 是影响我国北方马铃薯生产的严重病害之一。该病毒能影响块茎的形状, 还能降低结薯的数量和大小。PSTV是一个非常小的单链RNA分子, 只有核酸, 无衣壳蛋白, 有病原性的RNA, 呈环状。感病植株茎和花梗细长、上举, 或小叶变小, 缘呈波状, 并向上卷曲, 小叶扭曲, 叶脉坏死和严重束顶。感病植株的块茎变长, 某些品种还会出现尖头, 病薯上的芽眼增多, 凹陷, 有较重的芽眉, 也可能呈类似的纺锤块茎状。其通常会造成马铃薯减产20%~60%。PSTV很容易通过种薯 (苗) 、花粉、种子、机械摩擦或昆虫等多种途径传播[17]。

2 马铃薯病毒检测的方法

目前, 主要运用茎尖脱毒繁育脱毒种薯来防治马铃薯病毒病, 在脱毒种薯的繁殖过程中, 保证种薯质量的关键是对病毒进行快速准确的检测。现阶段, 马铃薯病毒检测的方法有指示植物法、酶联免疫吸附法、反转录-聚合酶链式反应等。

2.1 指示植物法

1929年, 美国的病毒学家Holmes首先发现了指示植物检测法[18]。其原理是对马铃薯上的某个病毒反应敏感, 只要被侵染, 指示植物可以超速的表现出明显症状。该方法简便可行, 对仪器、药品、深奥的理论知识要求低, 空间足够大、隔离条件良好、症状观察经验丰富遍可操作, 一般的研究单位、种薯生产公司均可掌握。但指示植物的培育需要占用很大空间、消耗很长时间, 且灵敏度不高, 这对于大批生产马铃薯试管苗的检测不适用。

此方法已在PVS、PVY、PVX等病毒株系的检测上广泛运用, 且用于分子生物学或血清学检测之前的初步鉴定[19]。吴凌娟[20]等在2003年用多种指示植物分离鉴定PVX, 结果说明千日红是一种不错的鉴定指示植物。常用的马铃薯病毒的指示植物及症状见表1。

2.2 反转录-聚合酶链式反应 (Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction, RT-PCR)

PCR是体外扩增DNA的一种技术, 绝大部分植物病毒是RNA病毒, 需要将RNA反转录成c DNA然后P C R扩增, 该方法是R T-P C R[21]。目前, 该技术已应用于PMTV、PLRV、PVA等的检测[22]。关翠萍[2 3用一步RT-PCR法检测出马铃薯中的PVY、PVX和P L RV, 证明了该方法比两步RT-P C R灵敏度高约1 0 0倍。Mumford[24]等用实时荧光RT-PCR法检测了马铃薯PMTV、TRV, 说明与常规RT-PCR检测比灵敏度分别提高了100和10 000倍左右。

现在检测马铃薯病毒用免疫试纸条法加RT-PCR法, 先用试纸条免疫捕获目标病毒, 再取下试纸条上出现的检测条带作为模板直接进行RT-PCR, 不仅省去了常规RT-PCR提取总RNA的繁琐步骤, 而且可以放大核酸信号, 提高检测灵敏度[25]。此项技术已在马铃薯PVX、PVY、PVS快速检测上得到应用。但同时, RT-PCR检测技术也存在些许问题, 表2对RT-PCR中一些常见问题和解决方案进行了总结。

2.3 酶联免疫检测法 (Enzyme-linked Immune Sorbent Assay, ELISA)

ELISA (Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay) 技术是荷兰学者Van Weeman、Schurrs和瑞典学者Engvall、Perman在20世纪70年代几乎同时提出的[26,27]。ELISA的基本原理见图1。

酶联免疫检测法具有高度的特异性;因酶在其与底物的反应中不被消耗, 表现出高度的灵敏性;酶标记的试剂制备容易, 结合物稳定, 而且有效期长;国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一[28,29,30]。但诸多因素均影响其取得成功, 如材料的选择、操作步骤的严谨等, 只要有一个因素改变即可能会造成其他条件的改变, 最终导致结果的准确性不够, 并且仍然存在不易检测含量极少的韧皮部病毒等缺陷。现阶段, 检测食品中所含农药的残留, 国内外有不少都用酶免疫技术。还有将其应用在现代医学和食品检验学中的报道也很多。如吴凌娟[31]等将直接酶联免疫吸附法和间接酶联检测法做了对比试验, 结果说明间接酶联检测法检测病毒的灵敏度较直接酶联免疫吸附法高。张仲凯[32]等在2003年用TAS-ELISA检测马铃薯脱毒苗, 并对几种检测方法进行比较, 比较得出TAS-ELISA的灵敏度远高于DAS-ELISA。

3 结论

本文介绍了几种常见马铃薯的病毒病, 归纳总结了马铃薯病毒检测的常用方法, 每种方法都有自己的优点和缺点, 马铃薯是宜粮、宜菜、宜饲、宜做工业原料的多种用途经济作物, 其退化的原因是病毒侵染, 所以, 具有快速、准确、灵敏的病毒检测方法, 增大对种薯的检测强度, 从源头上控制种薯质量, 实现脱毒种薯的最全脱毒, 是防治病毒侵染、提高产量的主要选择。现在防治马铃薯病毒病的发生主要是通过马铃薯病毒检测, 因此马铃薯病毒检测的准确和成本对马铃薯产业的发展有深刻的影响。马铃薯脱毒种薯繁育中应采用操作较为简单的TAS-ELISA技术检测马铃薯病毒, 有条件的单位可以采用TAS-ELISA和RT-PCR技术结合的方法检测马铃薯病毒, 科研单位应积极研究免疫试纸条结合RT-PCR法快速检测马铃薯病毒新方法, 提高检测灵敏度, 降低马铃薯病毒检测的费用。因此, 病毒检测技术还须向着降低成本与高灵敏度的方向发展。

摘要：马铃薯是无性繁殖作物, 常因病毒侵染而造成病毒在植株体内累积, 造成种性退化, 品质和产量下降。基于此, 讲述了马铃薯的几种常见病毒病, 并对常用的病毒检测方法进行评价。为保证马铃薯种薯质量, 促进马铃薯主粮化、优化农业结构提供技术指导。

关键词：马铃薯,病毒检测

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