时间分辨荧光分析法

时间分辨荧光分析法（精选6篇）

篇1：时间分辨荧光分析法

时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA）是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10^(-12)g/ml[1]，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。由于其高灵敏度，在临床上得到了广泛的应用，逐渐代替了放射免疫分析。[1]

在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。

解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。平时常用的稀土金属主要是Eu(铕）和Tb(铽），Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。

由于常用Eu作为荧光标记，因此增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理：利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在，使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂，在络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题，而使用了具有增强作用的新络合剂，因而有的试剂没有单独的增强剂。

随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法（TRFIA）具有越来越大的应用空间。

划时代的检测技术

放射免疫分析(RIA)，以其高度特异性灵敏度和实用性，吸引着各国的生物医学工作者，但操作中始终存在放射性污染、同位素半衰期短及试剂盒稳定性问题。为此，人们发展了一系列非放射性标记技术，如酶标记、化学发光、生物发光标记等技术，其中，时间分辨荧光免疫分析技术。由于灵敏度及线性范围明显优于其它技术，最为引人注目。

时间分辨荧光分析足以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超灵敏度检测技术，它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点。使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑。标记物

采用镧系元素（铕、钐、镝、铽）进行原子标记，较碱性磷酸酶、吖啶酯、生物素等大分子标记物优势明显：原子标记，标记物更多，检测更灵敏，对被标记物的生物活性和结构无影响原子标记，标记稳定性强 多种标记，一个测试，多个项目。

检测特点

标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光谱峰范围窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。

激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移，有利于排除特异荧光的干扰，增强测量的特异性。

标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。每一秒钟检测样品1000次，结果取平均值，有利于提高检测的准确性。

篇2：时间分辨荧光分析法

1 TRFIA的原理和优势

1.1 TRFIA的反应原理TRFIA是20世纪70年代末Wallac公司Soini和Kojola创立的一种非放射性标记免疫分析技术, 它是利用镧系元素, 如铕 (Eu) 、铽 (Tb) 、钐 (Sm) 和镝 (Dy) 的三价稀土离子及其螯合物作为示踪物, 代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质来标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞等, 在一定的反应体系 (目前常用的有抗原抗体反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等) 内发生反应后, 用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的特异荧光强度, 并与相对应的标准荧光曲线比对, 判断反应体系中分析物的浓度, 从而达到定量分析待测物的目的[2]。目前常用的反应模式有双位点夹心法和竞争法[3]。

1.2 TRFIA的优势TRFIA能够继放免、酶标、化学发光、电化学发光之后成为一种更新、更灵敏的检测方法, 主要取决于镧系元素及其螯合物作为标记物的独一无二的理化特性, 其优势有以下几点:

1.2.1镧系元素离子螯合物的荧光寿命长其衰变时间为传统荧光的103~106倍 (表1) [4]。由于镧系元素螯合物的荧光寿命达60~900μs, 样本中蛋白质的荧光寿命为1~10 ns, 普通荧光免疫中荧光团的寿命为1~100 ns, 所以在用时间分辨荧光仪测量荧光时, 可以适当地延迟一段时间, 待其他物质的荧光衰变后再测量, 所测的便是镧系离子螯合物标记物的特异性荧光。这就最大限度地克服了来自样品、试剂本身的荧光及散射光的干扰, 极大地提高了检测的灵敏度。

1.2.2激发光和发射光的Stokes位移大如铕 (Eu) 的发射光波长为613 nm, 激发光波长为340 nm, 其Stokes位移为273 nm, 而普通荧光物质的Stokes位移最多也只有几十纳米。因此, 在某一波长测定样品荧光时, 可以通过滤波片或分光计消除激发光和散射光的干扰。

1.2.3镧系元素离子螯合物的荧光特异性强其激发光谱带宽 (300~500nm) , 发射光谱带窄 (615±5nm) , 可使仪器调整在极窄的波长范围内测定荧光信号, 从而极大地降低来自背景光的各种干扰[5]。

1.2.4标记物体积很小且稳定一般是原子标记, 标记后不会影响被标记物的空间主体结构, 既保证了被检测物质的稳定性, 又可实现多位点标记, 使得一个试剂盒能够同时检测两种或多种项目。标记物稳定, 就可以对标记物进行多次激发, 通过对每次激发的荧光信号累加后取平均值的办法可大大减少偶然误差, 提高检测准确度。镧系离子标记物可保存1~2年, 克服了同位素、酶标等不稳定的缺点。

1.3常用螯合剂现常用的螯合剂有: (1) 多胺多羧类螯合剂, 如乙二胺四乙酸 (EDTA) 、二乙三胺四乙酸 (DTTA) 和二乙三胺五乙酸 (DTPA) , 主要用于液相测定体系, 又称为解离一增强镧系荧光免疫分析; (2) 菲啰啉类螯合剂, 如4, 7-二 (氯磺酰基苯基) -1、10-菲啰啉-2, 9-二羧酸 (BCPDA) , 主要用于Cyber Fluoro体系; (3) 水杨酸类螯合剂, 如DTPA-p AS-Tb (p AS-对苯基水杨酸) ; (4) β-二酮类螯合剂, 如噻吩甲酰三氟丙酮 (TTA) 、三甲基乙酰三氟丙酮 (PTA) 等; (5) 联吡啶类螯合剂。

1.4镧系离子标记方法[1]

1.4.1一步标记法又称为直接标记法, 先将稀土离子与螯合剂结合, 再与抗原或抗体结合。简要步骤如下:取10 mg纯化好的抗体, 加入相应量的Eu-N2-[p-异硫氰酸-苄基]-二乙烯三胺乙酸 (Eu3+-DTTA) , 用Na OH调p H值至9.0, 4℃反应过夜;反应液上Sephadex G-50, 280 nm下收集蛋白峰, 测出Eu3+浓度, 计算标记率;加入BSA至1 mg/m L, 0~4℃保存。

1.4.2两步标记法将抗体Ig G先与螯合剂结合, 再与镧系离子螯合。步骤:取1 mg纯化好的抗体, 加入260μg二乙烯三胺五乙酸 (DTPA) (Ig G∶DTPA=1∶200) , 用Na OH调p H值到7.0, 置高速混匀器上混匀1 min, 室温下继续反应30 min;用50 m M的柠檬酸 (p H值为6.0) 透析反应液, 去除多余的DTPA, 取25~30μL Eu Cl3 (33 mmol/L) 加入到已透析的Ig G-DTPA中, 室温反应30min;反应液上Sephadex G-50, 280nm下收集蛋白峰, 测定Eu3+浓度, 计算标记率, 0~4℃下保存。

1.4.3多标记及双标记TRFIA根据各镧系离子的荧光寿命不同及波长差异很大的特点, 可以对多种标记的镧系离子的荧光进行同时测量。多标记TRFIA是指一个统一的反应体系中有两种或两种以上的待测物与相应特异性配体进行结合反应, 在引入两种或两种以上相对应的镧系离子标记物后, 通过时间分辨荧光测量, 将各种待测物的结果计算出来[6]。在双重标记分析中, Eu3+和Sm3+、Tb3+和Eu3+是两对常用的镧系离子。

2 TRFIA在兽医学中的应用

TRFIA专门用于兽医上的检测目前还很少见, 用于食品安全检测及人畜共患病检测的相对较多。

2.1在真菌毒素检测中的应用[7]当前真菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、T-2毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等, 这些毒素都具有较强的致癌性。对真菌毒素的检测, 目前常用TLC法、HPLC法等, 但不同程度地存在着样品前处理过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点。用TRFIA技术检测真菌毒素, 灵敏度高, 检测范围宽, 重复性和稳定性好, 所需时间短, 分析系统高度自动化, 是一种简便、快速、经济、稳定且可大批量检测的方法。各种主要真菌毒素的TRFIA检测限详见表2。

2.2在兽药残留检测中的应用兽药残留分析由于具有待测物质浓度低, 浓度差异大, 样品基质复杂, 干扰物质多, 兽药残留种类及代谢产物多样等特点, 要求其测定技术应具有灵敏度高, 线性范围宽, 特异性强, 高通量等特点。目前常用的方法有酶免疫分析法 (EIA) 、荧光免疫分析法 (FIA) 、胶体金免疫分析法 (CGIA) 、微生物学分析法、气相色谱 (GC) 、高压液相色谱 (HPLC) 、色谱-质谱联用等方法。但这些方法都存在样品前处理复杂、费时、费力、费钱的缺点。而TRFIA是一种新兴检测方法, 对兽药残留检测具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、安全、样品前处理简单方便等优点, 应用前景看好。Bacigalup等[14]用Eu3+-BCPDA标记单抗兔Ig G, 建立了不同脂肪含量的生牛奶中氨苄青霉素的TRFIA, 结果得出其灵敏度为1 ng/m L。宓晓黎等[5]利用TRFIA检测环丙沙星, 得出检测灵敏度为0.002μg/L, 比ELISA的灵敏度高了3个数量级。李丽华等[16]用TRFIA检测环丙沙星, 其检测限为0.5μg/L, 线性范围 (IC20~IC80) 为1.14~28.85μg/L, 该法可用于检测蜂蜜和牛奶中的环丙沙星。王超等[17]利用TRFIA检测莱克多巴胺 (RAC) 残留, 其灵敏度为0.01ng/m L, 可应用于食品检测。

2.3在寄生虫病检测中的应用TRFIA目前主要用于人的人畜共患寄生虫病检测。既然可用于人的检测, 那么相信在不久的将来, 会有动物寄生虫病TRFIA检测出现。Aceti等[18]用TRFIA诊断包虫病 (棘球蚴病) , 与ELISA相比, TRFIA的阳性检出率达95.1%, 高于ELISA法的81.4%;在定位囊肿的敏感性方面, TRFIA也较ELISA高。Kapel等[19]用夹心法TRFIA检测抗隐孢子虫类抗体, 结果显示:该法的重复性和特异性均很好, Ig A、Ig M和Ig G的批内变异系数仅为5.1%、4.6%和5.8%, 同样的粪便样本的批内变异系数也只有9.4%、10.5%和12.2%, 特异性为100%, 敏感性分别为83%、67%、33%。

2.4在致病微生物检测中的应用TRFIA已广泛应用于人多种传染病的诊断和研究, 包括甲肝病毒 (HAV) 、乙肝病毒 (HBV) 、脑炎病毒、流感病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等。Yu等运用TRFIA技术测定苹果汁中大肠杆菌O157∶H7的数量, 结果最低检测量达到了10 CFU/m L, 并且当大量的大肠杆菌K-12共存时, 也不会影响大肠杆菌O157∶H7的检测灵敏度。用TRFIA检测动物致病性细菌和病毒的研究还在初期起步阶段, 相信不久将有商业化产品面世。

3结语

TRFIA是近些年新兴起来的一种超微量快速免疫检测技术, 它集合了酶标记技术、放射标记技术和同位素标记技术的优点, 具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、无污染, 测定范围宽, 试剂盒寿命长, 操作简单和非放射性等优点, 越来越受到各领域科研工作者的关注, 应用范围也已渗入多个领域。国外目前已有多种商品化试剂推出, 国内在人医学方面已开展多项检测并成功地应用到了临床。在兽医领域, 用TRFIA检测兽药残留、真菌毒素等正逐步得到重视和应用, 相信TRFIA不久将成为微量检测动物病毒病、细菌病等致病微生物的重要手段。

摘要：时间分辨荧光免疫分析技术是一种新型的超微量免疫标记分析方法, 集酶标记免疫分析和放射免疫分析等优点于一身, 具有无放射性、无背景光干扰、灵敏、稳定、线性范围宽、操作简便、分析速度快等优点, 已广泛应用于临床医学检测、食品安全快速检测等领域。本文就时间分辨荧光免疫分析的原理及在兽医学中的应用作一综述。

篇3：时间分辨荧光分析法

[关键词] 时间分辨荧光免疫法；酶联免疫吸附试验；先天性甲状腺功能减低；新生儿

[中图分类号] R722.1   [文献标识码] B   [文章编号] 2095-0616（2012）04-124-02

先天性甲状腺功能低下（CH）是我国《母婴保健法》规定的新生儿疾病筛查的项目之一，目前对CH的筛查方法很多，每种方法的原理各不相同，筛查的阳性检出率也存在巨大差异。同时本病在我国新生儿发病率较高，对儿童智力发育影响很大，临床上一般建议越早开始治疗，远期预后越好。因此选择灵敏度高、操作简便的筛查方法至关重要。早期一般采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行筛查，随着技术的不断发展和更新，逐渐出现时间分辨荧光分析法（TRFIA），是近十余年来最灵敏的微量分析技术之一。本研究2009年1月~2010年5月和2010年6月～2011年12月分别采用上述两种方法共对40 008例新生儿进行了先天性甲状腺功能低下疾病筛查，并比较两种方法筛查结果，进一步探究时间分辨荧光免疫法在新生儿先天性甲状腺功能减低筛查中的临床应用优势。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2009～2011年在全县新生儿筛查网络医院、保健院出生的新生儿，共筛查40 008例新生儿。

1.2 入选标准

（1）在当地筛查定点网络医院、保健院出生的新生儿；（2）上述患者均符合新生儿先天性甲状腺功能减低的筛查标准[1-2]。排除标准：（1）畸形儿；（2）早产儿等。

1.3 血片采集

出生72 h，吃足6次以上奶 （或混合奶）的新生儿，采取足跟末稍血2滴，滴于S&S903专用滤纸片上，渗透正反两面，形成2个直径约0.8 cm的血斑，室温下自然干燥，规范填写姓名等基本信息，放入塑料袋，置4℃冰箱保存待用.

1.4 检测方法[3]

1.4.1 ELISA组 2009年1月～2010年5月的19 728例新生儿采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）进行检测，试剂由USA GBI公司提供，酶标仪为B10-RADmodel550。

1.4.2 TRFIA组 2010年6月～2011年12月的20 280例新生儿采用时间分辨荧光免疫法（TRFIA法）（又名离解扩增镧系荧光免疫法，DELFIA））进行筛查，试剂和仪器均由ThermoLabsystems（雷勃）公司提供，仪器为Labsystems-asent荧光分析仪。

1.5 统计学处理

Excel建立数据库，采用SPSS18.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法阳性（TSH≥5 mIU/L）检出情况比较

ELISA组从19 728例新生儿中筛查出8例阳性患儿，其阳性检出率为0.04%；TRFIA组从20 280例新生儿中共筛查出20例阳性患儿，其阳性检出率为0.10%，两种检测方法的阳性检出率比较差异有统计学意义（x2=12.38，P＜0.05），即TRFIA法的阳性检出率明显高于ELISA法。见表1。

表1  两种方法阳性检出情况比较

组别 样本数阳性阳性率（%）

ELISA 19 728 8 0.04

TRFIA 20 280 20 0.10

2.2 两种方法正常新生儿足跟全血TSH频数分布情况比较

ELISA法的≥5 mIU/L比率、97%及99%百分位值分别为16%、7.62 mIU/L、13.28 mIU/L；TRFIA法的分别为25%、4.63 mIU/L、8.68 mIU/L；两种方法全血TSH≥5 mIU/L比率比较，差异有统计学意义（x2=22.6，P＜0.05）。即TRFIA法的≥5 mIU/L比率明显高于ELISA法。见表2。

表2  两种方法正常新生儿足跟全血TSH频数分布情况比较

组别样本数P97（mIU/L）P99（mIU/L）≥5 mIU/L

ELISA19 7207.6213.283155（16%）

TRFIA20 2604.638.685065（25%）

x222.6

P＜0.05

3 討论

先天性甲状腺功能低下简称先天性甲低，是儿童时期常见的、多发的智残性疾病，我国新生儿发病率约为1/5 000[1]。大量医学资料表明，在新生儿2个月内发现并及时治疗，终身服药，智力可维持正常。随着年龄的增加，病情加重，预后越差。先天性甲状腺功能低下症临床表现为智力迟钝、生长发育迟缓及基础代谢低下 [4]。一般越早进行治疗，远期预后越好。由于先天性甲低发病率高，在生命早期对神经系统的损害较重，且其治疗容易、取得的疗效满意，因此早期诊断、早期治疗对于本病的预后起着至关重要的作用。我国1995年6月颁布的母婴保健法已将该病种列入筛查的疾病之一。多收集出生后24～72 h的新生儿血液滴于滤纸片上，检测促甲状腺素（TSH）浓度作为初筛指标，TSH≥5 mIU/L为异常，TSH检测异常者召回再检测外周静脉血清TSH、FT3、FT4的浓度以确诊。该法采集标本简便，假阳性和假阴性率较低，能为患儿早期发现、早期确诊，减轻家庭和国家负担较好的防治措施。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。由于ELISA具有快速、简便、易于标准化等优点，使其在早期新生儿先天性甲状腺功能低下筛查中得到广泛应用，但灵敏度较低，容易漏检，造成严重后果。随着技术的不断发展和更新，逐渐演变出了时间分辨荧光分析法（time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA），此检测方法是近十年在荧光分析基础上发展起来的一测微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术之一。主要利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，大幅度提高了光学分析的灵敏度[5]。

本研究ELISA法和TRFIA法的阳性检出率分别为0.04%和0.10%，两种检测方法的阳性检出率差异有统计学意义（x2=12.38，P＜0.05），TRFIA法的阳性检出率明显高于ELISA法；ELISA法和TRFIA法≥5 mIU/L的比率分别为16%和25%，差异有统计学意义（x2=22.6，P＜0.05）。综上所述， TRFIA法在筛查新生儿先天性甲状腺功能低下疾病中的阳性检出率比ELISA法高，可减少甲低的漏检，减少CH所致的智力障碍儿童发生，应在临床上推广使用。

[参考文献]

[1] 顾学范，王治国.中国580万新生儿苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减低症的筛查[J].中华预防医学杂志，2004，38（2）：99-102.

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[3] 王慕逖.儿科学[M].第5版.北京：人民卫生出版社，2003：432-437.

[4] 胡晞江，肖芳，索庆丽，等.新生儿先天性甲状腺功能减低症筛查10年回顾[J].中国妇幼保健，2007，22（12）：1612-1614.

[5] 王惠，秦良谊，赵文彬，等.TRFIA法筛查新生儿先天性甲状腺功能减低症的质量评估[J].职业与健康，2006，22（22）：2002-2003.

（收稿日期：2012-01-10）

篇4：时间分辨荧光分析法

1 资料和方法

1.1 标本来源

门诊皮肤性病科初诊梅毒筛查及复诊梅毒复检患者;住院手术输血前检测患者血清26份, 同时用TRFIA、TPPA和RPR方法检测, 并且按照实验室规定SOP文件严格操作。

1.2 试剂来源

运用TRFIA、TPPA法检测梅毒特异性抗体, RPR法检测梅毒非特异性抗体。TRFIA法运用上海新波公司提供的仪器和仪器专用试剂;TPPA试剂来自日本富士株式会社;RPR试剂购自兰州生物制品研究所, 质控品购自上海仪器厂家提供供。试剂和质控品都在效期之内。

1.3 测定基本原理

TRFIA基本原理是蛋白质、激素、多肽、抗体等用镧系金属离子标记抗原和抗体, 并与时间分辨荧光仪测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术, 对液体标本中微量物质进行定量测定最后产物的荧光强度;具有灵敏度高、发光稳定、荧光寿命长、自然荧光干扰少, 标准曲线范围宽等特点目前已广泛应用临床。TPPA法是在室温下在U型板加稀释血清25μL, 分别在3、4孔加未致敏和致敏血球颗粒, 封板静止2h;RPR法是在反应板加血清50μL再滴加心脂抗原振荡10min。

1.4 统计学处理

采用χ2检验, P<0.05为差异而统计学意义。

2 结果

TRFIA实验26份血清标本阳性11例, 阳性检出率12.7%;TPPA实验26份血清标本阳性11例, 阳性检出率12.5%;RPR实验26份血清标本滴度出现颗粒阳性者9例, 阳性检出率9.5%。

3 讨论

梅毒病程漫长, 早期侵犯生殖器和皮肤, 晚期侵犯全身器官, 并产生多种多样的症状和体征, 通过性行为在人群中相互传播, 危机下一代, 也有极少数患者通过接吻、哺乳。接触有传染性损害病人的日常用品而被感染, 危害性大因此必须予以高度重视。

TRFIA法检测同TPPA、RPR法相比TRFIA检测梅毒特异性抗体适用于批量梅毒生物学假阳性的排除和患者的初步诊断。对疗效判断和预后评价应用可能受一定限制[3]。

TPPA法是在TPHA试剂基础上建立起来的一种新试剂, 具有操作简单, 敏感性强, 特异性高的特点, 所以大多实验室将其用作确证试验, 业界认为TP-ELISA检测效果类同TPPA[4]。

RPR (快速血浆反应环状卡片试验) 是20世纪80年代问世的非特异性抗体, 主要用于二期梅毒诊断。对一期梅毒阳性率在75%~85%, RPR可用于梅毒普查, 抗体过量易出现假阴性反应, 并且此方法必须手工操作, 肉眼观察结果, 出现阳性必须用TPPA或TRFIA法进一步确证, 而且存在一定生物学阳性[5], 是梅毒治疗预后疗效观察、复发或再感染的检测方法, 患者经过治疗后反应素消失或阴转, 因而用于梅毒的诊断和疗效判断, 可是有时也需用特异性抗体测定试验排除因其它疾病, 如结核、类风湿、红斑狼疮、麻风等血清中也含有抗磷脂抗体的因素所致的生物学假阳性。

以上试验充分的比较了梅毒血清学三种检测方法的可靠性, 同时对26份血清标本用TRFIA法和TPPA法检测特异性抗体, 以及用RPR方法检测非特异性抗体。TRFIA检测与TPPA检出阳性符合率几乎100%。符合程度比较高。同时应用TRFIA法检测避免了用TPPA检测时由于用手工和肉眼观察时的室内光线而出现遗漏, 得出结论两种检测方法可以互补存在, 同时发展。RPR检出阳性9例, 检出阳性率9.5%, 比较与特异性抗体阳性检出率, 差异明显, 时间分辨荧光免疫分析仪的应用结果表明, 在检测梅毒特异性抗体时, 操作流程比TPPA检测更安全、加样更准确、判读灵敏度高, 而且时间分辨荧光免疫分析仪整体智能化程度较高, 减轻工作人员的负荷, 在今后的实验室发展趋势中会更加适应。

摘要：目的:探究梅毒螺旋体感染者在血清中的免疫学标志物, 实验室应用时间分辨荧光免疫法测定梅毒螺旋体特异性抗体S/CO值与TPPA颗粒凝集法, 及梅毒非特异性抗体RPR法结果的灵敏度、吻合程度、特异性。以掌握梅毒检测方法适用性和临床诊断意义。方法:门诊及住院26例就诊患者分别用TRFIA、TPPA、RPR法同时测定含量及滴度, 比对检测结果 的不同。结果:TRFIA测定大于参考值11例, 阳性率12.7%;TPPA阳性11例, 阳性率12.5%;RPR阳性9例, 阳性率9.5%。结论:时间分辨荧光法与TPPA法联合应用对输血筛查;临床诊断及预后疗效利于血液质量的保证, 质量成本也更为经济。

关键词：时间分辨荧光免疫技术,梅毒抗体

参考文献

[1]郭兑山, 宁平, 方德强, 等.梅毒螺旋体抗体IgG ELISA和RPR试验的比较[J].中国输血杂志, 2001, 14 (2) :88

[2]陈华根.梅毒的实验室诊断及临床应用[J].实用医技杂志, 2010, 17 (3) :245-246

[3]李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京:人民军医出版社, 2005, 163

[4]叶顺章, 邵长庚, 主编.性病诊疗与预防[M].北京:人民卫生出版社, 2002, 11-12

篇5：氯噻啉时间分辨免疫分析方法研究

关键词：氯噻啉 多克隆抗体 时间分辨免疫分析

中图分类号：S482 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）24-0000-00

氯噻啉（imidaclothiz）是我国公司自主研发一种新烟碱类杀虫剂，与常规杀虫剂没有交互抗性，因而可用于抗性治理，广泛应用于那些对有机磷类、氨基甲酸酯类、除虫菊酯类已产生抗性的农林业害虫的防治[1]。由于其具有高效、广谱、低毒等优点，氯噻啉使用量日益上升，不合理的使用也经常出现，对环境造成很大压力，因此，研制快速廉价、灵敏度高、稳定性好和筛通量大的检测氯噻啉残留的常规方法，加强对氯噻啉药物的检测和控制是一项刻不容缓的工作。

目前，有关氯噻啉残留检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC）[2-4]。但前处理过程比较繁琐，检测结果受样品净化、浓缩等步骤的影响，不适合进行批量样品的快速检测。而免疫分析技术具有很高的精确度、更灵敏的反应，更强的特异性、不高的技术要求、更短的检测时间和大批量测定等优点，越来越受到人们的重视。抗氯噻啉农药的多克隆抗体的酶联免疫分析技术（ELISA）也有报道[5]，然而该方法检测灵敏度不太理想。时间分辨免疫分析技术具有高灵敏性、高选择性、快速等优点，可以弥补普通ELISA免疫分析技术灵敏度的不足。本研究建立了氯噻啉的TRFIA残留检测方法，为环境与食品中痕量氯噻啉残留高灵敏检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

96孔聚苯乙烯荧光板（江苏省原子医学研究所）；95%氯噻啉原药（南通江山农药化工股份有限公司）；卵清蛋白（OVA）、正三丁胺、氯甲酸异丁酯（Sigma公司）；Eu3+标记盒为PerkinElmer公司产品；荧光增强液，（江苏省原子医学研究所）；碳酸盐缓冲液（CBS）：0.05M，pH 9.6；磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01M，pH 7.4；氯噻啉多克隆抗体为本实验自行制备；二甲亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸二氢钾、氢氧化钾等试剂均为分析纯。

1.2包被原的合成

氯噻啉的半抗原合成参照文献[5]，将合成的半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联通过混合酸酐法制备包被抗原。反应液用PBS在4℃下透析3天。根据三者在280 nm的摩尔吸光系数（ε）估算半抗原与载体蛋白的偶联比[10]：结合比=（ε偶联物-ε载体蛋白）/ε半抗原。

1.3 包被板的制备

包被抗原用0.05 M pH 9.6 CBS溶液稀释至5 μg /mL，加入到96孔微孔板中（100 μL /孔），4℃包被过夜，弃去包被液，加入封闭液，每孔200μL，37 ℃孵育2h，弃去封闭液，真空抽干，-20℃冷冻保存。

1.4 Eu3 + 标记抗体的制备

取适量的PBS溶解的抗氯噻啉的抗体，在4℃下碳酸盐缓冲液（0.05 M，PH 8.5）透析2次，每次24h，目的是除去溶液中NaN3并且转换成碳酸盐缓冲液。在碳酸盐缓冲液环境中用DTTA-Eu3+标记抗体。取0.5 mg上述透析的抗氯噻啉的抗体加入含0.2 mg 的DTTA- Eu3+的小瓶中，室温下磁力搅拌反应24 h。将Eu3 +标记抗体溶液加入到Sephadex G-50层析柱中，用含0.9% NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱。收集层析柱流出液（ 1mL/管），逐管测量其吸光值（A280 nm），合并峰管。以Eu3+标记试剂盒说明书提供的方法测定并计算抗体标记率。

1.5 回收率的测定

河水经过滤，添加不同浓度（0.05-0.5 mg/L）的氯噻啉标样，用含甲醇的PBS稀释，直接用于TRFIA测定。称取10g土壤，添加不同浓度（0.05-0.5 mg/kg）的氯噻啉标样，静置一段时间，加入40mL二氯甲烷进行超声提取，4000 r/min离心。取上清液20 mL减压浓缩，用含甲醇的PBS定容到10mL。每个处理设3个重复，各设一个空白对照，用建立的TRFIA法对样品进行分析。

1.6 分析测定

取准备好的酶标板，加入50μL的氯噻啉标准品或处理好的样品溶液到酶标孔中，加Eu3 + 标记抗氯噻啉抗体（50 mmol/L pH 7.4的PBS稀释）100μL，室温振荡孵育30 min，用含0. 1% 吐温-20的Tris-HCl（50 mmol /L pH 7.8）洗涤液洗6次。加200μL 增强液，振荡孵育5 min 后，用荧光检测仪进行测定。

2结果与分析

2.1包被原的鉴定

对氯噻啉半抗原、OVA及偶联物进行紫外全波长扫描，发现偶联物的紫外吸收光谱具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征，说明偶联成功，如图1所示。根据它们在280 nm波长下的摩尔吸光系数估算得到包被原的结合比为8.5：1。

2.2 Eu3 +标记率

Eu3+标记抗体溶液经Sephadex G-50层析，用离心管收集出现的第1洗脱峰，以PerkinElmer公司提供的Eu3+标准为参考，计算得出第1洗脱峰的Eu3+含量为22.4 μmol /L，蛋白质含量为4.7 μmol /L，即平均每个免疫球蛋白分子上标记了4.8个Eu3 +。

2.3标准曲线的建立

各参考标准品浓度以及荧光值建立氯噻啉的标准曲线，曲线方程为Y=-2.292X-3.0874， IC50为0.0447 mg/L，最低检测限为0.005 mg/L。 图2表明本试剂具有良好的剂量-反应线性关系。

2.4 抗体的特异性

用TRFIA在相同的条件下测定氯噻啉和结构类似烟碱类杀虫剂对抗体的交叉反应，计算各自的IC50和交叉反应率CR（表1），结果表明得到的抗体对氯噻啉有较好的特异性，与大部分杀虫剂的几乎没有交叉。

2.5 回收率测定

在河水和土壤中添加不同浓度的的氯噻啉标样，按照TRFIA进行回收率测定，检测结果见表2。在水和土壤中分别添加氯噻啉标准溶液，平均回收率为81.7%～103.8%，变异系数为3.9%～10%，符合农药残留检测要求。

3 讨论

本文基于多克隆抗体建立了氯噻啉TRFIA免疫分析方法。其灵敏度（IC50）较先前报道的ELISA[5]有了很大的提高（大约5倍），方法的抑制中浓度可达到0.0447 mg/L。可见TRFIA法检测氯噻啉比ELISA 法灵敏度上具有明显优势。时间分辨荧光免疫分析具有示踪物稳定、无放射性污染、灵敏度高、操作简便、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、标记物储存时间长等优点[6-9]，使得试剂标准曲线飘移小，更提高了试剂的稳定性和准确性。在研究抗体标记和发光过程中发现：抗体的浓度与标记效率和本底发光值成反比，高浓度标记抗体，能够提高灵敏度和降低本底，使我们建立方法所需要。本文建立的氯噻啉-TRFIA 法，与方松等人的报道在灵敏度上有了很大的提高，可以用于环境与食品中痕量氯噻啉的检测需求。

参考文献

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[2] 贺敏，贾春虹，余平中，等.水稻中氯噻啉的高效液相色谱残留分析方法[J].农药，2009，48（4）： 285-287.

[3] 贺敏，贾春虹，朱晓丹 等.40%氯噻啉水分散粒剂在稻田环境中的残留动态[J].农药，2010，49（1）： 50-53.

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[7] 武学成，何林，周克元.时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用[J].医学综述，2006，12 7）：434-436.

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[9] HEMMIL I.Lanthanides as probes for time-resolved fluorometricimmunoassay[J].Scand J Clin Lab Invest，1988，48 （5）：389-399.

*通讯作者：洪霞，E-mail：hongxia19862@163.com

篇6：时间分辨荧光分析法

1 材料与方法

1.1 标本

晨空腹, 带盖无菌管抽取静脉血共200份, 分离血清后置-20℃保存, 并于1周内检测。

1.2 乙肝五项的定量检测

采用美国PE公司的Wallac1235全自动时间分辨荧光免疫分析仪。广州达瑞抗体生物技术有限公司提供时间分辨HBs Ag、HBs Ab、HBe Ag、HBe Ab、HBc Ab诊断试剂盒。其检测过程及结果输出均为自动化操作。每个标本测定2次, 结果取2次的平均值。

1.3 HBV-DNA的定量检测

采用美国PE公司生产的5700型实时定量PCR仪。上海科华生物技术有限公司提供HBV-DNA定量试剂盒。操作严格按照说明书进行。

1.4 统计方法

将200份样本按照乙肝五项时间分辨免疫检测的结果分为5组, 每一组与相应的HBV-DNA的定量检测结果进行比较分析。

2 结果

乙肝五项时间分辨免疫检测与HBV-DNA定量检测结果的比较分析见表1所示。

3 讨论

乙肝病毒标志物检测是诊断HBV感染的免疫学方法, 是反映机体在病毒入侵后机体所作出的反应, 以及反应的程度和反应的结果。HBV-DNA测定则是一种病原学的检查, 能反映患者感染的状态、是否具有传染性和传染性的强弱。时间分辨荧光免疫技术 (Timeresolved fluorescence immunoassay, TRFIA) 是以稀土离子为标记物的检测技术, 它能将非特异信号降低到可忽略的程度, 加上本身的高灵敏度, 因而可达到极高的信噪比, 大大超过了ELISA的检测灵敏度, 非常适合于乙肝五项的检测分析, 如HBs Ag的灵敏度可以达到0.0 6 n g/m L。由于H B V是D N A病毒, 因此HBV-DNA的检测是衡量乙肝传染性的最精确的指标, HBV-DNA阳性即反映有完整的病毒颗粒的复制, 是判断患者具有传染性的直接证据。理解血清学免疫分析与HBV-DNA检测之间的复杂关系对于临床判断具有重大的指导意义。

由表1可以看出, 大三阳76例HBV-DNA检测阳性75例, 检出率为98.7%, 而且定量值也比较高, 即这些患者体内HBV具有较高的复制水平, 是具有传染性的重要标志。由此可以表明, 传统上认为大三阳患者具有较高的传染性的说法较为合理的, 不仅如此, Biswas等人[2]指出, 在血清转换的早期, 血清中HBs Ag的含量与HBV-DNA的拷贝数水平之间具有极好的相关性 (r2=0.95) 。小三阳59例HBV-DNA检测阳性27例, 检出率为67.8%。小三阳血清中检出HBV-DNA的阳性率要远低于大三阳血清的HBV-DNA检出率, 而且其拷贝数也低于后者, 但是小三阳病人仍然具有较强的传染性, HBe Ab的存在并不表示患者体内没有病毒复制, 因此传统上以e系统的血清转换作为判断病毒复制、有无传染性的标准是不可靠的。另外, Kuhns等人[3]的研究表明在急性感染末期或慢性感染期间HBs Ag的含量与HBV-DNA的拷贝数水平之间并没有明显的相关性, 随后, 此论断被Allain等人[4]证实。不论是大三阳或是小三阳, HBs Ag阳性情况下, 都存在一部分样本中HBV-DNA检测阴性或者说拷贝数水平较低 (1 0 2拷贝) , 一般认为此类患者仍是处于慢性H B V感染[5]。HBc Ab1项阳性一般认为是既往感染, 处于恢复期, 此时HBs Ag检测不出, 表1显示仍有1例HBV-DNA检测为阳性, 但拷贝数较低, 出现这种情况的原因一部分观点认为是病毒变异导致低水平复制或是HBs Ag的抗原决定簇发生变化导致检测不出HBs Ag, 尽管如此, 大部分学者仍然认为并不是病毒变异, 只是慢性携带者, 因为如果是病毒变异, 通常血清中的HBV-DNA的含量水平仍会较高[6~7]。

过去一直认为HBs Ab是人的保护性抗体, 仅HBs Ab阳性提示机体感染乙肝病毒后已康复, 或接种过乙肝疫苗至今仍有免疫力。然而存在HBs Ab而不被乙肝病毒感染是不科学的, 尽管表1结果中HBs Ab阳性31例没有1例HBV-DNA检测阳性, 这是受到标本数量的限制的原因, 并不能证明患者目前没有HBV感染[8]。五项全阴的样本14例也没有检测出HBV-DNA阳性, 同样, 认为全阴性是未感染乙肝病毒这一看法也是不科学的, 其中除了试剂灵敏度和特异性原因外, 可能的原因是HBs Ag确已清除, 但HBV-DNA仍少量复制。

综上所述, 时间分辨免疫荧光检测乙肝五项与HBV-DNA定量检测的结果之间具有极密切的内在联系, 单独利用其中一种方法的检测结果来判断HBV感染、传染性及HBV是否在体内复制存在一些缺陷。事实上, 多数情况下两种方法互补结合, 能更准确、全面的反映和监测患者体内HBV的活动情况, 对于研究乙肝病毒致病机理、预后的疗效观察及分子流行病学研究具有极为深远的意义。上述实验结果同时也表明, 用于HBV的血筛试剂一定包括两个类别: (1) 高灵敏的免疫学标志物检测试剂; (2) 高灵敏度的HBV-DNA检测试剂, 这两种不同方法学的试剂需要同时运用, 缺一不可。目前, 发达国家对于HBV血液筛查正是运用了这两种方法学进行同时检测。

摘要：目的研究乙肝血清标志物时间分辨免疫定量检测结果与HBV-DNA定量之间的关系。方法将200例血清标本同时采用时间分辨免疫荧光定量和实时荧光定量PCR技术, 对乙肝五项含量和HBV-DNA含量分别进行检测, 按照不同的乙肝病毒标志模式情况分组后, 进行乙肝病毒标志物与HBV-DNA的分析研究。结果乙肝病毒标志物HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组HBV-DNA检出率为98.7%, HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组检出率59.3%, HBcAb单项阳性组检出率50%, HBsAb阳性组检出率0, 全阴性组检出率0。结论时间分辨免疫荧光分析与HBV-DNA关系密切, 两者联用能更好的满足临床需求。

关键词：时间分辨免疫荧光分析,实时荧光定量PCR

参考文献

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[4]Allain JP, et al.Lack of correlation between hepatitis B surface antigen and hepatitis B virus DNA levels in blood donors[J].Transfusion, 2005, 45:1039～1040.

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