论文题目：关于多巴胺转运体调控可卡因运动刺激及奖赏效应的神经解剖学研究
摘要：第一部分鉴定利用重组腺相关病毒载体将野生型多巴胺转运体导入可卡因非敏感性基因敲进小鼠目标脑区的可行性与有效性 目的：鉴定可卡因对实验用可卡因非敏感性基因敲进小鼠（cocaine-insensitive dopamine transporter knock-in mice, DAT-CI mice）行为学效应的稳定性,检验重新导入的野生型多巴胺转运体（dopamine transporter, DAT）在DAT-CI小鼠目标脑区内的表达与功能。 方法：选取DAT-CI小鼠10只,野生型（wild-type, WT） C57BL／6J小鼠10只,体重20-30g,分别作为DAT-CI组与WT对照组,建立可卡因条件性位置偏爱模型,该模型可同时评估可卡因所致的快速移动（hyperlocomotion）及奖赏（reward）效应。条件性位置偏爱实验（conditioned place preference, CPP）包括3个阶段：训练前位置偏爱测试1天；可卡因／生理盐水训练阶段8天：训练后位置偏爱测试1天。训练前位置偏爱测试实验箱由不同的视觉及触觉线索（cue）区分为中间隔间及2个双侧隔间共3个彼此相通的区域,将小鼠从中间隔间放入,任其在实验箱中自由活动30min,Anymaze视频追踪系统自动记录实验动物在3个区域的停留时间及移动距离,位置偏爱值用小鼠在伴药区和非伴药区停留时间的差值表示,伴药区由自行设计的软件计算决定,使每组小鼠给药前的位置偏爱值之和趋近于零以减小组内数据离散率。药物训练阶段共8天,伴药箱和非伴药箱分别用训练前测试对应的线索布置,实验箱三个隔间彼此相通且在视觉触觉上完全相同。偶数天给予4组小鼠腹腔注射可卡因201ng/kg,奇数天给予4组小鼠腹腔注射相同体积生理盐水,Anymaze视频追踪系统自动记录实验动物30min内的移动距离,作为评价运动刺激的指标。训练后位置偏爱测试同训练前。CPP分数取实验动物在伴药区停留的时间（conditioned stimulus,CS+）减去非伴药区停留时间（unconditioned stimulus,CS-）的差值,药物训练前与训练后CPP分数的比较用来评价可卡因的奖赏效应。选取DAT-CI小鼠6只,采用脑立体定位技术在一侧纹状体注射野生型多巴胺转运体重组腺相关病毒载体（recombinant adeno-associated virus containing wild-type dopamine transporter, rAAV-DATwt）,术后恢复4周后,处死其中3只小鼠并以4%多聚甲醛灌注内固定,制作新鲜脑组织冰冻切片,用免疫组化DAB法显影AAV-DAT,叭的表达范围。取另外3只小鼠利用快扫描循环伏安法（fast scanning cyclic voltammetry, FSCV）测定双侧纹状体内多巴胺的释放与再摄取。采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差（x±s）表示,组间比较采用双因素方差分析,组内比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：与WT组相比,20mg/kg可卡因在DAT-CI组没有呈现出快速移动效应及条件性位置偏爱效应。FSCV测试显示,给予可卡因后,DAT-CI小鼠中注射rAAV-DATwt的一侧脑区与对侧脑区相比,出现明显的多巴胺释放峰值且多巴胺消退速度减慢。免疫组化反应显示,注射rAAV-DATwt的脑区呈现深棕色显影,立体定位注射位置准确。 结论：将rAAV-DATwt导入DAT-CI小鼠后,可在目标脑区成功表达野生型DAT,并重现可卡因诱导的细胞外多巴胺浓度的升高。该实验模型稳定有效,可进一步应用于可卡因诱导行为学效应的研究。 第二部分可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠背侧纹状体合并外侧伏隔核立体定向注射野生型多巴胺转运体重组腺病毒载体重建可卡因诱导的快速移动效应 目的：确定与可卡因诱导的快速移动及奖赏效应相关的特定脑区。 方法：选取可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠（cocaine-insensitive dopamine transporter knock-in mice,DAT-CI mice:）30只,野生型（wild-type,WT）C57BL/6J小鼠10只,体重20-30g。DAT-CI小鼠随机分成3组：背侧纹状体合并外侧伏隔核组（ICPU组）、内侧伏隔核组（mNAC组）、DAT-CI组,加野生型小鼠对照WT组,共4组,每组10只。1CPU组及mNAC组采用脑立体定向技术分别向DAT-CI小鼠双侧背侧纹状体合并外侧伏隔核及内侧伏隔核靶点坐标注射野生型多巴胺转运体重组腺相关病毒载体（rAAV-DATwt）,DAT-CI组及WT组不进行任何注射。手术4周后,4组小鼠建立可卡因条件性位置偏爱模型,该模型可同时评估可卡因所致的快速移动（hyperlocomotion）及奖赏（reward）效应。条件性位置偏爱实验（conditioned place preference, CPP）包括3个阶段：训练前位置偏爱测试1天；可卡因/生理盐水训练阶段8天；及训练后位置偏爱测试1天。训练前位置偏爱测试实验箱由不同的视觉及触觉线索（cue）区分为中间隔间及2个双侧隔间共3个彼此相通的区域,将小鼠从中间隔间放入,任其在实验箱中自由活动30min,Anymaze视频追踪系统自动记录实验动物在3个区域的停留时间及移动距离,位置偏爱值用小鼠在伴药区和非伴药区停留时间的差值表示,伴药区由自行设计的软件计算决定,使每组小鼠给药前的位置偏爱值之和趋近于零以减小组内数据离散率。药物训练阶段共8天,伴药箱和非伴药箱分别用训练前测试对应的线索布置,实验箱三个隔间彼此相通且在视觉触觉上完全相同。偶数天给予4组小鼠腹腔注射可卡因20mg/kg,奇数天给予4组小鼠腹腔注射相同体积生理盐水,Anymaze视频追踪系统自动记录实验动物30min内的移动距离,作为评价运动刺激的指标。训练后位置偏爱测试同训练前。CPP分数取实验动物在伴药区停留的时间（conditioned stimulus,CS+）减去非伴药区停留时间（unconditioned stimulus,CS-）的差值,药物训练前与训练后CPP分数的比较用来评价可卡因的奖赏效应。各组小鼠在行为学实验结束后,立刻处死并以4%多聚甲醛灌注内固定,快速分离脑组织,制作新鲜脑组织冰冻切片,用免疫组化DAB法显影rAAV-DATwt的表达范围,剔除病毒表达范围不准确者。采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差（x±s）表示,组内比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：可卡因诱导快速移动效应方面,WT组与1CPU组小鼠给予可卡因后,与单纯给予生理盐水比较,移动距离显著增高；DAT-CI组和nNAc组小鼠给予可卡因后,与生理盐水比较,移动距离无明显改变。条件性位置偏爱效应方面,仅WT组小鼠在训练后测试中的CPP分数明显高于训练前,其余三组小鼠训练前后CPP分数无明显差异。 结论：可卡因通过阻断背侧纹状体及外侧伏隔核中的多巴胺转运体,足以诱导小鼠产生快速移动效应。 第三部分可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠腹侧中脑立体定向注射野生型多巴胺转运体重组腺病毒载体重建可卡因诱导的条件性位置偏爱效应 目的：确定与可卡因诱导的奖赏效应相关的特定脑区。 方法：选取可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠（cocaine-insensitive dopamine transporter knock-in mice, DAT-CI mice）40只,野生型（wild-type, WT）C57BL/6J小鼠10只,体重20-30g。DAT-CI小鼠随机分成4组：腹侧中脑组（vMB组）、嗅结节组（Tu组）、联合脑区组（CPu,Acb,Tu,vMB组）、DAT-CI组,加野生型小鼠对照WT组,共5组,每组10只。vMB组,Tu组及联合脑区组采用脑立体定向技术分别向DAT-CI、鼠双侧腹侧中脑、嗅结节及包含背侧纹状体、伏隔核、嗅结节及腹侧中脑在内的联合脑区对应的靶点坐标注射野生型多巴胺转运体重组腺相关病毒载体（rAAV-DATwt）,DAT-CI组及WT组不进行任何注射。手术4周后,4组小鼠建立可卡因条件性位置偏爱模型,该模型可同时评估可卡因所致的快速移动（hyperlocomotion）及奖赏（reward）效应。条件性位置偏爱实验（conditioned place preference, CPP）)包括3个阶段：训练前位置偏爱测试1天；可卡因/生理盐水训练阶段8天；及训练后位置偏爱测试1天。训练前位置偏爱测试实验箱由不同的视觉及触觉线索（cue）区分为中间隔间及2个双侧隔间共3个彼此相通的区域,将小鼠从中间隔间放入,任其在实验箱中自由活动30min,Anymaze视频追踪系统自动记录实验动物在3个区域的停留时间及移动距离,位置偏爱值用小鼠在伴药区和非伴药区停留时间的差值表示,伴药区由白行设计的软件计算决定,使每组小鼠给药前的位置偏爱值之和趋近于零以减小组内数据离散率。药物训练阶段共8天,伴药箱和非伴药箱分别用训练前测试对应的线索布置,实验箱三个隔间彼此相通且在视觉触觉上完全相同。偶数天给予4组小鼠腹腔注射可卡因20ng/kg,奇数天给予4组小鼠腹腔注射相同体积生理盐水,Anymaze视频追踪系统自动记录实验动物30min内的移动距离,作为评价运动刺激的指标。训练后位置偏爱测试同训练前。CPP分数取实验动物在伴药区停留的时间（conditioned stimulus,CS+）减去非伴药区停留时间（unconditioned stimulus,CS-）的差值,药物训练前与训练后CPP分数的比较用来评价可卡因的奖赏效应。各组小鼠在行为学实验结束后,立刻处死并以4%多聚甲醛灌注内固定,快速分离脑组织,制作新鲜脑组织冰冻切片,用免疫组化DAB法及免疫萤光法显影AAV-DATwt的表达范围,剔除病毒表达范围不准确者。采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差（x±s）表示,组内比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：可卡因诱导快速移动效应方面,WT组、vMB组及联合脑区组小鼠给予可卡因后,与单纯给予生理盐水比较,移动距离显著增高；DAT-CI组小鼠给予可卡因后,与单纯给予生理盐水比较,移动距离无明显改变。条件性位置偏爱效应方面,WT组、vMB组及联合脑区组小鼠在训练后测试中的CPP分数明显高于训练前,DAT-CI组小鼠训练前后CPP分数无明显差异。Tu组小鼠脑组织切片显影结果提示,嗅结节区域病毒表达准确性过低,故将该组从实验中剔除。免疫荧光显影提示,vMB组中,在距离注射点远处的纹状体区有野生型DAT表达。 结论：rAAV-DATwt在DAT-CI小鼠腹侧中脑表达后,可成功重建可卡因诱导的运动刺激及奖赏效应。DAT-CI小鼠丧失对可卡因的行为学反应并非由于基因敲进导致的适应性改变,而是因为可卡因无法阻断多巴胺转运体,这进一步证实了可卡因必须通过阻断多巴胺转运体才能发挥其运动刺激及奖赏效应。
关键词：可卡因成瘾;多巴胺转运体;重组腺相关病毒载体;基因敲进;立体定向;快速移动效应;奖赏效应;重组腺相关病毒;纹状体;伏隔核;嗅结节;腹侧中脑
学科专业：麻醉学
本研究的创新点
英文缩略词
中文摘要
ABSTRACT
引言
第一部分 鉴定利用重组腺相关病毒载体将野生型多巴胺转运体导入可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠目标脑区的可行性与有效性
1 材料与方法
1.1 主要仪器设备
1.2 主要试剂
1.3 主要溶液配制
1.4 实验方法与步骤
2 结果
2.1 可卡因诱导DAT-CI小鼠与WT小鼠快速移动效应的比较
2.2 可卡因诱导DAT-CI小鼠与WT小鼠条件性位置偏爱效应的比较
2.3 FSCV测定多巴胺的释放与再摄取以及免疫组化DAB法显影病毒表达
3 讨论
第二部分 可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠背侧纹状体合并外侧伏隔核立体定位注射野生型多巴胺转运体腺相关病毒载体重建可卡因诱导的快速移动效应
1 材料与方法
1.1 主要仪器设备
1.2 主要试剂
1.3 主要溶液配制
1.4 实验方法与步骤
2 结果
2.1 免疫组化DAB法显影重组腺相关病毒在小鼠目标脑区的表达
2.2 导入重组腺相关病毒载体对可卡因诱导小鼠快速移动效应的影响
2.3 导入重组腺相关病毒载体对可卡因诱导小鼠条件性位置偏爱效应的影响
3 讨论
第三部分 可卡因非敏感性多巴胺转运体基因敲进小鼠腹侧中脑立体定位注射野生型多巴胺转运体腺相关病毒载体重建可卡因诱导的条件性位置偏爱效应
1 材料与方法
1.1 主要仪器设备
1.2 主要试剂
1.3 主要溶液配制
1.4 实验方法与步骤
2 结果
2.1 免疫组化DAB法显影重组腺相关病毒在小鼠目标脑区的表达
2.2 免疫萤光法显影vMB组小鼠多巴胺神经元投射脑区野生DAT的表达
2.3 导入重组腺相关病毒载体对可卡因诱导小鼠快速移动效应的影响
2.4 导入重组腺相关病毒载体对可卡因诱导小鼠条件性位置偏爱效应的影响
3 讨论
参考文献
综述
参考文献
本课题研究结论