血凝和血凝抑制试验（精选四篇）
血凝和血凝抑制试验 篇1
1 材料
1.1 抗原与标准血清
鸡新城疫HI抗原 (批号为2011年3月) , 中国兽医药品监察所生产;新城疫标准阳性血清 (批号为20091029) , 青岛易邦生物工程有限公司生产;禽流感病毒H5亚型 (Re-5) HI抗原 (批号为201007) 和禽流感病毒H5亚型 (Re-5) 阳性血清 (批号为201002) , 哈尔滨维科生物技术开发公司生产;新城疫和禽流感H5亚型阴性血清, 从大庆市动物疫病预防与控制中心自养无新城疫和禽流感抗体鸡群采集、分离。
1.2 1%红细胞悬液的配制
分别采集3只无禽流感和新城疫抗体的健康公鸡和母鸡血液与等体积的阿氏液混合, 用10倍体积pH值为7.2、0.01 mol/L PBS液洗涤3次, 每次2 000 r/min离心5～10 min, 去掉血浆和白细胞层, 洗涤后用PBS液制成1%红细胞悬液, 4 ℃保存, 备用。
同理用生理盐水配制无禽流感和新城疫抗体的健康公鸡的1%红细胞悬液和健康母鸡的1%红细胞悬液, 4 ℃保存, 备用。
1.3 待检血清
20份不同效价鸡血清, 由大庆市动物疫病预防与控制中心制备并保存。
2 方法
2.1 载体缓冲液相同, 红细胞来源不同试验比较
用pH值为7.2、0.01 mol/L PBS液作载体缓冲液, 用血凝法检测抗原效价, 重复8行, 4行加1%公鸡红细胞悬液, 另4行加1%母鸡红细胞悬液, 彼此对照;用血凝抑制法检测待检血清和标准阳性/阴性血清, 每份重复2行, 1行加1%公鸡红细胞悬液, 1行加1%母鸡红细胞悬液, 彼此对照。
应用生理盐水代替0.01 mol/L PBS, 重复上述步骤。
2.2 红细胞来源相同, 载体缓冲液不同的试验比较
应用pH值为7.2、0.01 mol/L PBS液作载体缓冲液, 用血凝法检测抗原效价, 重复4行;应用生理盐水作载体缓冲液, 检同一抗原效价, 重复4行, 各行全部应用1%公鸡红细胞悬液;血凝抑制法检测待检血清和标准阳性/阴性血清, 每份重复2行, 1行应用PBS液作载体缓冲液, 1行应用生理盐水作载体缓冲液, 各行全部应用1%公鸡红细胞悬液, 彼此对照。
应用1%母鸡红细胞悬液代替1%公鸡红细胞悬液, 重复上述步骤。
2.3 抗原、抗体检测后在不同时间判定结果比较
抗原、抗体在规定时间判定结果后, 放置4 ℃过夜再重新观察判定结果, 与前一次判定结果进行比较, 观察结果的稳定性。
3 结果
3.1 新城疫抗原血凝试验结果 (见表1)
3.2 H5亚型禽流感抗原血凝试验结果 (见表2)
3.3 新城疫抗体血凝抑制试验结果 (见表3)
3.4 H5亚型禽流感抗体血凝抑制试验结果 (见表4)
3.5 抗原、抗体检测后不同时间判定结果比较
新城疫血凝与血凝抑制试验抗原、抗体检测按常规判定结果后放置过夜, 第2天红细胞已全部沉于板底, 无法判断;H5亚型禽流感血凝与血凝抑制试验抗原、抗体检测按常规判定结果后放置过夜, 第2天再判定与过夜前判定结果完全相同。
4 分析与讨论
1) 在20份血清抗体效价水平检测中, 应用1%公鸡红细胞, 新城疫抗体效价分别为5.45 lb和5.55 lb, H5亚型禽流感抗体效价分别为5.10 lb和5.20 lb;应用母鸡红细胞, 新城疫抗体效价分别为5.65 lb和5.35 lb, H5亚型禽流感抗体效价分别为4.95 lb和5.10 lb, 同种抗体环比基本一致, 因此在本方法中无论使用哪种载体缓冲液, 结果都应该是准确的, 载体缓冲液不应该作为本方法的硬性条件加以控制。两种缓冲液各有优点:生理盐水虽然少了几对缓冲离子对, 有配制简便、应用试剂和使用仪器较少等优点; pH值为7.2、0.01 mol/L PBS液则有缓冲离子对多、缓冲能力较强的优点。
2) 试验应用的生理盐水pH值为6.7 (微偏酸) , 0.01 mol/L PBS溶液的pH值为7.2 (微偏碱) , 但这并没有影响检测平均结果的相对一致性, 因此可以认为该方法对酸碱度的要求比较宽松, 载体缓冲液的pH值在6.7～7.2之间都能检测到准确的结果。
3) 试验应用不同缓冲液配制的健康公鸡和母鸡的1%红细胞悬液, 在抗原血凝效价和免疫抗体效价检测2项指标, 对比检测结果基本一致, 认为这2种病毒具有凝集鸡红细胞的特性, 应用健康公鸡和母鸡的红细胞并没有本质差别, 因此1%红细胞悬液中红细胞完全可以来自健康母鸡, 而公鸡红细胞悬液只能作为优势条件加以强调, 不应作为必然条件加以限制。根据现代养禽特点, 健康母鸡远比健康公鸡来源广泛, 这拓宽了1%红细胞悬液红细胞来源, 更有利于试验的开展。
4) 已知标准阳性血清本常用作病原诊断的标准试剂, 但在免疫抗体效价评定的血凝抑制试验中, 应用已知效价的标准阳性血清作对照, 可以作为检测结果准确与否的定量尺度, 可以监测每次操作出现的偏差, 能从另一侧面验证检测结果的准确性。但标准阳性血清的已知效价稳定性较弱, 依据血清抗体蛋白的特性, 抗体的效价随着冻融次数的增多在逐步消减, 同时随着外部保存条件的变化及时间的延长也在逐步消减, 因此在获得标准阳性血清后, 首先要对其效价加以评定, 确保标准血清效价的准确性、已知性;其次要进行分装, 保证保存条件的恒定, 以防效价的减退, 或是根据冻融的次数, 每隔一定时间或应用一定的次数对其效价加以评定, 确保标准阳性血清效价的准确性、已知性。
5) 血凝试验主要是评定抗原的最高血凝效价, 能否准确配制4个血凝单位的抗原直接影响检测结果的准确性, 因此准确评定抗原的最高血凝效价是此试验中最重要的环节。但在血凝试验操作过程中, 由于抗原的浓度过高或个别移液器吸嘴吸附性较强等原因, 容易使抗原吸入过多或吸附在移液器吸嘴上过多, 在倍比稀释过程中往往带走了过多的抗原, 使检测结果比实际结果偏高。为了避免这样的操作误差, 配制4个血凝单位的抗原后, 最好做抗原回归检测, 以验证其浓度的准确性。
根据以往4个血凝单位的抗原配制经验, 完全可以根据抗原的出厂效价或上一次应用检测结果, 先配制假定准确的4个血凝单位的抗原, 再做回归检测来调节至需要的抗原浓度, 以此标定准确的4个血凝单位的抗原。
血凝和血凝抑制试验的影响因素分析 篇2
1 PBS缓冲液
PBS缓冲液在配制红细胞悬液、抗原、试验过程中都需要用到,并且应保持一致性。PBS缓冲液应现用现配,并将p H值调到7.2,如果配制时间过长,p H值会发生变化,影响试验结果。
2红细胞
2.1来源
配置红细胞最好选用成年SPF公禽,但大多地区很难购买,也可选用非免疫健康公禽。如果仅采集一只禽制作红细胞,可能产生自凝现象,因此应至少采集3~4只禽血液混合后制作。红细胞的采集最好选用与待检血清同种禽类,否则会出现非特异性凝集现象,有时会严重影响结果判定。
2.2配制
2.2.1浓度血凝和血凝抑制试验一般配制1%浓度红细胞悬液。不同浓度的红细胞对效价有一定影响,当红细胞浓度过高,沉降的血点过大,测出的血凝效价可能偏低,血凝抑制效价可能偏高;当红细胞浓度过低,沉降的血点过低,且沉降速度较慢,测出的血凝效价可能偏高,血凝抑制效价可能偏低。
2.2.2溶血采血时过度摇晃容器或离心红细胞时速度过快、时间过长,容易导致红细胞破裂,红细胞悬液浓度变低,影响试验结果的观察。
2.3保存
配制好的红细胞悬液应保存于2~8℃,且不超过2 d,以免保存时间过长或受细菌污染均可发生自凝,影响试验结果。
3抗原
3.1配制
抗原的配置浓度对试验结果影响很大。如果抗原浓度降低,测得的抗体效价增大;抗原浓度升高,测得的抗体效价减小。因此在测样品效价之前应对配制好的抗原进行滴定试验,如果抗原浓度不准确,应进行校正。
3.2保存
抗原应现配现用,配制好的抗原应保存于2~8℃,且不超过2 d,也可-70℃保存,随用随取,切忌反复冻融,否则抗原效价会降低。
4样品
被检样品要求新鲜、透明、无杂质、无溶血、不腐败。当血清被细菌严重污染或腐败后,血清会变浑浊,变质的血清会发生凝集反应,使含较高抗体的血清在血凝抑制试验中出现前几孔凝集[1],而后几孔凝集被抑制的现象。
5温度和时间
试验要求反应温度在20~25℃,温度低反应时间变长,出现结果变慢;温度高反应时间变短,出现结果变快。抗原抗体反应时,如果温度在20~25℃,必须反应30 min以上。加入红细胞反应时,温度低于4℃,红细胞易发生自凝;高于37℃,凝集的红细胞易洗脱。当温度为4℃时,反应时间25 min为最佳读取结果时间;25℃时,反应时间20 min为最佳读取结果时间;37℃时,反应时间15 min为最佳读取结果时间。试验结果出现后,应及时读取结果。如不及时读取,则红细胞开始解凝,温度越高,解凝越快。4℃反应50 min开始解凝,25℃反应40 min开始解凝,37℃反应30 min开始解凝。
6试验器材和耗材
6.1反应板
反应板有U型和V型两种,V型有90°和120°两种。一般选择96孔90°V型反应板进行HA-HI试验。使用一次性反应板可以避免使用有机反应板因清洗不净或过度磨损而影响结果。使用有机反应板需在每次试验完毕后立即将反应板用自来水反复冲洗,放到2%~3%的盐酸溶液中浸泡24 h以上,捞出用自来水反复冲洗,甩干,再用蒸馏水反复冲洗,甩净蒸馏水放入37℃干燥箱中烘干备用。底部磨损严重的反应板应及时淘汰。
6.2移液器
移液器首先要经过检定计量准确。如果移液器移取的液体量、吸取的液体量或排出的液体量不准确必然会影响试验结果。因此在使用微量移液器前,要检查所用移液器量程是否与要移加的液体量相匹配,刻度是否准确,吸头是否牢固,操作时要做到慢吸快放。
6.3恒温培养箱
能精确保持设定温度。
7结果判定
试验成功与否根据阴阳性对照和空白对照来判断。HI试验中,如果阳性对照不超过标准值的±1个效价,阴性对照在2log2以下时为100%凝集,空白对照100%阴性,则试验结果正确。HI试验结果判断时,需将反应板倾斜45°,孔底沉淀的红细胞流动性好,呈泪珠样流淌,边缘无凝集颗粒的为凝集完全抑制[2]。试验结果观察要及时,最好每5 min观察一次,避免反应时间过长,已凝集的红细胞被释放,影响结果的判断。
8结语
影响血凝和血凝抑制试验的因素很多,因此,在进行检测的过程中要注意质量控制,考虑各方面因素,规范操作程序,以降低试验误差。只有获得真实可靠的试验数据,才能科学评价疫苗免疫质量和免疫效果,为疫病防控提供有力的技术支撑。
摘要：血凝和血凝抑制试验在疫病防控中应用非常广泛,但影响试验结果的因素较多。针对试验中缓冲液、红细胞、抗原、样品、温度和时间、试验器材和耗材、结果判定等因素对试验的影响进行了分析。
关键词：血凝,血凝抑制,影响因素,分析
参考文献
[1]赵明娟,赵俊勇.温度和时间对血凝试验测定禽流感病毒H5N1亚型Re-6株抗原亚型的影响[M].畜牧与饲料科学,2014,(35).
血凝和血凝抑制试验 篇3
1 PBS的配制
准确称量试剂, 减少电解质对实验的影响, 促进可见现象的发生。液体的量取要以凹液面为准。
2 pH的调节
配好PBS液后, 切记要把pH值调到7.2左右, 以免发生非特异性沉淀。
3 公鸡血制备
要采集至少两只SPF公鸡血, 和离心管内的PBS液混匀放入离心机内离心, 每次10min, 1500～2000转/min, 共洗3～4次, 每次离心后把上清液和沉淀红细胞上层的白细胞薄膜用吸管充分弃去, 再加入PBS液混匀离心, 以上清液为透明状, 红细胞没有溶血和凝血为准, 最后一次要把红细胞压实, 用1ml吸头吸取, 采取慢吸方式, 以免造成空腔, 造成红细胞体积不足, 使实验出现误差。按1体积红细胞加入99倍体积PBS液混匀制成1%的红细胞悬液。
4 水禽待检血清的制备
做水禽血清样品前要做预处理, 以免发生非特异性反应, 进行HI试验前, 把每0.5ml血清加入25ul鸡红细胞, 轻摇后室温下静置至少30min, 800转离心2～5min, 取上清液, 即为待检血清。如果不做预处理, 容易发生非特异性反应。
5 正确使用移液器吸取液体试剂
由于是微量试验, 每次抽取的25ul液体, 包括病毒悬液、PBS液、红细胞悬液等要保证吸取量的准确, 在确保移液器量程准确和移液器插入吸头不漏气的前提下, 实验人员可以采取两种方式, 一种是慢吸快打式, 慢吸使多道移液器上的吸头里液面保持一致, 没有气泡和空腔, 快打使吸头内的液体垂直打入90°V型反应板内, 使吸头内无残留液体, 保证液体量的准确;另一种方法可以采取多吸少打式, 在移液器吸取液体时按到第2档, 排液时按到第1档, 使吸头内残留的液体保持一致, 这种方法要求实验人员能够准确使用移液器, 才能保证无误差。
6 血凝试验的判定 (HA试验)
血凝试验时最好同时进行3排病毒抗原测定, 抗原血凝效价要以出现全部凝集 (红细胞无流动) 的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价, 该效价为1个血凝单位。标准抗原稀释浓度必须配成4单位抗原, 而后必须做4单位抗原的回滴, 目的是验证血凝试验判定的准确性, 以免产生误差。
7 血凝抑制试验 (HI试验)
血凝抑制试验结果判读时要参看红细胞对照的流淌速度, 实验人员对结果的判定是否准确也是实验产生误差的一个重要因素。
8 滴加红细胞悬液时的注意事项
红细胞很容易下沉, 每次加1%的红细胞悬液之前都要把容器 (三角烧瓶、加液槽、平皿) 内的红细胞混匀, 不要用吸管吹, 以免悬浮不均匀, 要轻轻晃动, 把沉积在容器底部的红细胞与上清液重新混匀。
9 孵育前要混匀
在加完4单位抗原孵育前以及加完红细胞悬液孵育前, 都要把90°V型反应板放在微量振荡器上, 使反应板内的液体充分混匀, 如果孔底有气泡, 判定时容易产生误差。
1 0 温度对实验的影响
血凝和血凝抑制试验 篇4
1 血凝和血凝抑制试验理论和方法
血凝抑制试验和血凝主要是对血清抗体的检测试验。血凝原理是病毒或者是病毒的血凝素, 对一种或是几种动物血清红细胞产生凝集反应。具体的方法是标准抗原同鸡红细胞。血凝抑制反应 (HI) :当病毒的悬液中先加入特异性抗体, 且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时, 则红细胞表面的受体就不能再与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制, 方法是将检测出血凝单位的标准抗原配制后与受检血清反应, 再加入红细胞作用。这步试验用于检测受检血清抗体血凝抑制滴度, 判定受检血清抗体是否为阳性[3]。
2 影响影响血凝和血凝抑制试验结果的因素
2.1 样品采集和处理
在检验过程中样本的采集常规温度适宜在约20~25℃, 有利于血压样本的凝固, 常规采集血液标本量约为2.5m L, 注入试管内置于空气中月40min, 血液标本凝固后整理包扎放置冷藏室中放置6~8h, 离心取上清液。如发生胶冻状可使用牙签挤出上清液, 进行检验。样本在运送过程中应避免剧烈的震荡、温度过低、冷藏时间过常等情况发生。
2.2 试剂的配制与储藏
配制阿氏液, p H值调节精确后, 进行高压灭菌后, 在标准的温度下进行储备过夜, 在加入稀释液、1%红细胞悬液应准确称量、抗原阳性血清的判定, 避免温度过低产生血液标本的凝集或是温度过高导致样本发生性状改变。
2.3 器材的选择和使用
在进行标本的取样和制备的过程中, 使用标准加样器, 选择密封良好的一次性吸头避免反复使用或是重复使用, 避免仪器发生污染和提取样本剂量不标准。微量反应板使用完毕后应反复多次清洗, 避免污染影响下次使用。
2.4 单位抗原的配制
根据血凝试验结果, 配制4单位抗原, 4单位抗原宜现用现配。为防止4单位抗原配制不准确, 在HI试验前必须做抗原回归试验[4]。
2.5 加样、温度、结果判定
在红细胞悬液和抗体的检验前应进行充分的摇匀, 进行多个检验板加样时应缓慢进行, 避免加样太快, 在进行加样器加样时应垂直滴入, 避免液体和孔内液体相接触, 避免发生污染影响检验结果。检验样本的温度适宜控制在20~25℃, 避免温度过高导致样本检验结果发生误差或是温度过低导致样本发生性状改变, 检验失败。依据检验项目标准进行检验结果的判定, 如参照错误标准进行对比导致检验结果出现误差, 或是导致检验结果的错误判定。
3 讨论
运用血清抗体进行的血凝与血凝抑制试验对于动物传播疾病的免疫监测与疫情的控制是非常必要的。然而在检测过程中, 各种因素的干扰可能使结果出现假阳性等不真实的现象, 从而影响了医院工作人员对疾病的确诊。目前也有许多有关血凝与血凝抑制试验影响因素的分析的文献[5]。因素本文通过对检验206例检验样本的资料进行分析, 通过分析和总结, 影响血凝和血凝抑制试验结果的因素较为复杂主要为:样品采集和处理、试剂的配制与储藏、器材的选择和使用、单位抗原的配制、加样、温度、结果判定等。
综上所述, 在检验过程中针对影响血凝和血凝抑制试验结果的因素进行注意和避免, 能够有效的提高检验的准确性。这就要求在样本的采集和样本处理过程中, 应严格遵守各项操作流程, 在试剂的配制和储备、器材和设备的使用过程中、对加样的频率、温度的控制和结果的判定均应注意依据操作规程进行, 应尽量提高检验结果的准确性。
参考文献
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[2]杭柏林, 胡建和, 刘丽艳, 等.影响血凝抑制试验因素的研究进展[J].贵州农业科学, 2009, 37 (3) :112-113..[2]杭柏林, 胡建和, 刘丽艳, 等.影响血凝抑制试验因素的研究进展[J].贵州农业科学, 2009, 37 (3) :112-113..
[3]张评浒, 唐应华, 仇旭升, 等.不同家禽红细胞悬液对禽流感血清抗体检测的影响[J].中国兽医科技, 2005, 35 (4) :267-271.[3]张评浒, 唐应华, 仇旭升, 等.不同家禽红细胞悬液对禽流感血清抗体检测的影响[J].中国兽医科技, 2005, 35 (4) :267-271.
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