结构化标记（精选十篇）
结构化标记 篇1
被动态是英语教学中的重点内容, 在学习过程中, 学习者往往会产生一些疑问, 如怎样理解“被动态是有标记的”?什么是标记?在be-型被动态的构成里, 何谓“助动词be的一定形式”?是助动词be的某种确定形式还是诸种不确定形式?在诸多时态当中, 为什么be-型被动态其限定形式只有上述六种?
要想厘清以上疑问, 就需要先说说何谓“标记”。标记 (markedness) 一词最初是由布拉格学派的代表性人物、结构主义语言学家特鲁别茨柯依在其著作《音位学原理》中首先提出。特鲁别茨柯依指出, 一对语言特征包括两个对立体, 即“有标记的 (marked) ”和“无标记的 (unmarked) ”。无标记成分指常见的、意义一般的、分布较广的语言成分;而有标记成分则指那些不常见的、意义具体的、分布相对较窄的语言成分。无标记性是中性的 (neutral) , 在意义上具有一般性、非特指性, 分布比有标记项要广, 使用范围比有标记项更大。无标记项甚至可以包括有标记项的意义, 这是标记理论的重要内容。
一般而言, 英语中绝大多数句子都具有默认的态、式特征, 即“主动的”“非虚拟的”。换言之, 整个句子的谓语中只需体现时、体特征即可。这也就是为什么传统语法说上将“时”“体”合称为“时态” (tense) 。“时” (time) 用来表示时间的区别。英语中有“现在时”和“进行时”。一般地, “时”要与“体”结合在一起共同使用, 但它也可以单独使用, 构成“一般现在时”和“一般过去时”。“体” (aspect) 用来表示动作或过程在某一时间内处于何种状态。英语中有“进行体”和“完成体”。当与“时”结合时, 就又构成了四种时态:“现在进行体”“过去进行体”“现在完成体”“过去完成体”。再加上“时”单独存在时构成的两种时态, 就形成了英语中最为基本的六种时态。以动词look为例, 其在六种时态中的变化为: (1) look/looks; (2) looked; (3) be looking; (4) was/were looking; (5) have/has looked; (6) had looked。观察以上诸例, 当“体”存在的时候, 谓语动词就要同时体现“时”“体”两大特征。实义动词look承担了表述新增加的动词特征“体”的任务, 此时不再顾及“时”。所以在进行体和完成体当中, look分别变形为looking和looked以体现出“进行”和“完成”的语法含义, 而“时”的概念——“现在”和“过去”则由助动词be以及have来体现, 辅助构成整个谓语动词。
而在含有被动态的句子当中, 谓语动词就要同时体现出“时”“体”“态” (voice) 三个语法范畴。再以动词look为例, 看看它在被动态中的变化: (1) look/looks→be looked; (2) looked→was/were looked; (3) be looking→be being looked; (4) was/were looking→was/were being looked; (5) have/has looked→have been looked; (6) had looked→had been looked。look通过变形为looked体现出了“被动态”的特征, 而原来谓语动词的时、体特征由助动词be实现。在被动态中, 谓语所包含的实义动词变化为相应的-ed形式并且在各个时态中保持一种恒定的形态, 这就是被动式的“标记”。实义动词的-ed形式就是被动态的标记 (mark) ;而“be的一定形式”, 就是原主动句中的“时”“体”概念统统交由be来表达。
参考文献
[1]谢应光.标记理论与英语动词的语法范畴[J].外国语 (上海外国语大学学报) , 1998 (1)
[2]章振邦主编.新编英语语法 (第三版) [M].上海:上海外语教育出版社, 1997
结构化标记 篇2
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结构化标记 篇3
关键词：有+VP 了 完成体标记
一、引言
本文以《从粤方言影响看“有+VP”结构形成的认知过程》①为题，通过分析现代汉语动词“有”的词义发展和例释粤方言“有+VP”结构中时态助词的用法，从历时和共时的角度，通过语言接触和语法化过程，提出现代汉语“有+VP”结构的出现表明了体标记“有”存在的可能性，并分析现代汉语“有+VP”结构出现的认知过程。
“有+VP”结构中新兴体标记“有”具有语言学理论基础，并具有语言接触的土壤。但是“有”在现代汉语的语法化进程中，仍然无法替代传统完成体标记“了”，从而正式作为与“没有+VP”相对称的肯定结构形式被汉语普通话使用者接受。
本文将通过分析现代汉语中“有+VP”结构的局限性及其呈现出的表示强调的语义特征，提出现代汉语“有+VP”结构不可代替助词“了”作为现代汉语完成体标记。
二、现代汉语中“有+VP”结构的局限性
在对粤方言和现代汉语“有+VP”结构的分析中[1]，我们发现受到语言接触的影响，“有+VP”结构的产生使现代汉语中一对对称体标记的产生具有了可能性。
现代汉语“有+VP”结构主要出现在对话和陈述句中。
（一）对话中的“有+VP”结构
对话中的“有+VP”结构通常是作为“有没有+VP”问句的肯定回答出现的。“有没有+VP”疑问结构在现代汉语中出现时间不久[2]，其发展来源是修饰动词短语的副词“没有”[3]。肯定回答中出现的“有+VP”和否定回答“没有+VP”及其疑问形式“有没有+VP”在结构形式上一致。如：
NP VP
疑问形式 你有没有这本书？ 你有没有吃饭？
肯定回答 我有这本书。 我有吃饭。
否定回答 我没有这本书。 我没有吃饭。
“没有”是否定动作完成的助词[4]。在回答“有没有+VP”的对话的肯定回答中，如果我们去掉否定词“没”，那么，“有”在原位上自然成为和“没有”一样表意功能的相反的肯定完成体标记，充当“了”的完成体标记功能，并在形式上对称。因此，也为“VP”前面自然缺位导致的“有”的填充提供了可能。
然而，按照现代汉语语法，“了”和“没有”是一对合法的表示肯定和否定的体标记[5]。对“有没有+VP”疑问句的回答分别是“VP+了”和“没有+VP”，尽管形式上是不对称的。虽然在这种固定结构问句的回答中，“有”和“没有”在形式上形成了对称，然而这种应用在现代汉语中具有明显的局限性：当问句变为“VP了吗？”的结构时，其肯定回答自然仍将以“VP+了”的面貌出现。
（二）陈述句中的“有+VP”结构
对话中的“有+VP”结构通常是作为“有没有+VP”问句所引导的肯定回答形式出现的。“有”的这种功能词用法在词形和句法上与相对应的否定式和问句形式一致。但是“有+VP”结构在陈述句中则不然。陈述句中“有”字后面经常出现“提高”“增加”“变化”之类的名词。如：
（1）学习有进步。
（2）今年的产量有增加。
（3）情况有变化。
例（1）～（3）符合现代汉语语法“有+NP”规则。然而它们恰恰为“有+VP”结构的出现提供了“过渡语境”（bridging context）[6]。“进步”“增加”“变化”在现代汉语中既可作为名词，又可作为（不及物）动词。[7]然而正是由于汉语缺乏丰富的形态变化，类似“进步”“增加”“变化”等名词和动词形式相同的词语为“有+VP”结构在语言接触并由语言认知系统激发下的出现作了铺垫。这些名词与动词之间形态变化的缺乏是这一语言现象发展的一个重要动因。如：
（4）我学习进步了。
（5）今年的产量增加了。
（6）情况变化了。
分别对比例（1）～（3）和例（4）～（6），我们可以得到两组合法且意义相近的句子。然而却不难发现其中的差异：第二组，即例（4）～（6），强调过去动作或事件（“进步”“增加”“变化”）的完成。而第一组，即例（1）～（3），强调现有的状态，即出现的“进步”“增加”“变化”。
通过对“有+VP”结构在对话和陈述句这两种语言环境中的分析，我们看出不仅“有+VP”结构存在语境局限性，而且“有+VP”与“VP+了”结构中存在语义差异。
三、现代汉语“有+VP”表示强调的语义功能
与南方方言的接触促使“有+VP”结构的出现，并以对称优势试图挑战现代汉语中固有的完成体标记“了”。不同于“进步”“增加”“变化”这类名词和动词形式相同的词语，其他动词，如“给”“去”“看”等，没有上述动词的名词与动词的重复形态。因此在这些动词中出现的“有+VP”结构则被认为是与南方方言中类似用法的影响所致。
（7）那天生日，我有给他礼物。
（8）我有去参加你的婚礼，恭喜你！
（9）我天天都有看你的影集，非常的不错。
例（7）和（8）中的“有”表示强调。在言语交际中，“有+VP”结构通常表达说话人对事实的强调语气。对比“我吃饭了。”和“我有吃饭。”这两句话，前者用“了”指“吃饭”这个动作或事件的完成，并说明“现在不饿”的状态。而后者，说话人用“有”主观强调“已经吃饭”的事实。这种强烈的肯定或声明暗示着对潜在不同或相反意见的强调断定。除了表示强调以外，在与粤方言的接触下，“有”还表示动作或事件发生的习惯性，如例（9）。
Bybee阐述了动词“有”“have”和系动词“be”向完成体和简单过去时发展的路径：
系/有（be/“have”）>结果（resultative）>先事时（anterior）>完成体/简单过去时（perfective/simple past）[8]。
在完成体和简单过去时的对比中，Bybee认为，简单过去时比完成体的语法化程度更高，且在很多情况下是完成体进一步发展的结果。
作为完成体标记的“有”表示动作或事件的完成;而作为简单过去式标记的“有”则具有强调和表示习惯性动作的功能。例（7）～（9）正是现代汉语“有+VP”符合上述发展理论、汉语动词“有”向简单过去式进一步发展的例子。
四、结语
世界上各种语言都有其自身的逻辑和时态系统。作为一个语法概念，“体”表示人们对用动词所描述的事件的观点。体主要有两大类，即未完成体（imperfective）和完成体（perfective）[9]。汉语被认为是时态相对匮乏的语言，几乎没有像英语里表示过去时的动词词缀“-ed”之类的显性（overt）时态词素。由个别体标记形成的汉语体系统比英语体系统在语义上更受约束，也没有英语那么规则[10]。
“有+VP”结构在语言接触的过程中，在某种程度上符合语言认知的共性，从而出现了与“没有+VP”结构形成一对对称体标记的趋势。然而，“有+VP”结构的出现环境具有局限性且不稳定，无法取代“了”作为完成体标记为人们所接受。“有”在语法化的进程中，也已经向具有强调和表示习惯性动作功能的助词演化，因而表达比“了”更加丰富的功能。
（本文是天津师范大学哲学社会科学研究青年基金课题资助项目，项目编号为：[52WR52]。）
注释：
①《从粤方言影响看“有+VP”结构形成的认知过程》，现代语文
（语言研究版），2011，（2）.
参考文献：
[1]孙晶.从粤方言影响看“有+VP”结构形成的认知过程[J].现代
语文（语言研究版），2011，（2）.
[2]丁声树.现代汉语语法讲话[M].北京：商务印书馆，1961.
[3]Ota，Tatsuo.（Translated by Jiang Shaoyu and Xu Changhua）.
The Historical Grammar of Chinese[M].Beijing：Peking University Press，1958.
[4]赵元任.汉语口语语法[M].北京：商务印书馆，1979.
[5]石毓智.汉语领有动词与完成体的表达[J].语言研究，2004.
[6]Evans，Nicholas and Wilkins，David.Inthemindsear：
These mantic extensions of perception verbs in Australian languages[J].Baltimore：Linguistic Society of America，2000，（76）：546～592.
[7]Heine，Bernd.World lexicon of Grammaticalization[M].
Cambridge：Cambridge University Press，2002.
[8]Bybee，JoanL.etal.The evolution of grammar：tense，
aspect，and modality in the languages of the world[M].Chicago：University of Chicago Press，1994.
[9]Comrie，Bernard.Aspect：an introduction to the study of
verbal aspect and related problems[M].Cambridge：Cambridge University Press，1976.
[10]Yang，Guowen and JohnA.Bateman. The Chinese Aspect
System and its Semantic Interpretation[M].Paper submitted to the 19th International Conference on Computational Linguistics.Taiwan，2002.
结构化标记 篇4
无论是大小调式,还是中国民族调式,每个和弦都用一些特定的符号来表示各级和弦的名称,这就叫做和弦标记。一般来说有以下几类:一种是用字母标记如Am、C7等;一种是用数字标记,包括阿拉伯数字标记如6647659等以及罗马数字标记如Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ等;还有一种是用功能标记如T、D、S等。而各种和弦标记都有着自己不同的特点,但是无论哪种标记,都遵循和弦结构最基本的知识。
本文针对两类和弦标记做初步的分析和比较:固定音名标记(字母标记);功能标记。
一、和弦分类的基本知识
分析各类和弦标记就必须首先了解和弦分类的基本知识,本文以常见的三和弦及七和弦为例:
(一)三和弦
大三和弦:根音与三音是大三度,三音与五音是小三度;
小三和弦:根音到三音小三度,三音到五音大三度;
增三和弦:根音到三音大三度,三音到五音大三度;
减三和弦:根音到三音小三度,三音到五音小三度。
(二)常见七和弦
大七和弦:大三和弦加大七度音程;
大小七和弦:大三和弦加小七度音程;
小七和弦:小三和弦加小七度音程;
减小七和弦:减三和弦加小七度音程;
减七和弦:减三和弦加减七度音程。
二、字母标记(固定和弦标记)
所谓字母标记,流行音乐、摇滚乐以及爵士乐中,以和弦根音的绝对音高——音名,即字母标记作基础就称为字母标记,也叫固定和弦标记。如大三和弦,根音为C标记C,根音为D标记D;小三和弦根音为E标记为Em,根音为F标记为Fm;大小七和弦根音为G标记为G7,根音为A标记为A7等。无论在什么调中,这些和弦的标记恒定不变。
以根音C为例,各类三和弦和常见七和弦相对应的字母标记(固定和弦标记)如下:
大三和弦标记为:C,构成音为C、E、G;
小三和弦标记为:Cm,构成音为C、降E、G;
增三和弦标记为:Caug或C+,构成音为C、E、升G;
减三和弦标记为:Cdim或C-,构成音为C、降E、降G;
大七和弦标记为:Cmaj7,构成音为C、E、G、B;
大小七和弦标记为:C7,构成音为C、E、G、降B;
小七和弦标记为:Cm7,构成音为C、降E、G、降B;
减小七和弦标记为:Cm7-5,构成音为C、降E、降G、降B;
减七和弦标记为:Cdim7,构成音为C、降E、降G、重降B。
三、功能标记
所谓功能标记:传统和声中,调式的每个音级都具有特定的功能属性:Ⅰ级、Ⅳ级、Ⅴ级称为正音级,建立在Ⅰ级、Ⅳ级、Ⅴ级上的三和弦称为正三和弦,分别代表了主功能,下属功能,属功能,ⅱ级、ⅲ级、ⅵ级、ⅶ级称为副音级,建立在以上音级三和弦称为副三和弦,分别归属于三个功能组,其中:ⅱ级下属功能组;ⅲ级双重功能即主和属;ⅵ级双重功能即主和下属;ⅶ级属功能组。因此各级三和弦的功能标记为——主三和弦:T,大三和弦;上主音三和弦:SⅡ,小三和弦;中音三和弦:TDⅢ,小三和弦;下属三和弦:S,大三和弦;属三和弦:D,大三和弦;下中音三和弦:TSⅥ,小三和弦;导三和弦:DⅦ-,减三和弦。
四、字母标记与功能标记的相互关系
如果找字母标记与功能标记相对应的关系则必须建立在调式基础上,如果没有调式则无法标记和弦的功能,因为和弦的功能代表了该和弦在调式中的意义:以主和弦为例,它是大小调中最稳定的和弦,调式无论产生什么样的变化,如大调的自然大调、和声大调、旋律大调,或者是中古调式中的利底亚调式、米克索利底亚调式等,主三和弦都不改变其大三和弦的结构;小调也是如此,主三和弦为小三和弦结构。
以C自然大调各级三和弦为例:
基于以上的简要分析,如果为同一首音乐作品编配和弦,便可以用不同的和弦标记,以《小星星》为例标记如下:
小星星
通过二者不同标记的比较,可以看出固定和弦标记的优点在于无论任何复杂的和弦,都能使演奏者很快找到和弦的位置,对于不具备钢琴演奏基础及音乐理论基础的初学者来说,无疑是很好的一种钢琴伴奏训练方法,读谱反应快。这种记谱法在其他乐器记谱时被广泛使用,尤其是流行音乐中的吉他、钢琴、电子合成器等。
但是这种和弦标记也有其弊端,笔者认为有以下两个方面:第一,这种和弦标记法不利于移调,因为作为钢琴伴奏必然要考虑到,每个演唱者的嗓音条件不同,同一首歌不同的调高表现也不相同,所以,一首作品如果用字母标记,只适用于谱面所给的调,一旦需要移调,就必须更换全部和弦标记;第二,固定和弦标记法造成主旋律与和声部分的调式思维混乱。现行出版的流行音乐,有很多都是简谱记谱,简谱记谱法是首调感觉,读谱非常方便。但是固定和弦标记却是用固定调的,在位一首歌曲伴奏时,主旋律用首调,而伴奏部分的和弦却是固定调,造成的结果是,纵向的调式思维不一致,一旦演奏者和弦反应迟钝必然会影响主旋律的演奏。
功能标记的优点在于:每个和弦的功能色彩明确,对于理解调性、和弦相互关系方面有重要的作用;而且这种标记可以任意移调。
笔者认为,功能标记也有其不足之处:第一,对于钢琴伴奏者来说,如果要进行自由的移调,则必须具备一定的钢琴演奏技巧,对键盘上的每个调都要非常熟悉;第二,作为一个钢琴伴奏者,要具备一定的音乐基础理论以及和声学知识,如和弦结构的基本知识、调式的基本知识、和弦连接、和弦功能属性等等,对于那些初学音乐者,这种方法无疑是增加了较大的难度。
五、结语
结构化标记 篇5
滇南方言的咯是:从疑问焦点标记到话轮转换标记
滇南方言的“咯V”用于疑问句中,相当于普通话的“V不V”和“V吗”两种格式.“咯是”是“咯V”中最为常见的`格式,因此“咯V”语法化为疑问焦点标记,用于表示某种语义格的语词之前,这种语义格就是这个句子的疑问焦点.“咯V”还进一步语法化,失去疑问语义,只标记话轮转换.
作 者：路伟 LU Wei 作者单位：红河学院人文学院,云南,蒙自,661100刊 名：红河学院学报英文刊名：JOURNAL OF HONGHE UNIVERSITY年，卷(期)：7(6)分类号：H172关键词：滇南方言 语法化 “咯V” 疑问焦点标记 话轮转换标记
等待梦想被标记 篇6
不知是什么时候，一个天真的小女孩在时间的沙漏里流失了幼稚，也流失了单纯，而剩下的只有无力的挣扎和反复的幻想。
有时候总在想，我们为什么要长大，为什么要有那么多的情感，这样难道很好吗?如果没有这些，我们会更快乐。可是一切都事与愿违。我想，如果有一天，我们不再以时间为坐标轴，不再以生活为行事的标准，是不是就没有如此多的烦恼了呢?
在幼儿园的时候，想到的只是简简单单的一个字“玩”；小学六年级，想到的只是上初中时可以有一辆崭新的自行车；上初三的时候，希望可以考个好高中，可以放松心情，可以好好体会其他一些新鲜的感受。可是，等真正到了某个时候，才知道并不是那么回事。
从进高中的那一刻，就想着是努力。再努力地上好每一节课，做完课后每道习题，然后考好每一场试……日复一日的努力，日复一目的坚持，换来的结果却是——直到现在，我依然算不上品学兼优的好学生，依然很平凡。好在我相信，我并非一无是处，虽然我不再是那个单纯的小女孩，可我依然有着一份与生俱来的朴实与简单。我有着对未来的憧憬、对生活的期望，然后每天坚持对着课本默念：“加油!加油!”
我不知道未来会怎样，至少现在我对得起自己。我舍弃了对恋爱的憧憬，我放弃了对心仪男孩的欣赏，将最初的那点热情和期待都压制在心底，然后埋头奋斗。也许是看了太多小说，至今我还认为做个乖学生真傻，为什么总要牺牲那么多才能跨进大学的大门?可是，我也是简单地这么认为罢了，在心灵深处，始终不变的，仍旧是对梦想的坚持与坚持。
我每天的生活都是在数理化中穿梭、徘徊，因为我要超越那可恶、不争气的分数。有时候很累，累到自己想要放弃，可我还等着，等着我的梦想被标记，然后出现在现实生活的某一天、某一刻。
再过不了多久，我就要成为高三的学生了，一个包含太多的名字，一个承载着梦想的名字，也是飞向广阔天空的大门。我不知道自己能否实现自己的理想，但我想我只能竭尽全力，在此刻也许会害怕，但我想更多的是急切吧!
我想不会再有童年那些快乐无忧的日子了吧!每天的每天，忙的想的都是关于没有发生的未来。是的，要往前看了，人长大了，高了，一切都要朝前看了吧!
不喜欢欺骗生活，同时也希望生活不会欺骗我以及我的期待和梦想。也许会在某一天，某个角落打动某个走失的天使，也许他会眷恋着我。
编辑／梁宇清
分子标记发展简史 篇7
1 分子标记的来源及定义
1.1 分子标记的来源
“标记”一词, 根据汉语大词典的解释, 是“便于识别的标识或者记号”。随着人们对生命本质认识的一步步加深, 在人们研究DNA序列时发现了大量的非编码序列, 甚至占到了全序列的90%以上。这些非编码序列具有特殊的一级结构, 如串联重复、回文结构、Alu序列 (反向重复序列) 、CpG岛等, 并且全基因组分布[3]。随着人类基因组计划的人类基因组框架草图的完成和一个个模式生物的全基因组测序, 一个个新的DNA特异序列被发现并且在染色体上定位, 整个基因组内的标记密度越来越高, 并且大量的特异序列与不同的基因片段有着不同程度的连锁, 所有这些标记构成了人类研究探索各种生物基因组DNA的地图与路标。
1.2 分子标记的定义
广义的分子标记指可遗传并可检测的DNA序列或者蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶 (不同基因位点编码的酶的不同分子形式) 及等位酶 (同一基因位点上不同的等位基因编码的酶的不同形式) 。狭义的分子标记仅仅指DNA标记, 一般所称的分子标记即被界定在此范围之内[4]。这是因为在应用上DNA标记比蛋白质标记广泛的多。蛋白质的结构比DNA的结构复杂的多。构成蛋白质的氨基酸有几十种, 而构成DNA的碱基只有4种, 通过指数级的排列方式仅是其一级结构的可能性就有数量级上的差异, 且不计蛋白质更加复杂的二级、三级、四级结构及其结构域。并且到目前为止, 蛋白质的复制与合成远不及DNA复制技术成熟, 可控性也不高。因此, 蛋白质标记应用远不如DNA标记方便和广泛。但从更严格的意义上讲, 蛋白质标记是研究生命现象更为精确的标记, 因为其更稳定、多态性更高, 每种蛋白质都是唯一的 (序列唯一、构象唯一) 。
1.3 理想的分子标记
理想的分子标记必须达到以下要求: (1) 具有高多态性; (2) 共显性遗传, 即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型; (3) 能明确辨别等位基因; (4) 遍布整个基因组; (5) 除特殊位点的标记外, 要求分子标记均匀分布于整个基因组; (6) 选择中性 (即无基因多效性) ; (7) 检测手段简单、快速 (如实验程序易自动化) ; (8) 开发成本和使用成本尽量低廉; (9) 在实验室内和实验空间重复性好 (便于数据交换) [5]。
特别需要提出的是, 所有的分子标记都必须满足和某个基因或者已知标记紧密连锁 (连锁程度越高越好) 甚至共分离。
但是, 目前发现的任何一种分子标记均无法同时满足以上所有要求。使用者可以根据自己的实验目的和要求具体选用某种标记技术。
2 目前常用分子标记的基本原理
2.1 限制性片断长度多态性 (RFLP)
限制性片断长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism) 是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的分子片断大小的差异。此技术基于生物个体的基因组的变异, 是研究不同基因组间的差异的技术, 由Grodzicker于1974年首先提出。其基本原理是:物种经过长期的进化, 各个种属甚至品种之间的同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点不同, 或者由于突变、重组等原因引起限制性内切酶位点上的核苷酸的变化。若引起DNA分子某一特定内切酶识别位点序列内发生变化, 这样该位点就不能被切开, 使得DNA片段比亲本长;若突变后形成新的酶切位点, 则酶切后的片断变短。这样, 通过电泳可以将大小不同的片断区分开来。对于分子量较小的质粒DNA就可直接观察到DNA长度的差异, 但对于核DNA而言, DNA片断呈连续分布, 无法辨别差异, 需通过Southern杂交转移至支持膜上, 用单拷贝或低拷贝的DNA克隆作为探针与膜上的酶切片断杂交, 通过放射自显影或非同位素显色技术, 发生变异的材料显示的带就可能与亲本的带处于不同位置。检测出与此标记DNA相关的片段构建出多态性图谱, 即为RFLP[5,6]。这种特定的限制性片断与DNA探针的组合, 便可以作为遗传标记。由于RFLP起源于DNA的变异, 不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响, 具有遗传的专一性和稳定性的特点, 在数量上不受限制, 可随机选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记, 而且每个标记变异大, 检测方便。用于检测RFLP的克隆探针可随机选取, 可以是使核糖体DNA、叶绿体DNA, 也可以是总DNA。这样就可以获得能够反映遗传差异的大量多态性, 为进行资源分析、品种鉴定、物种进化、基因定位、亲缘关系和遗传距离的分析, 遗传图谱的构建提供了有力的工具。并且RFLP是共显性标记, 能够区别出杂合体与纯合体[7]。虽然RFLP具有结果稳定可靠, 重复性好, 特别适合建立连锁图等优点, 但也具有检验步骤多、周期长、成本高等缺点。并且RFLP对DNA多态性检出的灵敏性不高, RFLP连锁图谱上还有很大的空间区 (gap) , 甚至在使用同位素时可能对人有一定的伤害等等, 这些都是需要进一步完善的地方。
2.2 随机扩增多态性DNA (RAPD)
随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphisms DNA) 是美国杜邦公司的Williams和加利福尼亚生物研究所的Welsh等领导的2个小组于20世纪90年代同时开发出来的一种新的DNA指纹技术。此技术是应用一系列随机引物扩增并寻找多态性DNA片段的遗传标记技术。这一技术建立于PCR反应基础之上, 以随机的短脱氧核苷酸 (通常为10个碱基) 作为PCR引物, 对基因组DNA进行扩增而产生多态的DNA图谱。扩增产生的片段可通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分开, 经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱后进行多态性观察。在基因组上, 每个引物可以连续直接扩增特定的DNA片段, 对一个特定的基因型来讲, 这些扩增的片段或片段的类型是唯一的。它的应用是基于这样的一个理论:对于同一模板DNA, 用同一引物扩增既可能得到相同的带谱 (模板基因组间可能具有同源性) , 也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带即可作为该模板的分子标记[8,9]。事实上, 不同基因组DNA总是有一定差异的, 所以用RAPD即可进行分子标记研究。理论上讲, 在一定的扩增条件下, 扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物, 复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。
RAPD所用的一系列引物的DNA序列虽然各不相同, 但对于某一特定引物来说, 它同基因组DNA序列有特定的互补区域。这些特定区域在基因组的分布如果符合PCR扩增的反应条件的话, 即引物在模板上的2条链如果有互补位置并且与引物的3′端在200bp以内, 就可以扩增出这一片段。如果基因组在这些区域内发生插入、缺失或者替换即可导致这些特定的结合位置分布发生变化而使PCR产物发生增加、缺失或者分子量发生改变, 通过对PCR产物的检测, 即可找出基因组DNA在这些区域内的多态性[10]。由于RAPD分析时所用的引物数量极大, 并且引物序列随机, 虽然对某一引物而言检测的区域有限, 但是利用一系列引物可以检测的区域几乎可以覆盖整个基因组。与RFLP是从一系列酶切片段中寻找多态性片段不同, RAPD是利用PCR随机合成多态性DNA片段, 检测被扩增区域内的遗传特征变化。其具体优点体现在: (1) 极大的丰富性, 能反映整个基因组的变化; (2) 强大的可探测性, 无需合成特定的引物; (3) 高效性与灵敏性。短期内可以得到大量的扩增片段, 只要是遗传特异性的发生变化, 即使亲缘关系很近的个体也可以识别出[11]。
RAPD最大的特点是引物的碱基序列是随机的, 所用引物通常多达几百种, 并且1套引物可以用作多个物种或者群体, 所以RAPD技术在用于遗传多样性和品种鉴定的研究中具有极大的优越性。因此, 用来鉴定品种纯度是很有用的。据报道[9], 从玉米、大豆、小麦及红三叶草干种子中提取DNA并成功地利用RAPD技术扩增DNA片段;中国科学院遗传所陈洪等利用OPP-18引物成功地鉴定了杂交水稻汕优63杂种纯度, 鉴定结果与田间小区种植鉴定完全一致。RAPD技术反应灵敏、多态性强, 操作简便, 速度快, 费用低, 既有大量的随机引物可供筛选之用, 又不受种属的限制, 被广泛用于多种作物的种子鉴定[9,11,12]。
由于是随机引物对整个基因组进行多态性检测, 在技术上简单易行不需要克隆制备、同位素标记、Southern印记等预备性工作, 所需DNA样品量少, 安全性好, 价格便宜, 是继RFLP之后应用最广的分子标记。由于引物没有特异性, 1套引物可用于不同生物基因组的的分析, 分析速度快, 短期内可得到大量的遗传标记, 并克服了同工酶位点少和RFLP操作技术复杂的弊端, 已经广泛应用于遗传作图、基因定位和克隆、物种进化及鉴定特殊染色体区段的鉴别和分离以及动植物育种等方面, 特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面, 近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的RAPD标记。水稻的Xa-21基因和西红柿的pto基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RAPD标记, 然后通过定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。
与PCR相比, RAPD具有以下特点: (1) RAPD使用的是随机引物, 不需要预先了解目的基因和相应的序列; (2) 操作简便, 实验周期短, 能在较短的时间筛选大量样品; (3) 引物具有普遍适应性, 适用于自动化操作分析。
与RFLP相比, RAPD具有以下特点: (1) RAPD分析只需要少量模板, 1次扩增仅需20~100ng, 这对于DNA量很少的材料进行基因组分析有利。比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA分析是切实可行的。 (2) RAPD标记具有更大的随机性, 亦有利于图谱的构建。对于DNA含量大的和多倍体物种, RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交, 所得到的混合指纹会对其他等位基因的阐明带来困难。而且由于DNA量较大, 进行单拷贝的Southern杂交不很实际, 至少需要很长的曝光时间, 并且已知的探针数量有限。RAPD大大增加了可构建遗传图谱物种的数量。 (3) 无需借助于有伤害性的同位素, 耗费的人力物力少。 (4) 灵敏度高。引物中的个别碱基的变化会引起扩增条带和强度的剧烈变化, 这是RFLP所无法比拟的。短期内可以得到大量的扩增片段, 只要是遗传特异性发生变化, 即使亲缘关系很近的个体也可以识别出。 (5) RAPD标记可以覆盖整个基因组, 包括编码和非编码区, 可以反映整个基因组的变化。但是, 由于引物的竞争性等, 基因组的RAPD位点有时不能全部检出, 造成假象上的差异, 这在种属亲缘关系的研究上尤其明显。 (6) RAPD产物有大于50%的条带扩增于单拷贝区, 经过克隆和序列分析后, 可作为RFLP和原位杂交的探针, 在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。
随着RAPD日益广泛的使用, 其不足之处也逐渐显现, 比如标记的显隐性位点性, 致使其不能在后代中区分杂合体和纯合体;稳定性差, 由于是单链引物随机的结合, 在众多的反向重复序列上, 每次的实验结果可能不一致。解决办法是对单链引物进行筛选, 优化PCR条件;高度的变异性, 即使在亲缘关系很近的物种间, 结果也可能差异极大;Tm值低的随机引物易受外界环境影响, 如Mg2+浓度等[8,9,14]。
由于RAPD技术是由多种成分参加的生化反应, 反应中各种成分均为微量, 尽管其反应灵敏度高, 但是影响因素较多, 故而RAPD受环境影响很大, 稳定性差, 重复性也不好, 因此对实验的设备、条件及其操作的一致性很严格, 这又大大限制了它的使用。为了得到较稳定的结果, 各种反应参数必须事先优化选择, 操作中每一步都必须小心谨慎, 以防止出现差错。
2.3 特征序列扩增区域 (Sequence-characterized amplified regions, SCAR)
RAPD标记一般表现显性遗传, 但若某RAPD片段不是重复序列, 也可将其转化为RFLP标记。另外, 为了提高某一理想RAPD标记的稳定性, 可首先将其克隆并对其末端测序, 之后, 在原来RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸, 以此为引物对基因组DNA再行扩增分析, 此即SCARs (Sequenced Characterized Amplified Regions) 标记[15]。
SCAR首先由Parar和Michlmore (1993) 提出并应用。SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。其基本步骤是:先作RAPD分析, 然后把目标RAPD片段 (如与某目的基因连锁的RAPD片段) 进行克隆和测序, 根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物 (一般比RAPD引物长, 通常24个碱基, 是在原RAPD引物的3′与5′端延长14个碱基) , 利用两端各24个碱基的引物再进行PCR特异扩增, 这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。总的来说, SCAR比RAPD和其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好, 因为它有更高的可重复性 (原因是使用的引物长) , 标记是共显性遗传的[16]。
该方法与RAPD相比, 具体有如下优点: (1) 由于有较长的引物, 退火温度较高, 因此具有更高的检测稳定性; (2) 有将显性RAPD标记转化为共显性的SCAR标记的可能性; (3) 如果是显性标记, 则在检测中可以直接染色而不需电泳检测。另外, 用RAPD找到扩增片段后不再设计引物, 而是直接测序后通过电脑软件分析 (如用ClustalX软件进行对位, MEGA软件计算DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数, UPGMA软件建亲缘关系树状图等) , 找出特异性的碱基作为鉴定的特异性标记[17]。
2.4 与RAPD技术相近的分子标记种类
下面提到的所有技术都是利用1个或2个短的富含GC碱基的随机引物。
(1) DNA扩增指纹图谱 (DNA amplification fingerprinting, DAF) [18]。与RAPD技术不同的是, 在DAF分析中, 引物浓度更高, 引物长度更短 (一般5~8个碱基) , 只有2个温度循环 (在RAPD中是3个温度循环) , 并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳, DAF通常会产生非常复杂的带型。
(2) 任意引物PCR (arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR) 。AP-PCR使用的引物较长 (10~50个碱基) , 但PCR反应前2个循环的严谨条件较低, 最终的反应结果与RAPD类似[19]。在AP-PCR分析中, 扩增分为3个部分, 每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异;在第1个PCR循环中, 引物浓度较高;引物长度不定, 并且常常来自为其他目的而设计的引物 (如M13通用测序引物) 。
2.5 扩增片段长度多态性 (AFLP)
扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism) , 亦称选择性限制片段扩增 (SRFA, Selective Restriction Fragment Amplification) , 是荷兰Keygene公司的Zabeau Marc和Vos Pieter于1993年创建的一种新型的分子标记, 并于当年获得了欧洲专利局专利[20]。
它是RFLP和PCR相结合的分子标记技术, 既有RFLP的可靠性, 又有PCR (如RAPD) 的灵敏性, 多态性高。其基本原理是利用PCR技术选择性扩增基因组DNA双酶切后产生的限制性片断。基因组经2种限制性内切酶消化以后将一双链DNA人工接头 (artificial adapter) 连接于限制性片断两端。然后根据接头序列和限制性位点附近的区域的碱基序列, 设计一系列3′端含数个随机变化的选择性碱基的PCR引物进行特异性条件扩增, 只有那些限制性位点的侧翼序列与引物3′端选择碱基相匹配的限制性片段才能得以扩增。这些选择性碱基数目的多少主要是由待测样品的基因组大小决定, 选择性碱基数目多, 选择性就强, 扩增产物就少;反之, 其数目就少, 选择性弱, 扩增产物就多。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离显示其多态性。当不同基因组DNA中因为突变引起限制性位点的数量发生改变或2个限制性位点之间的区域内发生碱基插入、片段消失或顺序重排时, 电泳谱带显示多态性, 多态性以扩增片段的长短不同和数量多寡显示出来[21]。
AFLP的技术特点包括以下几个方面: (1) 使用2种内切酶消化模板DNA。一些酶的切割位点较多, 如MseI、TaqI、XbaI等, 另一些酶切位点较少, 如PstI等等。采用双酶切割的原因是:多切点酶产生小片段, 便于凝胶分析切点数少的酶减少扩增片段, 由于AFLP反应中扩增片段是2个酶共同酶切的片段, 这样减少了选择扩增时所需的选择碱基数。双酶可以进行单链标记, 从而防止电泳中因为双链泳动不均而产生的双带假象。并且可使少量引物产生许多不同的引物组合, 从而产生大量的不同的AFLP指纹图谱[22]。另外, 不同物种基因组的AFLP过程中使用的限制性内切酶也不尽相同。EcoRI可靠廉价, 是6碱基内切酶的首选。分析真核生物基因组时大多使用MseI (4碱基) , 因为MseI的识别序列是TTAA, 而真核生物基因组富含AT序列, 与TaqI相比 (其识别序列为TCGA) , 可以获得更多的便于PCR扩增和电泳分离的小片段DNA[23]。 (2) AFLP的接头为双链寡核苷酸。人工合成时接头未进行磷酸化处理, 所以只有1条单链连接于酶切片段的末端。 (3) 与常规的PCR相比, AFLP的引物有其独特性。其引物有3部分构成:与接头互补的核心序列、内切酶识别序列以及3′末端的选择性碱基。该类引物的一个重要特征是通常以鸟苷酸G开头, 这样可以有效的形成双链, 不过当dNTP浓度过低时容易形成双链结构。此外, 选择性碱基的数目影响着AFLP反应的特异性。研究表明, 引物带有1~3个选择性碱基时扩增的选择性较好。当选择性碱基超过4个时, 扩增的错配程度超过了允许程度, 故而AFLP的选择性碱基数目一般不超过3个, 具体数目取决于基因组的大小。研究表明, 分析500Mbp以下的植物基因组时用EcoRI+2 (2个选择性碱基) /MseI+3引物组, 500~6 000Mbp的基因组应采取EcoRI+3/MseI+3较为严谨的引物组。微生物通常采用1个选择性碱基的引物组[24]。 (4) AFLP的PCR扩增分两步进行。首先预扩增, 其扩增产物经过一定比例稀释后, 以此为模板再进行选择性扩增。两步扩增可以减少扩增产物中的非特异性带, 降低了不清晰电泳造成的指纹图谱的背景, 提高了指纹图谱的清晰度, 还可以增加扩增片段数, 为AFLP分析提供充足的模板。
AFLP技术不仅具有其他分子标记的优点, 即位点数量无限, 呈典型的孟德尔遗传, 无表型、复等位效应, 不受环境影响等, 还具有一些独特的优越性, 如标记异常丰富, 典型的AFLP反应中, 1次电泳可得到100~150个扩增产物, 其他标记技术难以达到。稳定性、重复性好, 应用非常广泛, 可用于任何生物基因组的遗传分析。与PCR技术结合, 可在短时间内得到大量多态性标记。同时对模板浓度不敏感, 模板需求量也小。Vos Pieter在对番茄基因组AFLP分析时, 证实了模板浓度在相差1 000倍以内 (0.000 5~25ng) 获得的指纹图谱基本一致。另外, 在AFLP中标记的引物会全部耗尽, 引物耗尽后, 扩增的带型不受循环数的影响。这样模板浓度即使不一致也可以通过增减循环次数的方法获得强度一致的带型。目前, AFLP是构建基因组特定区段高密度连锁图谱的最有效的方法。此外, AFLP全基因组分布非常适合构建遗传连锁图谱。AFLP也可以用于检测DNA库 (DNA pool) 克隆的DNA大片段的多态性, 而且其多态性的标记大多对应于基因组的某一位置, 这样就可以和STS一样, 成为遗传图谱 (genetic map) 和物理图谱 (physical map) 之间的桥梁[25,26]。
实际操作中, 影响AFLP指纹图谱结果的因素很多。因此, 应采取质量高、纯度好、分子量大的的基因组DNA作为模板。如果模板中含有其他杂质或者DNA降解很严重, 导致酶切不完全, 许多未经酶切的模板片段经电泳后产生表现为高分子量的条带 (假带) , 导致不能真实地反映被测物种的多态性。为了避免电泳的条带过多或者过少, 应对PCR反应体系进行优化, 筛选出最佳的引物组合。PCR扩增时, 应在模板变性之前加入Tag酶和dNTP, 否则会导致扩增失败。反应体系中的dNTP浓度不能过低, 否则扩增产物容易形成双链结构[21,27]。
2.6 序列标签位点 (STS)
序列标签位点 (Sequence-Tagged Site, STS) 指的是一段序列已知并且能够在基因组中作为“路标”使用的DNA序列, 是对由特定引物序列所界定的一类DNA标记的统称。其最大特点就是利用特异PCR, 因此结果非常可靠。显然, 成为STS必须满足2个条件: (1) 序列已知; (2) 位置确定并唯一。从理论上讲, 任何一段DNA都可以成为STS。但是, 由于需要的是与某一个目标性状基因或已知的标记紧密连锁的DNA片段, 因此能够利用的STS数量则非常有限。根据单拷贝的DNA片段两端的序列设计1对特异引物扩增基因组DNA, 产生的一段长度为几百bp的特异序列在基因组中往往只出现1次, 从而能够界定基因组的特异位点。在人类基因组作图中已用其作为将遗传图谱与物理图谱整合的共同位标, 这在基因组作图上具有非常重要的作用。随着大量的模式生物的全基因组测序, 会有越来越多的可利用的STS被发现。
2.6.1 表达序列标签标记 (Expressed Sequence Tags, EST) 。
EST是指一小段 (通常长度300~500bp) 单次重复的mRNA序列或cDNA序列。它们在特定的组织或者特定的时期内特异的表达, 可以看作是特定的cDNA文库中的标记。EST计划由美国科学家Venter于1989年提出, 并首先应用于人类基因组研究, 之后被广泛用于植物基因组研究, 它是通过大规模的cDNA随机测序, 从而获得对基因组认识的一种研究策略。目前, 许多国家和组织正在开展某些作物基因组EST计划的研究, 如成立于1998年的国际小麦族EST协作网 (International Triteace EST corperation, ITEC) , 就是致力于麦类EST研究和开发的[28]。近几年来, 国际公共数据库中的EST序列呈指数增长, 截止到2006年8月, 美国生物信息中心 (NCBI) 数据库Genbank已公布涉及205 000种生物的61 132 599条EST序列, 总长度共65 369 091 950bp。
快速增长的ESTs数据为SSR标记的开发提供了一个巨大的有价值的来源。首先, 避免了传统SSR标记开发需要构建基因组DNA文库等烦琐步骤, 而且从ESTs中发掘出的SSR只是ESTs测序计划的副产品, 从而节省了大量人力物力[29];其次, 其本身是功能基因的一部分序列, 所以它将为功能基因提供“绝对”的标记[30]。同时, 由于不同物种间基因共线性和保守性, 从一种作物中开发的EST-SSR可同时用于其他作物研究, 从而能够为比较基因组学和同源基因克隆提供新的途径[31]。现在EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。
另外, 还有一种被称为GSS序列的标记。GSS序列本质上和EST序列是一样的, 不同之处是它的序列直接来源于基因组而不是mRNA或cDNA。它通常有以下几种来源: (1) 全基因组检测得到的特异/单次重复序列; (2) 来自质粒/BAC/YAC克隆所得到的单次重复序列; (3) 基因组外显子捕获; (4) 通过Alu—PCR得到的序列。
2.6.2 微卫星 (SSR) 。
微卫星 (microsatellite) 又叫做简单重复序列 (Simple Sequence Repeat) 或者短串联重复序列 (Short trandem repeat, STR) 、简单序列长度多态性 (Simple Sequence Length Polymorphism, SSLP) 。简单序列重复多态性 (Simple Sequence Repeat Polymorphisms, SSRP) 微卫星指的是真核生物普遍存在的遍布整个基因组的排列为2~5个核苷酸的短串联重复序列, 如 (CA) n、 (GT) n、 (CAG) n等, 尤以 (CA) n重复序列最为常见, 其长度由重复单位的拷贝数决定。在真核生物基因组中微卫星很丰富, 通常长度能够达到150bp, 是一类呈高度多态的遗传标记, 不仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位与克隆, 而且可用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。其重复单位数目的改变可以引起相当高的多态性, 但突变率仅为0.5×10-4~5.0×10-4, 在家系中可以稳定地遗传, 是一种很好的遗传标志[32]。
微卫星约占真核基因组的5%, 其基本构成单位一般为1~8bp, 多位于编码区附近, 也可位于内含子、启动子及Alu序列 (反向重复序列) 中。人类基因组约有5~10万个 (CA) n重复序列。通常认为重复序列的产生是由于在遗传物质复制过程中DNA滑动或在有丝分裂、减数分裂期染色体不对等交换所致, 因此该重复序列多存在于不经严格选择的基因组区域。目前普遍认为微卫星充当基因重组的热点是基因重排和变异的来源[33]。微卫星不稳定性 (microsatellite instability, MSI) 是指由于复制错误 (replication error, RER) 引起的简单重复序列的增加或丢失, 也称RER阳性或RER表型。MSI首先在结直肠癌中观察到。微卫星通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用。
由于微卫星的寡核苷酸在同一物种的不同基因型之间差异很大, 可以利用特异引物进行PCR扩增。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定保守序列设计, 用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大, 所以这是检测多态性的1种有效方法[34]。其特点包括:一般检测到的是1个单一的多等位基因位点;共显性遗传, 故可鉴别杂合子和纯合子;得到的结果复性很高。为了提高分辨力, 通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳, 它可检测出单拷贝差异。也可以在同1个反应试管中把PCR反应与不同的SSR引物结合起来 (称为multiplexing) , 这可节省时间, 但是, 这只能在不同引物的产物在大小上下不重叠的情况下才能使用[35,36]。很显然, 使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息, 这一方面可以在其他种的DNA数据库中查询, 否则就必须先建立含有微卫星的基因组文库, 再从中筛选可用的克隆, 进行测序, 然后设计合适的引物。同时, 这种由保守序列确定的微卫星序列也具有染色体位点的特异性, 因此1981年Miesfeld等首次发现微卫星后, 很快成为1种常用高效的分子标记。统计分析表明, 不同的物种其微卫星的突变频率也是稳定的。SSR的PCR引物也是对某一高变重复位点高度专一的。用特定引物扩增出相应的微卫星片段后, 再通过电泳分离, 差异可经过EB或者银染后观察。一般种群可显示出超过10种类型的等位基因。微卫星不仅重复单位变异数大, 而且其重复区域总长度又在PCR易于扩增的区域, 快速简便, 所需的DNA用量小。与等位酶相似, 微卫星是具有独立的共显性基因。由于微卫星的遗传中性并且比等位酶法有更多的可供检测的等位基因, 这样就可以提供更加精细的基因变化的范围, 因此在种群研究上有着更大的应用[3,34,37,38,39]。
简而言之, 微卫星的最大优点在于通过简单的PCR扩增即可直接检测到已知的特定的染色体位点, 不仅具有一般PCR操作简单、快速、成本低的特点, 还具有RFLP的稳定可靠、特异性、共显性等特点, 不足之处是其引物开发难度较大, 技术复杂, 周期长, 成本也高。不过随着众多模式生物的全基因组测序的飞速进展, 对全基因组了解的日益全面, 各个大型数据库的逐步完善, 并且借助越来越发达的计算机计算和预测技术, 使得开发成本有所降低。
2.6.3 其他具有特定引物的分子标记种类。
(1) 加锚微卫星寡核苷酸 (Anchored microsatellite oligonucleotides) 。Zietki-ewicz et al (1994) 对SSR技术进行了发展[40], 他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物, 对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5′端或3′端加上2~4个随机选择的核苷酸, 这可引起特定位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR (inter-simple sequence repeat) 、ASSR (anchored simple sequence repeats) 或AMP-PCR。这类标记往往是显性遗传的。在所用的两翼引物中, 可以1个是ASSR引物, 另1个是随机引物。如果1个是5′端加锚的ASSR引物, 另1个是随机引物, 则被称为RAMP技术。
(2) CAPS (Clea-ved amplified polymorphic sequence) 。CAPS技术又可称为PCR-RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是:先进行PCR扩增, 然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切, 再用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开, 用EB染色, 观察。与RFLP技术一样, CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行RCR产物检测, 其多态性称为ALP。Neff et al. (1998) 在此基础上又发展出dCAPS技术 (derived CAPS) , 这是检测单核苷酸多态性的一种良好方法。
(3) 单引物扩增反应 (single primer amplification reaction, SPAR) 。SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用1个引物, 但SPAR分析中所用的引物不是随机的, 而是在SSR的基础上设计的, 例如可能的序列是 (TA) 10或 (CGA) 6。扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MP-PCR (microsatellite-primed PCR) 。
(4) 小卫星区域DNA直接扩增 (directed amplification o minisatellite region DNA, DAMD) 。直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。
(5) Inter-Alu PCR like genomic profiling。与SPAR技术相近, 也只用1个引物, 但所用的引物是在Alu序列 (反向重复序列) 的基础上设计的, 扩增的是copia (另一种反向重复序列) 序列之间的DNA序列。
(6) ISTR (inverse sequence-tagged repeat) 。这种技术与SPAR技术也相近, 所用的引物是在copia序列的基础上设计的, 扩增的是copia序列之间的DNA序列。
(7) IFLP (intron fragment length polymorphism) 。检测的对象是内含子的长度差异。根据内含子两端的特征序列设计引物, 扩增出长度不同的内含子片段。
(8) RAMPO (random amplified microsatellite polymorphism) 。RAMPO的英文全名与RAMP的英文全名相近, 但实验方法却不同。RAMPO的基本步骤是:先用1个单一的随机引物 (即RAPD引物) 对基因组DNA扩增, 用电泳将扩增片段分开, 然后, 把凝胶转移到尼龙膜上, 使之与一个带有放射性标记 (或其他标记) 的与SSR互补的寡核苷酸探针如 (CA) 8和 (GA) 8杂交, 放射自显影后可得到新的多态性类型。
先找到RFLP标记后, 对RFLP探针进行测序, 再合成适当的PCR引物, 这样可发现新的STS标记。这也可称为RFLP-PCR。
3 抗性基因同源序列 (RGA)
近年来, 在各种农作物抗性育种的进程和模式生物的抗性研究中, 在水稻、玉米、番茄、马铃薯、烟草、拟南芥等植物中克隆了若干抗性基因, 包括植物对病毒、细菌、线虫的抗性基因。例如烟草抗花叶病毒基因、水稻抗白叶枯病基因Xa-21、拟南芥抗丁香假单胞杆菌基因RPS2、亚麻抗锈病基因L6以及甘蔗抗胞囊线虫基因HS1等。
Leister等通过分析研究已克隆的植物抗病基因的结构特征, 发现很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年, 《美国科学院院刊》在同一期发表了2篇应用同源序列从大豆中克隆R基因同源序列的报道, 从而引发了同源序列法在植物抗病基因研究中的应用。随后的大量研究表明, 植物抗病基因中存在多种类型的保守结构域。Hammond Kosack和Parker通过分析已克隆的植物抗病基因结构, 将植物抗病基因分为8类, 其中, 含有NBS-LRR (富亮氨酸重复子Leucine-rich Repeats, LRR) 结构域的抗病基因是最主要的类型。
这些结构可能是参与蛋白质之间的相互作用或者细胞信号的传导以及识别。根据抗性基因的这一共性, 以其保守结构的序列为基础设计引物, 在任何作物中, 用PCR技术扩增和分离具有相似序列的DNA片段, 即抗性基因同源序列。
RGA提供了一种快速鉴定候选抗性基因的便捷途径。目前已经利用此技术在小麦、大豆、马铃薯中鉴定了候选抗性基因, 它们在基因组的位置基本上就在已知的抗病基因区域。已知基因包括抗病毒、细菌、真菌和线虫的基因。而且部分与抗性基因紧密连锁的标记本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此, 应用RGA进行基因定位可以较快地检测到与抗性基因紧密连锁的分子标记。可以预见, RGA将成为抗性基因定位的重要手段, 并且在分子作图的领域将发挥更加巨大的作用[41,42]。
4 单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphisms, SNPs)
单核苷酸多态性是指2套基因组的DNA序列两两进行位置比对时, 单个核苷酸的的不同而显示出的差异 (多态性) 。因此, SNP反映了过去多数突变事件的特点, 2个个体在同一位点携带的不同等位基因被认为是进化的遗传标志。显而易见, SNP是目前已知的多态性最高的分子标记。据Genbank估计, 如果比较2套人类基因组的DNA序列, 出现SNP的频率可达1/2 000~1/1 000, 看起来这个频率并不高, 但是考虑到人类基因组共有3.2×109bp时, 即可能出现3.2×1012个SNP位点时, 这个数量已经相当可观了。并且这只是2套基因组之间的比较, 所有的SNP位点肯定比这个数字大得多。水稻中SNP分布频率也很高, 平均1 000bp就有1个SNP, 这些标记随着水稻基因组的实施而被发现和利用。由于SNP具有同一个位点多态性低而全基因组多态性又极其丰富的特点, 并且分析时只需要进行阴/阳性分析而不需进行片段的长度分析, 特别适合用DNA芯片技术进行大规模的扫描分析, 是继微卫星后最为高效的标记。不过其昂贵的成本 (开发和使用的成本都很高) 使其应用受到一定的限制。建立可供利用的SNP标记需经过以下几步: (1) 全基因组测序; (2) 根据测序结果确定特定的序列标记位点; (3) 对STS进行扫描, 寻找SNP位点; (4) 确定SNP; (5) 将SNP定位到染色体上。
5 单链构象多态性 (Single Strand Conformational Poly morphism, SSCP)
SSCP是指DNA单链构象的多态性, 是基于PCR扩增而新发展起来的一项检测DNA多态性的分析技术。在进行SSCP分析时, 利用PCR特异的扩增出基因组目的DNA片段, 然后将这些扩增出来的DNA片段进行变性处理, 使双链DNA分开成单链, 再用非变性凝胶电泳分离。由于在自然状态下, 单链DNA会折叠卷曲, 形成一定点空间构象, 这种空间构象是由DNA链的碱基序列决定。如果扩增的目的DNA片段序列的碱基发生了变异, 就可能造成其单链的空间构象发生改变, 从而影响其单链电泳时的迁移速率, 导致其在电泳图谱上的带纹位置不同, 显示出不同生物个体DNA的特异性。
6 新型分子标记的开发及其应用前景
自从20世纪70年代第1代分子 (RFLP) 标记出现以来, 分子标记家族迅速发展繁荣起来, 并且准确性和灵敏性也一步步提高。目前的SNP技术已经可以在单个核苷酸的水平上找出不同样本之间的差异, 即使它们之间的亲缘关系非常接近。
纵观分子标记的发展, 是伴随着人们对生命本质的认识一步步加深, 认识范围从宏观表型一步步逼近微观世界的进程同步发展的。任何一个特殊生命现象的发现, 都可能导致革命性的理论或技术的产生, DNA双螺旋理论的提出导致了DNA的自我复制理论, 又进而导致了PCR技术以至于后来的全自动PCR仪的问世 (当然也少不了其间Taq聚合酶的发现) 。比如各种类型的外切酶和内切酶的发现导致了RFLP技术的产生。
话语标记研究综述 篇8
早在20世纪50年代初Quirk在一次题为《随意的交谈———日常口语的一些特征》的讲座中就明确谈到, 一些在日常口语中一再出现的修饰语, 如well、you see, you know等, 这些修饰语在语法结构和信息传递中没有起到任何作用, 却频繁出现在口语交际中, 无论是今天的口语还是莎士比亚戏剧中的普通谈话都大量使用。因此, Quirk认为这些在日常交际中经常出现的标记应该具有相当重要的价值。Quirk的这些修饰语跟我们所说的话语标记非常相似, 但由于缺乏理论基础, 在以后二十年间并没有人对此继续加以研究。到了20世纪70年代, 随着话语分析的逐渐兴起, 很多学者的兴趣开始转向日常口语, 并把注意力集中在像“well、youknow”等这些不影响话语间关系的表达式上。然而这一时期对话语标记的研究多是把它们当成话语分析的手段, 还没有形成专门的领域。真正把话语标记作为考察对象并形成专门领域来研究是在80年代以后。
二.发展历程
进入80年代以后, sman最早对话语标记进行了研究, you know是他研究的第一个话语标记语, 他把它称为语用小品词。他认为, 语用小品词可以帮助说话人传递他们的各种态度和情感, 进而为话语的理解提供方向。Levinson虽然没有直接使用话语标记语或小品词之类的术语, 但是也发现了这一类现象, 在1983年出版的《语用学》一书中曾作过这样的论述:“英语, 实际上在大多数语言中, 都有许多词和短语用来标记某一话语与前面话语之间存在某种关系。如经常用于句首的but、therefore、inconclusion、to the contrary、well等等。人们普遍认为, 这些词至少有一种意义, 即非真值条件意义。它们的作用就是通过各种方式来标明它们所在话语是如何与前面话语互相照应、彼此延续的” (1983:87-88) 。虽然列文森并没有对这些表达式作更深入的探索, 却引起了其他学者对话语标记的研究和关注。1987年, Georgetown大学的语言学系教授Schiffrin撰写了专著《话语标记》, 在这篇论著中她细致分析了英语中11个常用的话语标记oh、well、and、but、or、so、because、now、then、you know以及I mean, 考察了它们在自由会话中的意义及其在话语不同层面上对话语连贯所起的作用。这本书是目前语言学界普遍认可的, 在话语标记研究领域具有很大的影响力。进入20世纪90年代后, 美国学者Fraser从句法角度进行了研究, 在1999年的“Whatarediscourse markers”一文中, 他认为话语标记语是一些语用类别, 是从连词、副词和介词等语法范畴中抽取出来的, 它们具有自身的句法特征, 但它们在话语中又具有丰富的语用功能, 提示当前话语与前一话语之间的某种标记, 为话语理解提供方向。Blackmore (1992, 2002) 从认知-语用角度, 以Sperber和Wilson的关联理论为依据, 研究话语标记是如何在语用推理中发挥作用。她认为话语标记就是根据它们所表达的推理关系来限定对它们所在话语理解的表达式。在日常交际中, 说话人往往会通过某种形式去制约或引导听话者对该话语的理解, 使用话语标记语就是实现这一目的的一个重要语言手段。
三.国内话语标记的研究
1.对话语标记的介绍
在国内, 冉永平和黄大网这两个学者对话语标记的综述进行了比较全面的研究。冉永平 (2000) 在《话语标记语的语用学研究综述》一文中, 从语用学角度概述话语标记的研究现状与发展特点。话语标记语是近年国外会话分析、语用学研究的一个新课题, 对话语标记语的研究已由“句法/语义-语用”为核心的分析逐步转向“语用-认知”研究。话语标记语是日常会话中一种十分常见的话语现象, 其作用是丰富多彩的, 但在话语中它们的功能主要是语用的。在认知上, 话语标记语可从局部或整体上对话语理解起引导或路标的功能, 帮助听话者识别话语的各种语用关系, 从而在认知上对话语理解进行制约。
第二年黄大网发表《话语标记研究综述》一文, 文中回顾话语标记在国外研究的起源, 追溯话语标记研究的发展历程, 介绍各个时期的不同点;同时对一些理论问题的不同看法, 诸如话语标记的界定、“相关”还是“连贯”等作了介绍与归纳。最后作者着重介绍话语标记这一交叉领域研究的最新动向, 话语标记在计算语言学、社会语言学、翻译、跨语言对比以及应用语言学领域将大有可为。
2.话语标记语的语用功能和意义
Holker (1991) 指出, 话语标记语的功能主要体现在以下四个方面:a.他们不对话语的真值条件产生任何影响b.它们不会增加话语的命题内容c.它们与说话时的情景有关d.他们具有一定的情感功能或表达功能, 但却不具备指称功能、指示功能或认知功能。
何自然、莫爱屏 (2002) 应用关联理论解释了话语标记语在语用照应方面的制约功能。语用照应是人们在理解过程中通过语用推理而寻找出来的照应关系, 具体指话语中的待释名词词组与前述话语中的指称对象的照应关系。作者通过对语料的分析, 阐释了话语标记和语用照应之间的互补作用。即在理解话语时, 一种现象可以作为另一种现象的补足和说明。这种互补作用直接制约着人们的言语交际。通过对这两者之间关系的分析也为研究和理解话语提供了一个新的途径。
于国栋、吴亚欣 (2003) 把话语标记语看成是在语言中不影响句子真值、只表达态度或步骤意义的语言成份。它反映语言使用者对语境的一种顺应, 不仅可以帮助说话人构建语篇, 同时还可以实现不同的语用功能以促成交际。他们把话语标记语分为承上型话语标记语、当前型话语标记语和启下型话语标记语三种类型。通过对这三类话语标记语的分析, 作者认为话语标记语是说话人在构建语篇时非常有力的手段和工具。说话人可借助话语标记语在表达自己思想和态度的同时, 帮助或引导听话人理解话语的意义和推导说话人的交际意图。
王正元 (2006) 在话语标记语的连贯与关联研究基础上, 从语义和语用界面来分析话语标记语的意义。传统的语义研究关注话语的真值条件, 即话语本身所代表的意义;而语用研究的视角关注的是非真值条件, 即从话语编码到解码的认知理解。所以, 从语义和语用两个界面去分析话语标记语的意义, 才能公正地对待话语标记语。话语标记语是一种语言形式, 它的主要功能是语用的, 虽然不能直接成为其所在句子中的命题成份, 但是它们具有命题引出和命题推导功能, 对所引出的话语命题有理解外力。
从国内话语标记的研究现状来看, 宏观上以引进、介绍为主, 还没有形成自己的理论体系;所研究的对象都以英语为主, 较少关注汉语中的话语标记。研究内容缺乏系统性, 没有形成专门的研究领域。
话语标记在语篇构建、维持交际流畅、达到交流目的等方面具有重要作用。本文通过对中国知识资源总库中用户下载次数最多的五篇文章为例, 回顾近两年里国内学者对话语标记的研究。虽然话语标记的研究在中国尚处于起步阶段, 但这一新的交叉领域会蓬勃发展起来, 其研究领域和队伍会不断拓展扩大, 研究成果也会层出不穷, 相信话语标记在语言学中扮演的角色会越来越重要, 会有越来越多的人认识到话语标记不可低估的作用。
摘要：话语标记是日常交际中一种十分常见的话语现象, 是近年国外话语分析、语用研究的一个新课题。本文简要回顾了话语标记的起源、发展与界定, 并选取2007-2008这两年内用户在中国知识资源总库 (CNKI) 中下载次数最多的五篇有关话语标记研究的文章来分析国内学者对话语标记的研究现状。
关键词：话语标记,起源,发展,界定,国内研究
参考文献
[1].Schiffrin, D.Discoures Markers.Cambridge:Cambridge Universit y Press, 1987.
[2].何自然, 莫爱屏, 话语标记语与语用照应.广东外语外贸大学学报, 2002 (1) .
[3].何自然, 认知语用学.上海:上海外语教育出版社.2006.
[4].黄大网, 话语标记研究综述.福建外语.2001 (1) .
[5].冉永平, 话语标记语的语用研究综述.外国语, 2003 (3) .
[6].王正元, 话语标记语意义的语用分析.外语学刊, 2006 (2) .
数据包标记技术综述 篇9
由于IP协议自身的不足, IP包的源地址域没有做任何安全措施, 人们可以在其中填写任何内容, 黑客就是利用这个缺陷发起拒绝服务攻击 (Do S) 和分布式拒绝服务攻击 (DDo S) 。使用目前IP包头的信息, 想要追查到攻击者很困难。因为我们能确认攻击者的重要依据就是源IP地址, 而这个地址又是可伪造的, 按照这个地址找到的多数不是真正的攻击者。
IP追踪技术提出的初衷就是要想办法追踪到数据包的源发地址。IP追踪技术的设计目标是:定位特定流的转发路径, 在此基础上尽量减少路由器的工作量, 能向受害者提供有用的信息。I P追踪技术的分类有很多种。按照攻击与回溯 (tracing) 发生的时间, 可分为反应回溯和前摄回溯。前者必须在攻击期间完成追踪任务, 如果攻击结束则追踪无法进行;后者通过记录包信息以便被攻击者在攻击结束后重建攻击路径和确定攻击者身份。按是否有附加的网络带宽占用, 分为带内和带外技术。按路径信息存储的地点, 分为基础设施和终端节点技术。
IP追踪技术最常见的分类方法是将其分为五类:链路测试, 日志记录, 覆盖网络追踪, 基于ICMP追踪, 数据包标记技术。
1 数据包标记技术
1.1 数据包标记技术的提出
在各种IP追踪技术中, 链路测试需要人工参与, 显然不适应DDo S攻击日益增加的网络形式。日志技术需要给路由器再增加附属存储设备, 也许还要增加数据库甚至数据仓库, 把路由器功能复杂化了。ICMP消息技术会增加网络负担, 而如果为了减轻网络负担而降低发送ICMP消息的概率, 这样还原一条攻击路径难度又增加了。那有没有一种追踪技术, 既不过分增加路由器负担, 无需给路由器增添存储设备和数据库, 又不会放大攻击流量增加网络负担呢?数据包标记技术就是这样的追踪技术, 它属于前摄追踪技术, 攻击路径信息记录在IP包自身, 从而不增加网络流量负担, 属于带内技术。该技术的最本质的思想是在包中找出一些未被使用的空间记录路由器的身份信息, 当受害者收集到一定数量的数据包后就可以籍此重构攻击路径。其优点是网络负担不大, 允许事后分析, 无需在各因特网服务提供商 (ISP) 间协调, 大部分这类技术能有效应对DDo S攻击。它的缺点是部分技术需要修改协议, 不能直接应用于IPv6协议, 与IPsec不兼容, 对接收的攻击包有数量要求, 存在攻击路径计算错误问题。
1.2 数据包标记技术的分类
数据包标记技术有多种分类方法, 以路由器为视角可分为: (1) 确定性包标记方法 (DPM) , 即路由器给每个转发的PI数据包都进行标记。 (2) 概率性包标记方法 (PPM) , 路由器以一定的概率给转发的PI包进行标记。以标记包为视角可分为: (1) 节点标记 (Node Marking) :包中只携带一个路由器的地址信息。 (2) 边标记 (Edge Marking) :包中携带的是相邻两个路由器的地址信息。 (3) 多边标记 (Multi-Edges Marking) :包中携带的是包转发路径上多个路由器的地址信息。
1.3 数据包标记技术的发展
最简单的包标记技术是节点附加技术, 其次是节点采样技术, 边采样技术和压缩边分段采样技术, 对压缩边的进一步改进称为增强的包标记方案 (AMIS和AMSII) 。最原始的标记技术是节点附加技术, 路由器在数据包末尾简单的添加自身的IP地址。其优点是实现简单, 缺点是过长的包会导致不必要的分片和MTU发现。节点取样技术以固定概率往数据包中填入自己的IP地址, 优点是克服了包分片和MTU发现, 缺点是重建路径需要大数量的标记包, 而且不能应对DDo S攻击。边取样技术是在数据包中标记相邻两个路由器的地址, 其间的链路就被看作边, 用距离字段来表示该边从被取样后转发的跳数, 其优点是可以使用任意的标记概率, 收敛时间等于从最远路由器收到一个样本的时间, 缺点是需要多位标记空间。压缩边分段取样技术使用相邻路由器地址的异或值表示边信息, 并把这个值分成小片随机的写进包里, 它的优点是节省了标记空间, 缺点是分片会造成重建路径时间指数级增长。增强的包标记方案在压缩边的基础上采用hash函数来减少标记空间, 其优点是极大的减少了路径重建时间, 从而能应对DDo S攻击。有的研究者提出用自治系统编号代替路由器IP地址进行标记的技术。由于自治系统数量远少于路由器数, 所以重构攻击路径需要的数据包数量以及标记所需位数都要比节点采样技术少很多。当然该技术只能追踪到离攻击源最近的自治系统, 不过这似乎不是大的问题。带认证的自治系统标记技术采用了对称密钥加密和单向hash链来确保不会产生虚假的标记包。为了减少重构路径所需数据包数和网络流量负载, 有的学者提出一个即时概率多边IP标记技术。它的改进之处在于路由器仅在接到网络管理员的指令后才进行标记工作, 而且可以在包的Option字段中标记多台路由器的IP地址。确定包标记技术以ISP的网络为最小单位, 数据包只在进入某个ISP的网络时, 被边界路由器标记。该技术的优点是不会暴露ISP的网络拓扑结构, 能应对DDo S攻击, 能克服针对概率包标记产生的标记欺骗攻击。
单纯的将路径信息标记进包中, 可能需要很多包重构路径;单纯的将路径信息保存在路由器上, 路由器可能需要很大的存储空间。于是有人提出了折衷的方法, 即包携带一部分信息, 路由器存储一部分信息。下面四种技术就是这样。概率流水包标记技术让路由器使用缓存队列暂存到达某个地址的包的标记信息, 当收到下一个到达同一目的地址的包时, 先缓存标记信息到缓存队列尾, 然后从队列头中提取标记信息写人数据包。它的优点是使用流水线技术来减少了追踪所需包数, 这样利于较快的发现攻击源。缺点是需要75位的标记空间, 还需要给路由器配置二级存储设备。huffman编码标记技术让每个路由器使用一个链表记录该路由器与邻接路由器的连接关系。标记字段填入的huffman码字表示包到达的那条链路的代号, 采用了huffman编码是为了节省写入PI头的位数。当标记字段空间不足时, 路由器可以转存标记字段内容以及该包消息摘要, 并清空标记字段填入新的huffman码字。它的优点是将日志技术和包标记技术相结合, 均衡了存储耗费。缺点就是需要给路由器配置二级存储设备。分布式链表追踪技术采用PPM技术, 主要思想是保存中间路由器的标记信息到标记信息表中, 路由器如果想标记一个包, 它首先检查该包相关字段, 如果已经有标记信息, 它先保存标记信息, 然后重新标记自己的信息。还有结合标记技术和日志技术的混合追踪方法, 每个路由器都能执行标记和日志功能, 当一个包到来时, 路由器决定执行两个操作中的一个。如果上游路由器是标记包, 则本路由器记录包信息, 如果上游路由器是记录包信息, 则本路由器只标记包。这样就将存储总容量减少了一半。每个路由器维持一个邻接路由器的摘要表, 当它接收到标记包后, 就会向相应的摘要表中填入日志信息。
2 今后的发展趋势
IP追踪中的数据包标记技术还有很大的发展空间。
(1) 高速网、无线网和IPv6上的包标记技术将是今后研究的热点。目前包标记技术的研究集中在IPv4上, 但随着高速网、无线网的增多, 以及IPv6技术的推广, 针对它们的DDo S攻击肯定会多起来, 所以这方面的研究应该受到重视。
(2) 今后的数据包标记技术会和其他技术相结合 (如pushback技术, 过滤技术) 共同应对网络攻击。包标记技术有着明显的优缺点, 和其他技术结合, 取长补短是可行之举。
(3) 目前的数据包标记研究太侧重于实现追踪功能, 没有重视自身安全。所以包标记技术自身的安全问题也是需要关注的。
(4) 进一步提高追踪路径精度和准确度将也是一个重要的课题。由于追踪精度和追踪开销的矛盾始终存在, 如何在其间选择一个平衡点是需要权衡的问题。
参考文献
[1]Baba T, Matsuda S.Tracing Network Attacks to Their Sources[J].IEEE Internet Computing.2002.
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[3] Durresi, A; Paruchuri, V; Barolli, L; Efficient and secure autono-mous system based traceback. Journal of Interconnection Net-works , June 2004.
[4]Song D X, Perrig A.Advanced and Authenticated Marking Schemes for IP Traceback[C].Proceedings of IEEE INFOCOM'01.Anchorage, Alaska.2001.
[5]LI De-quan, SU Pu-rui.Notes on Packet Marking for IP Traceback[J].Journalo f Software.2004.
[6]JIE She, SUN Le-chang.Improving IP Traceback Performance Based on Tabu Marking[J]. Microelectronics and Computer.vol.24 No.2 2007.
浅析话语标记语「まあ」 篇10
关键词：「まあ」,谈话标记语,性质,功能
一、概述
话语标记语 (discourse marker) 是一种十分常见的话语现象。它们是一些在话语中起语用作用的词语或结构。[1]它们传递的不是命题意义或语义意义, 而是为话语理解提供信息标记, 从而对话语理解起引导作用的程序性意义。它们体现的不只是形式上的特点与功能, 应该被视作话语信息组织的一部分, 其作用不是局部的, 主要是从整体上对话语的构建与理解产生影响, 具有动态的语用特征。[2]日语中「まあ」 (1) 作为话语标记语, 属于感动词·间投词的一种。对「まあ」的相关探究, 最早来自川上恭子 (1993, 1994) 和加藤丰二 (1999) 。
二、关于「まあ」的性质
川上 (1993/1994) 指出「まあ」出现的位置可以再句首也可以在句中, 前者叫做“应答型用法” (2) , 后者叫做“展开型用法” (3) , 二者虽然都有促进谈话的顺利进行的功能, 但是前者谈话的重心放在听话方, 而后者谈话的重心放在说话方。此外「まあ」的出现给原句带来不确定的语感。
例1.1980円に消費税だから、まあ、2100円くらいかな。
例2.A結局、どうなったんですか?
Bまあ、いろいろありまして。
例3.…で最終的にはこうなるわけです。まあ、これが結論ですね。
例4. (Bは太郎のことをよく知らない場合)
A太郎って何してるの?
Bまあ、元気でやってるよ。
例5.Aフレミングの左手の法則は何と何と何?
B運動と磁力と電気/??まあ、運動と磁力と電気。
例1表示对计算结果的不确定, 例2、3表示对事实情况的不确定, 例4表示对对方的身体情况不确定。而例5中「まあ」是否该存在呢?通过会话可知, 此处可以看作是对具体概念的问答, 对话中A是希望B给予准确的答复, 显然这里添加「まあ」是不恰当的。另外, 从「まあ」出现的位置来看, 既可以放在句中 (例1、3) , 又可以放在句首 (例2、4) 。那么可不可以出现句末呢?看下面例子:
例6.昨日はサッカー観戦に行ってきました。まあ。…
上述例子中, 「まあ」单独成句位于句中, 具有衔接上下文的作用。我们可以将后面省略的部分理解为说话方可能由于某些原因不便讲出, 或者内容较多, 等等, 因此这里使用「まあ」可以婉转地向对方传达这种意思, 希望对方能够理解, 使得话轮顺利完成。假如此处去掉「まあ」, 说话方可能会被继问下去, 如果去掉省略号, 此处将不是一个完整的话轮。
另外, 关于「まあ」在句中的位置不同, 所表达的含义也有区别:
例7.A締切過ぎてるんだけど。
B1まあ、明日までには完成させますよ。
B2明日までには、まあ、完成させますよ。
「締切」指的是某个确切的期限, 文中B1、B2都出现了「まあ」说明两句都含有不确定的语感。但到底是对哪一个对象不确定呢?B1句中「まあ」出现在句首, 显然是对于“明日までには完成させます”这一结果的不确定, 而B2中对于“明日までには”是十分确定的, 但对于这个过程是否能在明天完成表示不确定。因此, 根据「まあ」出现的位置不同, 一方面可以对某个具体结果表示不确定, 另一方面也可以对某些过程进行不确定。
2.加藤 (1999) 在赞同川上观点的同时, 并不认为所有带「まあ」的句子都含有不确定之感, 同时指出「まあ」可以表现说话者的对话语的迅速反应。
例8. (けんかをしている二人の間に割って入って)
まあ、まあ、まあ、落ち着いて。
例9.まあ、実際には、まあ、具体的な検討は、まあ、何もしていなくて…。
例10.A仕事、手伝ってくれる?
Bま、いいよ。
上述例8、9句中「まあ」均出现多次, 但是所表达的含义却有不同, 例8句中「まあ」连续使用, 使句子产生了缓和语气。而例9中除了包含不确定的语感之外, 还可以表现出说话者的对话语的迅速反应, 例10加入「ま」后的句子语感发生了某些变化, 尽管B答应A的请求, 但从心里上还是表现出一种“勉强”之感。
从上述分析可知, 「まあ」从性质上来说主要有以下几个特点:
(1) 使用条件既可以用在确定的场合、又可以用在非确定的场合, 当处于非确定场合时, 语义表达多样化呈现多样化。
(2) 从出现位置来讲, 既可以在句中, 也可以在句首, 但不会出现在句末。
(3) 根据在句中位置的不同, 其表达含义也有区别。
三、关于「まあ」的功能
由上文可知, 川上和加藤主要从性质方面对「まあ」加以进行论述, 那么在功能方面有又怎样的特点呢?
例11. (仕事を手伝ってもらうとする場面)
Aこれ、やってくれる?
Bま、いいけど。
话轮的顺利完成, 在很大程度上依靠话语双方的相互理解, 既然是相互理解, 就必然要经过会话双方将对方的语言信息加以处理的过程。例11中「ま」的出现直接影响着B的语义表达, 经过信息处理后, B虽然带有不情愿之意, 但是可能由于某种原因, 还是会帮助A完成工作, 同时我们可以推测A在听到上述B的回答之后, 也会明白B的想法, 即B的反馈可能会给A带来影响。同样例10也含有这种语气, 不过例10中不情愿的语气较例11相比小了很多。再看下面几个例子。
例12.ま、今日は帰ります。
例13.まあ、やってみたら?
例14. (乗り損ねたバスを見送りながら) ま、いいか。
例12、13表达的含义相似, 都是说话者对于事件本身的不确定性, 通过这种信息处理听话人对于说话人的观点或意见表示理解, 促进话语的顺利进行。但并非所有出现「まあ」的句子都要经过这种信息处理过程, 如例14, 表现了说话者自言自语的场合, 尽管错过了一班车, 但是说话者并没有表现出心情不好, 而是略感无奈, 这也可以看作是说话方的一种自我安慰, 因此例14属于「まあ」的一种特殊的使用方法, 即在“自言自语”的场合。
通过上述论述, 关于「まあ」的功能主要有以下两点:
(1) 「まあ」既能反映出说话者内心的信息处理过程, 又能影响听话方对话语的反馈。
(2) 并非所有出现「まあ」的句子都具备上述功能, 比如“自言自语”句可以排除在外。
四、结语
关于谈话标识「まあ」在日语言语活动中屡见不鲜, 无人不用。它是语言的一部分。虽然对于它的研究并不常见, 但是「まあ」在话语中所表现的作用和功能是显而易见的。它把人们的情态贴切地表达出来, 它用非语言的语音直接表达了说话人的情感, 同时也让听话人给予正确的反馈, 促进了谈话的顺利进行。
以上仅从性质和功能两个角度对「まあ」进行探讨, 当然还可以在其他方面, 比如在形式上、功能上、语调上等。
参考文献
[1]冉永平.话语标记语的语用学研究综述.外语研究, 2000, (4) :8-14.
[2]何自然, 冉永平.话语联系语的语用制约性.外语教学与研究, 1999, (3) :1-8.
[3]川上恭子.談話における『まあ』の用法と機能 (1) 応答型用法の分類.『園田国文』, 14, 1993.
[4]川上恭子.談話における『まあ』の用法と機能 (2) 応答型用法の分類.『園田国文』, 15, 1994.
[5]加藤丰二.談話標識『まあ』についての一つ考察.『日本語学.日本語教育論集』, 6, 1999.