微生物检查（精选十篇）
微生物检查 篇1
1 仪器与材料
1.1 仪器
生化培养箱, 上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 样品
圣元胶囊 (兰州奇正生态健康品有限公司, 批号20140210) 。
1.3 试验菌株
大肠埃希菌 (Escherichia coli) [CMCC (B) 44102]、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CM-CC (B) 26 003]、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CM-CC (B) 63 501]、白色念珠菌 (Candida albicans) [CM-CC (F) 98 001]、黑曲霉 (Aspergillus niger) [CMCC (F) 98 003]。均由中国食品药品检定研究院提供。
1.4 培养基
p H7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液, 批号:140127;平板计数琼脂培养基, 批号:20131011;孟加拉红培养基, 批号:20120930;胆盐乳糖培养基, 批号:20130626;营养肉汤, 批号:20130517等。
2 方法
按照《中国药典》2010年版一部微生物限度检查方法验证实验。
2.1 菌液制备[3]:10倍稀释法
取经30~35℃培养18~24h的枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的肉汤培养物1m L, 取经28℃培养24~48h的白色念珠菌的液体培养物1m L, 分别用0.9%无菌氯化钠溶液10倍逐级地稀释至10-5~10-7, 菌数约为50~100cfu/m L, 做菌液组计数, 备用。
取经28℃培养7天的黑曲霉斜面培养物, 加3~5m L 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子, 吸取霉菌孢子液1m L加9ml 0.9%无菌氯化钠溶液, 10倍逐级地稀释为10-4, 菌数约为50~100cfu/m L, 备用。
2.2 样品处理
取供试品10g, 加p H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m L, 混匀, 制成1∶10的供试液。
3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
取供试液置平皿中, 分别接种上述5种代表试验菌株, 再加15~20 m L规定的琼脂培养基, 待凝固后, 置规定温度培养48~72h, 观察结果, 平板计数, 测定回收率。
3.1 平皿法
供试液1m L/皿
3.2 培养基稀释法
0.5m L/皿, 0.2m L/皿
3.3 回收率测定
试验组:取1∶10的供试液1m L置平皿中, 分别接种50~100cfu/m L试验菌株, 立即倾注15~20 m L规定的琼脂培养基, 待凝固后, 置规定温度培养48~72h, 观察结果。菌液组:测定所加的试验菌数。供试液对照组:测定样品本底菌数。稀释剂对照组:方法同试验组。
3.4 结果
《中国药典》2010年版规定在3次平行独立试验中, 稀释剂对照组的菌回收率不低于70%;试验组的菌回收率均不低于70%则可按该样品供试液制备方法和计数方法进行细菌、霉菌及酵母菌数的测定。见表1~表4。
以上结果表明:当采用稀释法 (0.2m L/皿) 测定时其抑菌作用减弱, 回收率均可达70%以上, 稀释剂组菌的回收率为100%。
4 控制菌的验证 (见表5)
从表5结果看出, 该样品控制菌经验证试验, 大肠埃希菌可采用常规法进行检查。
5 讨论
根据以上微生物限度验证3次独立平行试验结果, 圣元胶囊菌落总数测定可采用培养基稀释法 (0.2m L/皿) ;霉菌及酵母菌数的测定采用培养基稀释法 (0.5m L/皿) ;控制菌按常规法检验。
通过方法学验证试验, 用5种验证用菌株对计数方法进行筛选, 能有效地消除样品中的抑菌成分的影响, 以确保检测结果准确、可靠, 从而保证公众用药安全。
摘要：建立保健品圣元胶囊的微生物限度检查方法。按照《中国药典》2010年版一部附录提供的微生物限度检查法的要求进行验证试验。采用稀释法 (0.2ml/皿) 检验时, 五种验证用菌株的菌数回收率均高于70%;控制菌采用常规法进行检查。保健食品采用GB 4789食品卫生微生物学检查法进行检查时, 其检验结果可能不够科学, 建议参照2010年版《中国药典》要求, 通过方法学验证试验建立合理的检验方法。
关键词：圣元胶囊,微生物限度检查,方法学验证
参考文献
[1]刘俊, 杨本寿, 等.蝙蝠蛾拟青霉的抑菌活性与菌丝体发酵化学组分的研究[J].《昆明医学院学报》.2012年, 第6期:32
[2]中国人民共和国药典 (一部) [S].北京:中国医药科技出版社, 2010, 79-86.
课程大纲-微生物限度检查 篇2
学分：8学分
学时：144学时
适用专业：应用生物技术、生物化工等
一、课程性质和任务
1、课程性质：本课程是应用生物技术专业的必修课程。
2、课程任务：通过本课程的学习，使学员具备药品生物制品、食品和化妆品等相关企业产品日常卫生微生物限度检查的基本知识和技能，为产品常规卫生微生物检验把好质量关。
二、课程基本要求
1、了解生物制品、药品、食品和化妆品等各种产品卫生标准；
2、熟悉各种检品微生物限度检查项目；
3、能独立完成各种检品处理和梯度稀释，并按标准规定项目进行常规微生物限度检查；
4、能按菌数报告规则、控制菌形态特征等判定限度检查结果，并及时正确填写检验记录和报告。
5、能以积极心态养成安全、文明、无菌洁净操作习惯，树立强烈的责任心和质量无差错意识,保证检验结果真实可信。
三、教学条件
1、师资：具有药品、生物制品、食品和化妆品等卫生微生物检验工作经验的教师2人；
2、场地：项目一体化教学所需基本的实训室和设备如下：
六、教学说明
微生物限度检查属于微生物检定工中级工段的课程，适用于相关专业全体制和培训教学，教学采取一体化项目教学，教学过程学生2人一组互相配合；10个教学项目有三个层次，项目1-6注重不同的检测内容的能力培养，项目7-9注重产品卫生微生物检验多种内容的同步操作，项目10注重检验全过程系统化，同时将相关微生物的知识、不同检品的取样和样品处理、常见设备的使用分解到各个项目之中，与项目有机结合，实现了知识目标和能力目标的系统化。
考核方式：职业素质占20%，课程结束由学生、实训室管理人员和教师分别评分汇总；专业能力和创新能力占80%，分项目考核，项目1-9主要由教师对过程、结果和记录完成情况进行考核，前面注重过程，后边注重结果；项目10小组自选，完成结果全班交流，学生现场互评和教师评分结合。
七、教材和参考书
自编讲义《微生物限度检查》
参考书：《中华人民共和国药典》2010年版（现行版本）
微生物检查 篇3
【关键词】 微生物检查；方法验证；影响因素
所谓的药品是能够对人类疾病起到预防、诊断以及治疗功能的物质，其能够对人类的生理功能进行调节，以使人类恢复正常的生理机能，但是药品都具有一定的适应症和相关功能以及用料、用法。药品具有对人类各种疾病的治疗效能，是患者解除病痛和康复的重要保证，因此药品的安全性一直是社会关注的焦点，而作为药品检查中的重要项目微生物检查自然占有不可忽视的地位。微生物对药品造成的污染，主要是指微生物体以及微生物的代谢产物便可能会对患者的机体带来感染、过敏甚至中毒等病症，给患者生命带来威胁。微生物检查是保证药品质量的重要指标，现对微生物检查方法验证以及影响因素分析的内容概括如下：
1 微生物检查方法验证的难题
1.1 微生物的不稳定状态 微生物一种只有在适宜环境条件下才进行生长繁殖等生命活动，而当环境不适宜则会进行一定程度的休眠，因此，不同环境和时间下的检测极可能会显示不同的检查结果[1]。尤其对一些混于抑菌药品中的微生物，仅在一定程度上受到抑菌药品的抑制而未被杀死，当随药品进入人体后，条件若适宜就可重新生长繁殖，从未对患者造成一定的危害。而有些抑菌药物还会对待检测菌种的检查带来一定的影响，使实验条件下漏检的实例发生，最终进入患者体内，危害患者的生命健康。
1.2 微生物的不确定性 微生物对药品的污染是一种不确定事件，造成污染的程序多种多样，包括制药环境、设备、运输、包装等多个环节，无法预测药品的污染路径和来源，同时由于药品的数量基数大，而多采取抽样式检查，对于微生物污染这个随机变量而言增加了检测难度。
1.3 微生物的不均匀性 微生物作为一种具有簇团性的生物，其所形成的簇团的大小以及紧密程度都是具有较大差异和可遗传性的特征，从而使得对其检查的手段的有效性具有一定的差异性，进而导致不均匀性。
1.4 微生物检查复杂性 微生物检查的方法验证具有较长的时间周期，繁冗的检测程序，大量的干扰因素，使得其检查负责度大幅增加。
2 微生物检查方法验证的方法
2.1 各种菌种计数验证 计数验证是方法微生物检查方法验证的准确性考察的重要指标[2]。要求在验证时，按照各种菌种的标准制备方法以及供试品的制备过程，在检验试验中加入一定数量代表性的阳性菌，并统计检测过程的该菌回收率。这是一个需要对每一种菌种分别进行的定量性试验，一旦出现菌种回收率不符合要求，便预示方法具有一定的不恰当性，需在实验基础上进行改进，并重新验证，直到阳性菌回收率均符合要求。
2.2 控制菌检查方法验证 依据不同的控制菌检查项目确定相应验证菌，例如大肠菌检验的验证菌可选用大肠埃希菌，而对于梭菌的检查则可选用生孢梭菌作为验证菌。验证过程中为保證方法的特异性需设立阴性菌对照组，要求其检查中不得出现阴性对照菌。
3 微生物检查验证方法的影响因素及解决方案
3.1 药品本身的特性 很多药品本身具有一定抑菌以及杀菌作用，对于该类药品的微生物检查结果是否具有参考价值，决定于其检查条件下该药品是否发挥了抑菌作用[3]。因此检查过程中，必须采取一定的措施以排除药品自身的抑菌效果造成的结果准确性影响。具体的实施方案一般都是按照不同的稀释浓度进行微生物的检查，最终在最低稀释浓度下对微生物进行回收菌测定，在保证结果准确性的前提下，可适当的调整供试品的实验浓度。
3.2 标准菌的保存 微生物检查验证中包含多种菌种，其生存的环境复杂多样，因此为减少试验中的误差，实验中所用的菌种需要是能够具有典型性、稳定性，排除耐药性变异性、菌落变异性以及形态变异性等特征。同时，对于标准菌要根据正规的方法进行保存，且保证应用的菌株传代次数在5代以内。
3.3 培养基的选择 培养基是能够保证检测培养物正常生长的必要基质。因此，培养基的质量很大程度能够影响到菌种生长的状态。多项研究已经证明，避免电炉直火加热、禁止剩余培养基使用是保证培养基中糖类、氨基酸等营养物质不受破坏有效手段。同时，需要严格控制培养基的PH值、温度以及培养皿中培养基的厚度，保证菌落的生长。
3.4 人为因素影响 微生物检查验证过程是一个严格的实验过程，任何的疏忽和人为因素都会对结果造成重大的影响[4]。因此，验证过程中要求实验操作者具有熟练的操作技术，严谨的实验过程。同时，由于细菌本身具有生长密集，体积小的特点给计数工作带来一定的困难，可适当的选用不同倍数的显微镜进行观察计数，保证准确度。
4 小 结
综上所述，微生物验证过程是保证药品质量的重要过程，但由于其本身受到多种因素的影响，给准确度的保证上带来了阻碍。在整个方法验证过程中需要综合多方因素，严格操作过程，提高操作者的熟练程度，规范外部环境因素，以期获得准确的结果，减少误差。
参考文献
[1] 李佳宁.影响微生物限度检查方法验证结果的若干因素分析[J].药事组织，2007，16（9）：35-36.
[2] 向东.影响微生物限度检查及方法验证的因素分析[J].现代医药卫生，2007，23（5）：2329-2340.
[3] 陈健梅.微生物检查方法验证及其影响因素分析[J].药品检验，2008，5（12）：66-68.
全蝎膏微生物限度检查方法的建立 篇4
1 材料
1.1 培养基与试剂
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲基三甲铵琼脂培养基、无菌十四烷酸异丙酯。
1.2 菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26 003]、枯草芽孢杆菌[CMCC (B) 63 501]、大肠埃希氏菌[CMCC (B) 44 102]、铜绿假单胞菌[CMCC (B) 10 104]、白色念珠菌[CMCC (F) 98 001]、黑曲霉菌[CMCC (F) 98 003]。
菌种与培养基均由中国食品药品检定院提供。
1.3 样品
全蝎膏, 黑龙江某医院提供 (批号为20090109、20090820、20091217) 。
2 方法与结果
2.1 菌液制备
取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜斜面培养物接种于营养肉汤培养基中, 在30～35℃培养18～24h;接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至改良马丁培养基中, 在23～28℃培养24h, 分别取上述培养液用0.9%无菌氯化钠溶液10倍依次稀释至浓度约为50～100cfu/mL备用。取黑曲霉菌新鲜斜面培养物, 加含0.05% (mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液[2]适量将孢子洗下, 并用含0.05% (mL/mL) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至浓度约为50～100cfu/mL, 备用。
2.2 供试液的制备
取本品10g, 加至含20mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器内, 置40～45℃保温, 充分振摇使溶解, 加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL, 萃取5～10分钟, 静止, 取水层作为1∶10的供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.3.1 试验组
取1:10供试液1mL, 分别等量加入10个平皿中 (每皿0.1mL) , 加相应细菌试验菌1mL, 立即倾注营养琼脂培养基, 按规定条件培养, 计细菌数。霉菌及酵母菌计数采用常规法, 取1∶10供试液1mL, 加入各霉菌及酵母菌试验菌1mL, 立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基, 置规定条件培养, 计霉菌及酵母菌数。 (n=3) 。
2.3.2 菌液组
吸取上述稀释的阳性菌菌液各1mL至平皿中, 立即倾入相应的培养基, 置规定条件培养, 计各阳性菌的菌落数 (n=3) 。
2.3.3 供试品对照组
测定样品本底的菌数, 方法同试验组, 不加阳性对照菌 (n=3) 。
2.3.4 稀释剂对照组
取试验用稀释剂代替供试液测定, 方法同试验组 (n=3) 。
2.3.5 回收率结果
试验组菌回收率%= (试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数) /菌液组平均菌落数×100%。稀释剂对照组菌回收率%=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%。平均回收率结果, 见表1。
从表1可以看出, 5株试验菌的试验组菌回收率与稀释剂对照组的菌回收率均大于70%, 因此, 可采用该法测定样品的细菌、霉菌及酵母菌数。
2.4 控制菌检查方法的验证[2]
2.4.1 试验组
取2份1∶10的供试液 (每份10mL) , 分别接种至胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基各100mL中, 再加入阳性对照菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌菌液各1mL, 摇匀, 置35～37℃培养18～24h。
2.4.2 阴性对照组
取等量稀释剂, 方法同试验组 (不加阳性对照菌液) 。
2.4.3 验证结果
试验组检出阳性试验菌, 阴性对照组无菌生长, 见表2。
从表2看出, 该控制菌检查方法适用于本品的检查。
3 讨论
3.1 全蝎膏为外用药物, 其控制菌检查以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌两株菌为阳性菌进行阳性对照试验。
3.2 按照《中国药典》2010年版附录微生物限度检查方法要求, 控制菌检查中取消了阴性对照菌 (大肠埃希氏菌) 试验, 取而代之以测定所用稀释剂作为阴性对照组进行试验。
3.3 经方法学试验, 全蝎膏具有一定抑制细菌、霉菌生长的作用, 采用稀释基稀释法 (取十皿, 每皿加样0.1mL) 可有效去除样品中的抑菌作用, 为临床用药提供质量保证。
摘要：目的 建立全蝎膏的微生物限度检查方法。方法 按照《中国药典》2010年版附录的要求进行方法学验证, 细菌计数采用培养基稀释法, 霉菌及酵母菌计数采用平皿法, 控制菌检查采用常规法。结果 细菌、霉菌及酵母菌的菌回收率均大于70%, 控制菌检查中, 各阳性试验菌均检出, 阴性对照无菌生长。结论 该法可消除全蝎膏的抑菌作用, 适用于该制剂的微生物限度检查。
关键词：全蝎膏,微生物限度检查,方法学验证
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典.二部[S].北京:中国医药科技出版社, 2010:107-116.
微生物实验室真菌检查质量控制流程 篇5
一、目的
规范微生物实验室管理程序，确保临床报告的质量。
二、适用范围
微生物实验室的各类真菌检测。
三、职责
实验室检验人员均必须熟知并遵守本程序。
四、程序
(一)临床样本的采集与处理
1.皮屑
边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片。
2.甲屑
用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，作KOH涂片。
3.毛发
取病发（变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5根作直接镜检。
4.脓液
无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作革兰染色，常规的KOH涂片。5.CSF
采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰 箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检。
6.血液
无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，BHIB:血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA（注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。
7.体液、痰液、尿液、粪便
①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养。②晨痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后)，挑取黏液或脓性部分：KOH涂片培养。③早晨中段尿或清洁尿10ml，离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养（SDA每管种0.5ml）。④拭子：一般尽量不用，缺点：A.不能得到足量的标本；B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来;C.容易干竭。采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养。⑤纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片培养（加抗生素）注：单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。
8.组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm的小块，KOH 涂片培养。
(二)涂片染色和直接镜检的质控
1.氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。
2.胶纸粘贴法：用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。
革兰染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择革兰染色方法，染色后，以油镜观察。
3.染液的质量控制
（1）革兰染液每次新配置和使用中每周一次进行质控，并进行记录。（2）氢氧化钾/复方氢氧化钾每周进行一次质控。(三)真菌鉴定质量保证
1.对酵母样真菌如念珠菌或隐球菌在常规临床细菌室已有较成熟的方法学，可用显色培养基。
2.常规鉴定丝状真菌主要依赖于其生长过程中形态变化和特点，所以要求从事丝状真菌检测的检验人员应作专业短期培训；任何实验室都应建立规范的涂片鉴定方法，要正确区分酵母样真菌或丝状真菌、毛霉菌和曲霉（有顶囊），对不常见的真菌不要轻易作为污染菌报告。(四)结果报告
1.药敏岗位检验人员综合真菌鉴定和药敏结果形成检验报告并签名，微生物实验室负责人或指定人按照相关抗菌药物试验标准操作规程核对药敏结果，尤其注意异常和少见结果。
2.告病人结果之前，应确定质控在可接受范围。3.经双人双核后的报告单交报告发放员分发到各病房或门诊病人，注意签收并记录。缺乏审核者得报告结果，应由微生物实验室负责人或指定人在 24 小时内进行评估。
4.血培养阳性涂片为真菌和脑脊液墨汁染色发现隐球菌的初步报告经核实后，按《三级报告程序》报告。5.完成分析后的微生物标本，检验人员应按照《检验后标本保存程序》安全保管标本和平板，要求有明确标识以备复查。3-5 日后，由废弃物处理岗位人员按照《废弃物处理程序》处理。
紫丹活血片微生物检查方法学验证 篇6
关键词：紫丹活血片；微生物限度检查；常规法；薄膜过滤法；稀释法；冲洗量；方法学验证
中图分类号：R927.1文献标识码：A
文章编号：1007-2349(2007)12-0034-02
紫丹活血片具有活血化瘀，理气止痛之功能.临床用于气滞血瘀所致胸痹(冠心病心绞痛)、眩晕(脑动脉硬化)。当建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定及控制菌检查。按《中国药典》2005版的有关要求，通过接种代表性的阳性菌株，发现紫丹活血片具有抑菌活性，采用薄膜过滤法，可以消除紫丹活血片抑菌活性，确定了薄膜过滤法的最佳冲洗量和实验条件，建立了微生物限度检查方法。
1仪器与材料
1.1仪器HTY-Ⅲ型智能集菌仪，(杭州泰林医疗器械厂生产；开放式一次性薄膜过滤器，北京牛牛基因技术有限公司，批号：20051005)。
1.2样品紫丹活血片(云南天利药业有限公司生产，规格0.4g／粒，批号20060301)。
1.3培养基胆盐乳糖增培养基(批号，05222)，玫瑰红钠琼脂培养基(批号，030710)，营养琼脂培养基(批号，050328)，改良马丁琼脂培养基(批号，010315)，营养肉汤培养基(批号，041010)，PH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液(批号，050217)
1.4菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(F)44102]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003](中国药品生物制品检定所提供)。
2方法验证
微生物限度检查的验证实验按中国药典2005版微生物限度检查法(附录ⅪJ)常规法和薄膜过滤法进行。
2.1菌液制备取上述经34℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml，加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7备用；取经24℃培养18～24h的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml.加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5备用；取经培养一周的黑曲霉菌斜面物，加0.9％氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊后，取1ml加入0.9％氯化钠溶液中10倍稀释至10-4备用。
2.2菌液的检验取上述金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌10-5～10-7稀释液各1ml，用45℃营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30～35℃培养48h，计数，应约为50～100cfu／ml；取上述白色念珠菌10-5～10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1ml，用45℃琥红琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，23～28℃培养，逐日观察计数，应约为50～100cfu／ml。结果见表1。
2.3供试液制备取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100ml，混匀，取适量3000转／分离心10min作为1:10的供试液。
2.4回收率的测定
2.4.1细菌数霉菌数常规法测定试验组：取1:10供试液1ml、50～100cfu试验菌同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h逐日观察结果。菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)。供试品对照组：取1:10供试液1ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h逐日观察结果，测定供试品本底菌数。
2.4.2细菌数薄膜过滤法测定取1:10的供试液1ml，注入开放式滤器(先用少量缓冲液润湿滤器)，用pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100ml共4次(总冲洗400m1).加1ml(50～100cfu)试验菌，抽干后，取出滤膜菌面朝上贴入规定琼脂平板培养基中，置规定温度培养48h，结果见表2。
2.5回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率：回收率＝(试验组一供试品对照组)÷菌液组×100％
2.6控制菌检查方法的验证
2.6.1常规法取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述大肠埃希菌液1ml，置35℃培养24h；取稀释液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基，置35℃培养24h.作为阴性对照；取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中.同时加入上述大肠埃希菌液1ml.置35℃C培养24h；取稀释液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24h，作为阴性对照；取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。
2.6.2稀释法取1:10供试液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述大肠埃希菌液1ml，置35℃培养24h；取稀释液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基，置35℃培养24h，作为阴性对照；取1:10供试液10ml加入200ml胆盐乳糖培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌液1ml，置35℃培养24h，作为阴性菌对照组。
3结果
从表2结果可以看出：该供试品接种5株阳性试验菌株，常规法对枯草杆菌、白色念珠菌回收率均低于70％，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌回收率均高于70％；薄膜过滤法对枯草杆菌、白色念珠菌回收率均高于70％。说明该样品具有抑菌活性，细菌数、霉菌数、酵母菌均需采用薄膜过滤法进行测定。见表3。
4结论
夜宁胶囊微生物限度检查方法验证 篇7
1仪器与材料
1.1 试验材料
大肠埃希菌 (Escherichia coli) [CMCC (B) 44 102], 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC (B) 26 003], 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63 501], 白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC (B) 98 001], 黑曲霉 (Aspergillus niger) [CMCC (B) 98 003] 所用菌株传代次数均未超过4代。夜宁胶囊样品 (江苏康缘药业股份有限公司提供, 批号050712、050715、050721) 。
1.2 试验方法
菌液配制 按中国药典2005年版一部 (附录XⅢ C) 分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中, 培养20 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良琼脂培养基中, 培养36 h。上述培养物用0.9%微生物限度氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为50～100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良琼脂斜面培养基中, 培养, 洗脱, 用0.9%微生物限度氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为50～100 cfu的孢子悬液。
2菌落计数方法的验证
2.1 平皿法: (常规法)
2.1.1 试验组
取1:10供试液1 ml, 分别加入10个平皿中, 再依次加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种菌的菌悬液1 ml (含50～100cfu) , 每株菌平行制备2个平皿, 立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基, 分别置30～35℃培养48 h和23～28℃培养72 h。
2.1.2 菌液组
分别取上述稀释的菌液1 ml注入平皿内, 每个菌平行制备2个平皿, 测定所加的试验菌数。
2.1.3 供试品对照组
取1:10供试液1 ml分别注入4个平皿中, 立刻注入营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基, 每种培养基制备2个平皿, 分别置30～35℃培养48 h和23～28℃培养72 h。以测定供试品的本底菌数。
注:由表1可见夜宁胶囊用平皿菌落计数法, 三次平行试验中白色念珠菌的黑曲霉的菌落回收都达到了70%, 说明该方法用于霉菌和酵母菌计数结果是准确的。而大肠埃希菌三次试验菌落回收虽然达到了70%, 但金黄色葡萄球菌和枯草芽孢菌回收均低于70%, 必须重新建立细菌计数的方法。
2.1.4 稀释剂对照组
因为本品未用特殊方法处理和制备, 故不需设该组
上述方法平行实验3次, 实验结果如下:
2.2 培养基稀释法:
2.2.1 试验组
取1:10供试液1 ml, 分别加入2个平皿中 (每皿0.5 ml) 将含50～100cfu的金黄色葡萄球菌悬液1 ml、分别注入上述平皿中, 每法平行制备2组数据。同法制备枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌, 立刻倾注15～20 ml营养琼脂培养基置30～35℃培养48 h。
2.2.2 菌液组
分别取上述稀释的菌液1 ml注入平皿内, 每个菌平行制备2个平皿, 测定所加的试验菌数。
2.2.3 供试品对照组:
取1:10供试液1 ml分别注入2个平皿中 (每皿0.5 ml) , 每法平行制备2组数据, 立刻倾注15～20 ml营养琼脂培养基置30～35℃培养48 h。
上述方法平行实验3次, 实验结果如下。
注:由表2可见, 用培养基稀释法每皿0.5 ml对夜宁胶囊进行细菌回收率的测定, 其金黄色葡萄球菌和枯草芽孢菌的三次回收率试验均高于70%, 说明用每皿0.5 ml的培养基稀释法对夜宁胶囊细菌数进行检测可以消除夜宁胶囊对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用。
3控制菌 (大肠埃希菌) 检查方法的验证[2]
3.1 试验组
取1:10的供试液10 ml, 分别接种至100 ml和200 ml的胆盐乳糖增菌培养基内, 加入57cfu大肠埃希菌, 35～37℃培养基18～24 h, 均可见培养基混浊, 有气体产生。分别取上述培养液0.2 ml接种至5 ml MUG培养基的试管内, 培养5 h、24 h, 在366nm紫外线下观察, 均可见荧光反应, 滴加靛基质试液, 液面均呈玫瑰红色。
3.2 阴性菌对照组
取1:10的供试液10 ml, 分别接种至100 ml和200 ml的胆盐乳糖增菌培养基内, 加入52cfu、金黄色葡萄球菌, 35～37℃培养基18～24 h, 均未见培养基混浊, 无气体产生。分别取上述培养液0.2 ml接种至5 mlMUG培养基的试管内, 培养5 h、24 h, 在366 nm紫外线下观察, 均无荧光反应, 滴加靛基质试液, 液面均呈试剂本色。
结论:上述方法试验组均检出了大肠埃希菌, 阴性菌对照组均未检出金黄色葡萄球菌。说明用100 ml胆盐乳糖增菌培养基可以用于夜宁胶囊大肠埃希菌的检查。
4讨论
夜宁胶囊, 规格:0.5 g/粒。按《中国药典》2005年版一部附录 (XⅢ C) 微生物限度检查方法验证试验[1]:取样10 g, 加pH值7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 ml, 45℃保温振荡, 作为1:10供试液。细菌数测定:用培养基稀释法每皿0.5 ml (即取供试液1 ml分别注入2个平皿中) ;霉菌及酵母菌数测定:用常规平皿法;大肠埃希菌检查:取1:10供试液10 ml加入100 ml胆盐乳糖增菌培养基进行增菌培养, 依法进行检查。
摘要：目的建立合适的夜宁胶囊的微生物限度检查方法。方法采用中国药典2005年版一部规定的常规法、培养基稀释法进行菌回收率比较试验。结果夜宁胶囊在常规法检测金黄色葡萄球菌回收率均低于70%;采用培养基稀释法, 金黄色葡萄球菌回收率均>70%;符合验证要求。结论夜宁胶囊微生物限度检查应采用培养基稀释法检测才能得到满意的结果。
关键词：复方五任醇软胶囊,微生物限度检查法,方法验证
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版, 一部.化学工业出版社, 2005:附录70-79.
微生物检查 篇8
1 药品对实验菌种抑菌作用比较研究
林丽英等[2]通过对野牡丹止痢片微生物限度检查法的验证, 由各菌株的菌回收率试验可知野牡丹止痢片对革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用较强, 而对革兰氏阴性菌的大肠埃希菌和霉菌、酵母菌均无抑菌作用, 推测出野牡丹止痢片的抗菌谱为革兰氏阳性菌。同时为该品种的临床用药研究提供了有用的参考价值。
宋勤等[3]对8种中成药进行活菌回收率验证试验, 发现8种中成药中双黄连口服液、复方丹参片、牛黄解毒片、黄连上清丸对三株细菌的抑菌作用较强;对二株真菌几乎无抑菌作用。其中以枯草芽孢杆菌对抗菌药物最敏感, 金黄色葡萄球菌次之, 大肠杆菌最不敏感, 白色念珠菌与黑曲霉对抗菌药物的敏感性不一致。
马越等[4]采用药典收载的菌回收率试验验证方法, 建立16种中成药的微生物限度检查方法。研究发现16种中成药对大肠埃希菌作用较弱, 而对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用较强, 说明中成药虽不像抗生素有明显的抗菌谱, 但依然存在对不同菌种其抑菌作用不同的特点。因此, 2005年版药典将包括革兰氏阳性、革兰氏阴性菌和念珠菌及霉菌的代表菌种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉作为回收率验证方法的阳性对照菌具有重要意义。
余俊等[5]通过对3种中成药微生物限度检查方法的验证, 发现此3种中成药均具有抑菌作用, 这主要与药品中含有黄芩苷成分有关, 黄芩苷对痢疾杆菌、白喉杆菌、铜绿假单胞菌和耐药的金黄色葡萄球菌等有不同程度的抗菌作用。
湛文青等[6]通过11个品种对各试验菌株的回收率实验可知, 具有抑菌作用的中成药品种, 多数是对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制较强, 对白色念珠菌和黑曲霉几乎无抑菌作用。说明大部分中成药的抑菌谱是以革兰阳性菌为主的。这一结果可为各种中成药品种微生物限度检查法的建立研究提供有效的参考价值。
2 消除药品抑菌作用的方法比较研究
林丽英等[2]通过对野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立和方法学验证, 采用离心沉淀法加培养基稀释法可使最敏感的细菌的回收率达到要求, 使药物所污染的各种类型的细菌均顺利检出。从野牡丹止痢片微生物限度检查法建立研究来看, 对抑菌作用较强的中成药, 用培养基稀释法简便有效。但是, 当供试品的抑菌作用很强时, 应考虑采用沉降法、离心沉淀法或薄膜过滤法等方法来消除其抑菌作用。吴晓敏等[7]对8种医院制剂微生物限度检查方法验证, 发现医院制剂中有一些品种由于酸碱度的影响, 用稀释剂无法调节至适宜的PH值, 造成试验环境不适宜细菌的生长, 从而影响微生物限度检查的结果, 应采用薄膜过滤法进行微生物限度检查。
宋勤等[3]采用平皿菌落计数法、培养基稀释法及贴膜法三种方法对8种中成药进行活菌回收率验证试验, 结果发现对于含抑菌成分的药品微生物限度检查, 贴膜法是一种检出率高、结果可靠的方法。贴膜法供试液经减压抽滤后, 经稀释液反复冲洗, 将其抑菌成分充分冲洗掉, 滤膜直接贴于规定的培养基上培养, 所以回收率均高于其它两法。薄膜过滤时须将供试液加入置有冲洗液的滤罐中混匀后再进行减压抽滤, 而且每次必须抽干后再进行第二次冲洗, 否则影响抑菌成分彻底冲洗净。滤膜取出后应正面 (接触样品面) 向上贴在培养基上培养, 正面向上菌落大、清晰, 尤其菌数多时可自然向膜周围的培养基上扩散, 易计菌数;如反面向上, 菌落小且易堆积在膜的周围不易计数。
3 样品处理方法的比较研究
陆蓓等[8]对4种栓剂进行了微生物限度检查法的验证, 样品的制备分别采用文献[9]方法和药典方法[10]进行比较, 即取样品2份, 各5 g, 1份加4 ml吐温-80作为乳化剂, 45℃保温约10 min至样品融化, 再加入45℃p H7.0氯化钠蛋白胨缓冲液96 ml, 为方法1;另1份按药典方法中非水溶性供试品处理方法:取10 g吐温-80, 5 g司盘-80, 3 g单硬酯酸甘油酯, 置三角烧瓶中, 115℃灭菌30 min, 备用, 融化至45℃时立即加入5 g样品, 保温摇匀, 分次加入预热45℃的稀释剂85 ml, 为方法2。结果发现, 用方法1对甲硝唑栓、双氯芬酸钠栓、苦参栓3种栓剂微生物限度检查的方法学验证均取得较好效果, 菌回收率均达到70%以上, 且方法1比方法2操作简便, 节约成本且乳化效果好, 菌落清晰易计数。
严素芬[11]通过对金利油软胶囊微生物限度检查法的验证, 发现其含油性成份, 加入适量的聚山梨酯80, 有利其分散均匀, 为促进囊壳溶解, 应在45℃水浴中振摇, 加速内容物的溶出, 此方法处理后进行微生物限度验证取得较好结果, 菌回收率均达到70%以上。阚秀燕等[12]采用了离心加不同浓度的培养基稀释法, 解决了药品中抑菌物质的干扰问题, 该法操作简单, 能真实有效地反映药品中污染存活的细菌数, 检出率高, 但离心时要按规定的转速和时间操作, 不可任意改变条件, 否则影响试验结果。韦红等[13]在对黄连上清丸微生物限度检查方法验证试验中, 按照中国药典 (2005年版) 微生物限度检查法中常规法检验, 首先将样品进行了细菌、霉菌数测定, 结果细菌数为4 000 cfu/g, 给方法学验证带来不便, 故对制备好的供试液进行了高压蒸汽灭菌后进行计数方法的验证, 结果5种试验菌的回收率均高于70%, 此法菌落计数清晰易数。
陈晓平等[14]对微生物限度检查计数方法验证进行了解析, 提出验证试验中应注意的问题:离心沉淀集菌法和中和法实际上只是供试品的处理方法, 处理后的供试液可选择平皿法、培养基稀释法、薄膜过滤法计数;供试品需要分离、乳化、离心沉淀、中和等特殊处理的, 均应考察稀释剂对照组的回收率, 有时单用一种方法不能消除供试品的抑菌性, 可多法联用。按照2005年版《中国药典》的要求, 所有药品的微生物限度检查都要进行验证, 许多药品都不能达到要求, 如对于一些抗生素及其制剂, 即使多种方法联合使用, 其回收率仍较低, 对此需要进一步摸索、探讨。
4 影响微生物限度检查结果的因素解析
詹云丽[1]指出微生物限度检查出现误差的几个原因:细菌因环境因素影响或基因改变发生变异可使平板中细菌呈丛集或分散不均;药品中含有的抑菌或杀菌性成分干扰检验;无菌室关键操作点或净化工作台的净化级别达不到100级, 紫外线灯吊挂高度及瓦数不统一;无菌观念淡薄、无菌操作不规范;培养基灵敏度下降;供试液取样不均匀;细菌生长小而密集极易发生计数误差;菌落蔓延生长成片或发生重叠影响计数;抽样误差。因此, 为了减少实验误差, 微生物限度检查必须遵循以下原则: (1) 样品正式检验前必须保持原始包装状态。防止第二次污染和防止已污染微生物的繁殖或死亡。 (2) 应有适当供试液制备方法。 (3) 检验方法准确可靠。 (4) 检验结果判断无误。
肖莉[15]通过对4种固体制剂分别用研磨法和振荡法制成细匀程度不同的供试液, 做细菌数测定。结果发现, 供试液的细匀程度对检验结果有着显著影响:在研磨法中, 未细匀和部分细匀时细菌数符合药典规定, 而完全细匀时细菌数超过药典规定, 成为不合格产品;在振荡法中, 在一定时间内, 随振荡时间增加, 供试液的细匀程度增加, 样本中污染的微生物充分地被释放游离出来, 细菌数测定结果也递增。因此, 认为正确制备供试液, 使药品中的微生物得以真实反映, 是保证检验结果正确可靠的重要条件, 并提出两种经验 (一是供试品先浸泡再研磨;二是在灭菌双层帆布袋中先将供试品打碎后再称量研磨或振荡) 供参考。
李佳宁[16]分析了微生物限度检查方法验证过程中易影响结果的几个原因:药品的抑菌或杀菌成分;标准菌株的保存方法和技术;操作环境不符合规定;操作误差;培养基灵敏度下降;灭菌方法不当以及菌落计数中的误差。
5 细菌、真菌计数方法的验证应注意的问题
实验者结合自己的实验, 系统总结了验证工作中应注意的各种问题, 值得借鉴。
(1) 试验菌液的制备可通过液体培养物直接稀释或固体培养物比浊获得, 但不管是采用何种方法均应进行菌数测定, 并与试验组菌数测定同时进行, 精确测定菌数是回收率测定最为关键的步骤。 (2) 制备的菌液不宜放置太长时间, 否则会因菌体的生理状态变化而影响回收率。 (3) 回收率是依据所测的菌数而来的, 试验要求加菌50~100 cfu, 为减少操作误差, 一般应取1 ml含菌50~100 cfu的菌液进行试验。 (4) 试验时, 一般应选择最低稀释级的供试液。若最低稀释级的供试液采用各种方法消除样品的抑菌作用还无法达到回收率的要求, 那么可根据样品的限度要求, 确定该样品能达到回收要求的最低稀释级的供试液, 并在此稀释级下测定的结果能判断供试品的杂菌数是否符合药品微生物限度标准的规定, 当进行该样品的杂菌数检查时, 以此作为测定的第一个稀释级[17]。 (5) 从样品接触稀释剂开始至注皿应在1 h内完成, 对多批样品应分段接种注皿。 (6) 稀释方法:吸液在离液面2.5 cm处, 放液离第二管液面不高于1 cm, 管内混合吹打不少于10次, 瓶内振荡混合不少于15 s。 (7) 注皿量:培养基15 ml厚度40 mm, 培养基薄, 水分易散失, 不利于细菌生长;培养基厚, 不利于需氧菌生长。 (8) 当菌落细小不宜辨别时, 应适当延长培养时间。 (9) 培养基的质量必须保证, 否则影响检测结果的准确性[18]。 (10) 3次平行试验应取不同批号的3批样品。
感冒软胶囊微生物限度检查方法验证 篇9
1 材料
1.1 样品
感冒软胶囊 (生产厂家:神威药业有限公司),批号10092711、10092712、10092811,规格:每粒装0.425g(相当于总药材1.8g)。
1.2 仪器设备
脉动真空灭菌柜 ,型号XG1.U (山东新华医疗器械股份有限公司);生化培养箱,型号LRH-150B(广东省医疗器械厂);电热恒温培养箱,型号GHP-9160(上海一恒科技有限公司);电热鼓风干燥箱,型号101-2A(上海沪南科学仪器联营厂);生物安全柜,型号BHC-1300IIA/B3(苏州安泰空气技术有限公司)。
1.3 培养基及试剂
改良马丁培养基(批号090908)、改良马丁琼脂培养基(批号 090325)、营养琼脂培养基(批号100105)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号 1003082)、营养肉汤培养基(批号080925)、曙红亚甲蓝琼脂培养基(批号 1003082)、胆盐乳糖培养基(批号0811032)、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(批号091120 )、聚山梨酯80、司盘80、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等。
1.4 验证用菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003];大肠埃希菌[CMCC(B)44 102];枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501];黑曲霉菌[CMCC(F)98 003];白色念珠菌[CMCC (F) 98 001]均购自中国药品生物制品检定所。
2 菌液制备方法
分别取经33℃培养24h的金黄色葡萄球、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌营养肉汤液体培养物1mL,加入至9mL 0.9%无菌NaCl溶液中,10倍稀释至10-5约为50～100cfu/mL的菌悬液,备用。取经25℃培养48h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1mL,加入至9mL 0.9%无菌NaCl溶液中,10倍稀释至10-6约为50～100cfu/mL的菌悬液,备用。取经25℃接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,23～28℃培养5～7 天,加入3～5mL 含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL 含孢子数50～100 cfu 的孢子悬液,备用。
3 供试液制备
取供试品5g,加入含溶化的5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL,边加边搅拌使之溶化,作为1∶20的供试液。
4 回收率实验方法与结果
4.1 验证试验进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率
在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)均应不低于70%。若试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。
4.2 供试品对照组
取1∶20的供试液,每个平皿中加1mL,共加4个平皿,2个加入营养琼脂培养基,2个加入玫瑰红钠琼脂培养基,每个平皿加入培养基约20mL,摇匀,放冷凝固。细菌置33℃培养箱中培养72h,霉菌(酵母菌)置25℃培养120h计数。
4.3 试验组
取1∶20的供试液1mL和上述“菌液制备”中制备好的5种菌液1mL,分别加至平皿中,加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基约20mL,摇匀,放冷凝固。细菌置33℃培养箱中培养72h,霉菌(酵母菌)置25℃培养120h计数。
4.4 菌液组
取与试验组相同的5种菌液1mL,分别加至平皿中,加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基约20mL,摇匀,放冷凝固。细菌置33℃培养箱中培养72h,霉菌(酵母菌)置25℃培养箱培养120h计数。结果见表1、表2、表3。
4.5 稀释剂对照组
取含溶化的5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的无菌混合物,慢慢加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL,边加边搅拌均匀,作为稀释剂。取稀释剂1mL和试验组相同的5种菌液1mL,加至平皿中,加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基约20mL,摇匀,放冷凝固后,细菌置33℃培养箱中培养72h,霉菌(酵母菌)置25℃培养120h计数。结果见表4。
5 讨论
根据上述结果可以看出:①稀释剂对照组回收率试验均大于70%,说明稀释剂对测定无干扰;②采用平皿法检验供试品,人工污染5株代表菌株,该供试品对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%,无明显抑菌作用。感冒软胶囊在进行微生物限度检查细菌数、霉菌和酵母菌数检验时可以采用加入乳化剂乳化制成1∶20的供试液,再用平皿法进行检验计数。
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典2010年版一部附录[S].北京:中国医药科技出版社,2010:79.
微生物检查 篇10
1.1 仪器
DNP-9082电热恒温培养箱和MJX-150霉菌培养箱 (上海申贤仪器设备厂) 、YXQ.SG41.280手提式消毒锅 (上海医用核子仪器有限公司) , 100级洁净工作台。
1.2 试剂
培养基:营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG、培养基pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。上述除供试品外均由北京三药科技开发公司生产, 适应性检查均符合2010年版《中国药典》一部附录要求, 可用于微生物限度检查。供试品平哮合剂 (批号:130527) , 江苏省中医院配制。菌株:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌验证、黑曲霉, 以上由南京市药检所提供, 实验所用的菌株均为第3代。
2 方法和结果
2.1 供试液制备
吸取供试品10ml, 加入p H 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml, 摇匀, 作为1:10供试液。
2.2 菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中, 于30~35℃培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中, 于23~28℃培养24~48小时, 上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至相应浓度制成每1ml含菌数为30~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中, 培养5~7天, 加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱。然后, 吸出孢子悬液至无菌试管内, 用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的孢子悬液。
2.3微生物限度方法验证
2.3.1 试验组
按照2010年版《中国药典》一部附录要求, 取供试液1ml, 分别加入试验菌液1ml, 立即倾注15ml相应培养基, 平行制备2个平皿, 待凝固后置规定温度培养, 细菌培养3d, 霉菌培养5d, 观察结果, 记录菌落数。
2.3.2 菌液组
按照2010年版《中国药典》一部附录要求, 每平皿分别加入试验菌液1ml, 立即倾注琼脂培养基15ml相应培养基, 待凝固后相应温度条件下倒培养, 计数。每株试验菌平行制备2个平皿。
2.3.3 供试品对照组
按照2010年版《中国药典》一部附录要求, 取供试液1ml, 平行制备2个平皿, 立即倾注相应培养基15ml, 凝固后于相应温度条件下培养, 按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
根据下式计算回收率, 结果见表1。
回收率 (%) = (实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数) /菌液组平均菌落数×100%。
每种试验菌进行3次独立的平行试验, 并分别计算各试验菌每次试验的回收。
2.3.4 回收率验证结果
回收率均高于70%。
2.4 控制菌验证方法
1ml大肠埃希菌 (含菌数为10~100cfu) , 加入100ml胆盐乳糖培养基中, 经35~37℃培养24小时。
2.4.1 试验组
取供试液10ml及10-100cfu的大肠埃希菌液加入100ml胆盐乳糖增菌培养基中检查, 35℃-37℃培养18h-24h, 取上述增菌液0.2ml加入5ml MUG试管中, 置35℃-37℃培养5h-24h, 观察荧光, 再加入靛基质试剂观察结果。
2.4.2 供试品组
与试验组同法, 不加阳性菌液
2.4.3 阴性组
取p H 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml, 加入100ml胆盐乳糖培养基中, 后面与供试品组同法操作。
2.4.4 空白组
取100ml胆盐乳糖培养基, 经35~37℃培养24小时后, 后面同前。
2.4.5 控制菌验证结果
3 讨论
制剂对微生物限度检验时抑菌作用的产生, 与制剂中的中药材品种以及该品种的浓度有关, 平哮合剂中黄芩的生药浓度为0.05g/ml, 因为浓度较低, 其抑菌作用未对微生物检验方法产生影响, 可以用常规法检验。
参考文献
[1]赵敏, 谭钢文, 唐小异, 等.十种中药提取物与抗生素合用对铜绿假单胞菌最小抑菌浓度影响的体外实验[J].湖南师范大学学报 (医学报) , 2011, 8 (4) :80-82.