动力蛋白之生物学论文提纲

2022-11-15

论文题目：香猪发情期卵巢转录组的可变剪接研究

摘要：猪是重要的经济动物,除了能为人类提供优质蛋白和皮毛外,因为拥有与人类相似的生理学特征,还是人类医学研究中的理想试验动物。卵巢是雌性哺乳动物重要的繁殖器官。在每一个发情周期,卵巢经历了一系列形态、激素和生理改变,这些改变直接影响和/或决定了雌性动物的产子数。卵巢的功能实现涉及大量基因的转录调控,是非常复杂的生物学过程。可变剪接（Alternative splicing,AS）是调控基因表达的一种重要机制,在高等生物中调节多种生物学过程。中国本土香猪具有许多特异的生物学特性,如香猪达到性成熟的年龄较早,同时发情行为表现没有其它欧洲猪种明显。研究发情过程中可变剪接对香猪卵巢基因表达的影响,进一步揭示发情时期调控香猪卵巢功能的潜在的可变剪接转录本和信号通路,将为我们研究卵巢功能的分子调控机制提供新的线索。我们利用RNA-seq方法对香猪母猪的卵巢组织进行全基因组范围内的转录本和可变剪接事件分析,鉴定了发情期和未发情期的AS事件并比较了AS模式;对卵巢功能相关的昼夜节律和网格蛋白介导的内吞作用（Clathrin-mediated endocytosis,CME）相关基因的表达和可变剪接进行了深入分析,探索香猪卵巢功能调节的分子机制,取得的主要研究结果如下:1、香猪发情期卵巢转录组可变剪接事件的鉴定和功能研究对香猪发情期和未发情期的卵巢组织构建c DNA文库并进行RNA测序。利用ASprofile程序,我们在香猪卵巢中分析了12种基本的AS事件,并从未发情卵巢的15,142个基因中鉴定了68,775个AS事件,从发情卵巢的15,291个基因中鉴定了69,493个AS事件,平均4.54个剪接事件。在卵巢组织中,94.4—95.5%的表达基因经历了可变剪接。AS事件发生频率在发情期卵巢和未发情期卵巢样本中是相似的。AS事件的主要类型是第一外显子可变剪接（Alternative 5′first exon,TSS）,其次是最后一个外显子可变剪接（Alternative 3′last exon,TTS）和外显子跳跃（Skipped exon,SE）。其余的AS事件类型,例如,内含子保留（Intron retention,IR）和可变外显子边界（Alternative exon ends,AE）显示了较低的频率。进一步采用Limma,DESeq2和r MATS软件比较分析基因表达显示,在发情期4433个基因中至少检测到一个剪接异构体差异表达,但仅有2382个在基因水平发生差异表达。包括激素代谢和性腺发育的许多基因都是通过AS差异调节的。利用逆转录RT-PCR鉴定了12个基因的可变剪接事件,这些事件包括12种不同的可变剪接类型。GO和KEGG分析显示许多差异表达基因（Differentially expressed genes,DEG）和差异剪接基因（Differentially spliced genes,DSG）与卵泡发育和卵巢类固醇生物合成有关。大量的没有差异表达的DSGs,富集在昼夜节律和许多信号转导通路中。这些通路可能在基因和/或AS水平调节雌性动物的繁殖功能。说明可变剪接在香猪母猪发情过程的基因表达调控中起重要作用。许多参与性腺发育、激素代谢、昼夜节律的基因通过可变剪接而受到差异调节。2、香猪发情期卵巢昼夜节律相关基因的表达和可变剪接基于转录组测序数据,进一步分析发情期和未发情期香猪卵巢中的昼夜节律相关基因的表达和可变剪接。在90种节律相关基因中,发情卵巢中检测到了81种,而在未发情卵巢中检测到了83种。与未发情卵巢相比,发情卵巢的中表达水平（10-100 CPM）的基因较多,高表达水平（＞100 CPM）和低表达水平（0.1-10CPM）的基因较少。在发情期和未发情期之间差异表达的节律基因有33个。从34个昼夜节律基因的转录本中识别出44个差异的剪接事件,包括3个可变5,端剪接位点（Alternative 5’splice site,A5SS）事件,12个内含子保留（Retened intron,RI）事件,14个跳跃外显子（Skipped exon,SE）事件和15个互斥外显子（Mutually exclusive exons,MXE）事件。包括核心时钟组分芳烃受体核转运样蛋白（Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator like,ARNTL）和隐花色素昼夜节律调节因子1（Cryptochrome circadian regulator 1,CRY1）在内的20个基因仅在AS水平上受到差异调节,包括周期节律调节因子1（Period circadian regulator 1,PER1）和时钟昼夜节律调节因子（Clock circadian regulator,CLOCK）在内的14个基因在表达和AS水平上均受到差异调节。说明发情周期推动卵巢组织中生物钟的时间变化,外周生物钟振荡子在同步局部生理过程中起着至关重要的作用。3、香猪发情期卵巢CME相关基因的表达和可变剪接基于转录组测序数据,分析了香猪发情期卵巢CME相关基因的表达和转录本发生的可变剪接,以未发情期的表达变化为对照。在从江香猪卵巢中检测到8个表达的CME基因,包括DAB受体蛋白2（DAB adaptor protein 2,DAB2）,衔接蛋白复合体2亚基μ1（Adaptor related protein complex 2 subunit mu 1,AP2M1）,网格蛋白轻链B（Clathrin light chain B,CLTB）,网格蛋白轻链A（Clathrin light chain A,CLTA）,动力蛋白1（Dynamin-1,DNM1）,肌球蛋白VI（Myosin VI,MYO6）,动力蛋白2（Dynamin-2,DNM2）和网格蛋白重链（Clathrin heavy chain,CLTC）,其中差异表达的基因有DAB2、AP2M1和CLTB;除了CLTB外,其余7个基因在发情和未发情卵巢之间发生差异的可变剪接,这些可变剪接产生的7个转录本是目前Ensembl数据库暂未收录的新转录本。说明可变剪接是从江香猪发情过程中卵巢重要的调控方式,以CME过程中产生新的转录本的方式组建蛋白相互作用的特异性网络。研究结果表明,网格蛋白介导的内吞作用可能与香猪发情特征不明显,产仔数低相关。发情周期通过转录和转录后水平调控CME相关基因的表达和转录本的剪接,来影响缝隙连接的内在化,从而调节从江香猪的卵巢功能。综上所述,本研究利用RNA-seq技术对发情和未发情的香猪卵巢进行转录组测序,构建了香猪卵巢转录组的可变剪接图谱,确定了香猪发情过程中可变剪接基因的富集通路,从中鉴定了对香猪卵巢功能起重要作用的可变剪接事件和转录本异构体。这些研究内容有助于提高对猪转录后调控过程的认识和理解,对进一步从转录组水平解析猪卵巢功能的分子调节机制具有重要意义。

关键词：香猪;发情期;卵巢;RNA-seq技术;可变剪接;昼夜节律;网格蛋白介导的内吞作用（CME）

学科专业：生物化学与分子生物学

摘要

abstract

第一章前言

1.1 发情周期

1.1.1 发情周期的定义

1.1.2 猪的发情周期

1.1.3 猪发情周期的调控机制

1.2 可变剪接

1.2.1 可变剪接的研究现状

1.2.2 影响可变剪接的调控因素