苗木育种栽培技术论文提纲

论文题目：黑莓‘Arapaho’组织培养快繁技术体系建立及叶片原生质体制备

摘要：黑莓作为第三代新兴小浆果,不仅营养价值丰富而且经济价值高。近年来,中国黑莓产业不断发展,无论栽培面积还是产量都不断增长。伴随着真菌及病毒病等蔓延,以及范围日益扩大,造成了严重的损失。为使黑莓育种效率进一步提高,推动其育种进程,当代许多研究者加速了现代生物技术和基因工程技术的研究。目前,我国黑莓优良苗木的缺乏对黑莓种植业造成了一定程度的限制。基于组织培养具有育苗周期短,苗木整齐性统一,不受自然环境生长季节的限制等特点,本试验对组织培养进行黑莓快速繁殖的技术体系进行了初步研究。尤其是对黑莓外植体消毒、外植体的建立、增殖培养,生根培养、炼苗及移栽等生产环节进行了试验,同时结合育种工作需求,对叶片不定芽诱导及愈伤组织诱导几个环节进行了试验研究,并利用黑莓组培苗叶片进行了原生质体分离、纯化研究。主要试验结果如下:1、建立了黑莓‘Arapaho’基于组织培养快繁技术体系。（1）适宜黑莓‘Arapaho’茎尖及茎段消毒的方法:用70%酒精消毒10 sec,在无菌水中清洗3次,用0.1%的Hg Cl2消毒10 min,然后无菌水中清洗6次。（2）最适增殖培养基:以组织培养30 d左右的壮苗为材料,培养基配方为:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L,增值系数为4.98。（3）最适生根培养基:黑莓‘Arapaho’极易生根。在添加1 g/L的活性炭的1/2MS培养基中,黑莓‘Arapaho’的生根率达到93.33%;当IBA浓度达到5 mg/L时,黑莓‘Arapaho’的生根率可达到100%,而且会有侧根长出。（4）炼苗及移栽:选取生根良好,植株健壮的组培苗为材料,开盖炼苗一周左右进行移栽。移栽基质为泥炭土、珍珠岩与原土比例为6:3:1,成活率达100%。（5）最适叶片不定芽诱导培养基:继代培养30 d左右组培苗茎尖的幼嫩叶片为材料,叶片不定芽诱导培养基使用MS+TDZ 1.5 mg/L+IBA 0.4 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6 g/L时不定芽再生率最高。低浓度TDZ仍然能诱导叶片不定芽再生,但TDZ浓度为0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 mg/L对叶片不定芽的再生率无显著差异。（6）最适愈伤组织诱导的培养基:继代培养30 d左右组培苗茎尖的幼嫩叶片为材料,细胞分裂素TDZ与低浓度生长素NAA组合能够诱导黑莓‘Arapaho’愈伤组织产生,愈伤组织诱导率可达100%。其中NAA 0.1 mg/L,TDZ 1 mg/L时愈伤组织多为疏松型,浅绿色愈伤或黄绿色愈伤,而且生长速度快。（7）在整个过程中,可以使用市售白砂糖为碳源替代物,自来水为蒸馏水替代物,与使用实验室分析纯蔗糖碳源与蒸馏水并无显著差异。2、建立了黑莓叶片原生质体分离纯化体系,获得了产量高,活力高的原生质体。以最优的体系获得的原生质体得率可达8.64×107个/g﹒FW,活力可达94.44%。（1）最佳酶解液组合是:2.5%的纤维素酶（Cellulase R-10）+0.03%的果胶酶（Pectolyase Y-23）+1%的离析酶（Macerozyme R-10）。（2）原生质体分离中在低速（80r/min左右）的恒温摇床上酶解9 h,可以获得较高产量和活力的原生质体。（3）当甘露醇作为渗透压调节剂时,适宜浓度为12%。浓度过高或过低都会影响原生质体产量和活力。（4）在原生质体分离前,将材料暗处理7d,能够提高原生质体产量。

关键词：黑莓;组织培养;原生质体

学科专业：农业硕士（专业学位）

摘要

ABSTRACT

1.文献综述

1.1 黑莓生产的意义

1.2 黑莓的生产及育种现状

1.2.1 世界黑莓生产育种现状

1.2.2 国内黑莓生产育种现状

1.3 黑莓的繁殖方式

1.3.1 压条繁殖

1.3.2 扦插繁殖

1.3.3 根蘖苗

1.3.4 黑莓组织培养

1.3.4.1 基因型

1.3.4.2 基本培养基

1.3.4.3 外植体的生理状态

1.3.4.4 植物生长调节剂

1.3.4.5 暗培养

1.3.4.6 放置方式

1.4 黑莓及其它果树原生质体研究进展

1.4.1 原生质体的制备

1.4.1.1 材料种类

1.4.1.2 材料预处理

1.4.1.3 酶解条件

1.4.1.4 酶解液渗透压

1.4.1.5 膜质稳定剂

1.4.2 原生质体纯化

1.4.2.1 离心纯化法

1.4.2.2 流式细胞纯化法

1.4.3 原生质体活力检测

1.5 本试验的研究目的和意义

2.材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.2.1 黑莓‘Arapaho’组织培养

2.2.1.1 外植体的表面消毒

2.2.1.2 外植体的建立

2.2.1.3 增殖培养

2.2.1.4 生根培养

2.2.1.5 炼苗

2.2.1.6 移栽

2.2.1.7 简化培养方式探索

2.2.1.8 叶片不定芽诱导

2.2.1.9 愈伤组织诱导

2.2.2 原生质体的制备

2.2.2.1 原生质体的分离

2.2.2.2 不同酶种类配比的筛选

2.2.2.3 酶解时间的筛选

2.2.2.4 甘露醇浓度的筛选

2.2.2.5 材料暗处理对原生质体分离的影响

2.2.2.6 原生质体的纯化

2.3 数据统计

2.3.1 外植体的建立

2.3.2 增殖培养

2.3.3 生根培养

2.3.4 移栽成活率

2.3.5 叶片不定芽诱导

2.3.6 愈伤组织诱导

2.3.7 原生质体制备与纯化

3.结果与分析

3.1 组织培养

3.1.1 不同消毒时间对黑莓外植体建立的影响

3.1.2 不同植物生长调节剂组合对增殖培养的影响

3.1.3 不同浓度的生长素对生根培养的影响

3.1.4 炼苗及移栽

3.1.5 简化培养对增殖培养及生根培养的影响

3.1.6 不同植物生长调节剂组合对叶片不定芽诱导的影响

3.1.6.1 TDZ与IBA组合对叶片不定芽诱导的影响

3.1.6.2 低浓度TDZ对叶片不定芽诱导的影响

3.1.7 不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织诱导的影响

3.2 原生质体分离和纯化

3.2.1 不同酶组合对黑莓原生质体分离的影响

3.2.2 不同的酶解时间对原生质体分离的影响

3.2.3 不同的甘露醇浓度对原生质体分离的影响

3.2.4 暗处理对黑莓原生质体分离的影响

4.讨论

4.1 黑莓组织培养

4.1.1 不同消毒时间对黑莓外植体建立的影响

4.1.2 生长调节剂对增殖培养的影响

4.1.3 生长素对生根培养的影响

4.1.4 简化培养

4.1.5 生长调节剂对叶片不定芽诱导的影响

4.1.6 生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响

4.1.7 组织培养中常见问题

4.2 黑莓原生质体分离纯化

4.2.1 不同酶组合对原生质体分离的影响

4.2.2 酶解时间对原生质体分离的影响

4.2.3 甘露醇浓度对原生质体分离的影响

4.2.4 暗处理对黑莓原生质体分离的影响

5.结论

6.需要进一步研究的内容

参考文献

缩略词表

附图

项目资助

致谢

作者简历