病原菌变化的污水处理论文提纲

论文题目：污水处理系统中抗生素和重金属残留对微生物群落和生态功能演化的影响

摘要：近十几年来,抗生素和重金属在环境中的残留及其生态效应和环境健康风险引起人们的高度关注。抗生素生产废水,市政污水处理系统以及畜禽养殖粪肥等环境被认为是抗生素和重金属污染的重要储存库。抗生素污染会导致环境中耐药细菌和耐药基因的产生和扩散,而重金属污染不仅影响抗性的传播,而且能够协同抗生素对耐药微生物产生共选择作用,影响微生物生态组成和功能,然而,目前有关制药废水处理系统中抗生素残留是否会引起其他类型抗生素耐药性的增强、抗生素降解菌群与耐药菌群的演化关系等科学问题不清楚;而对于重金属引起的微生物生态群落和重要生态（例如氮磷循环）功能变化的剂量效应关系等问题也不清楚。因此,本研究针对这些科学问题开展研究,取得如下创新性成果。第一:制药废水和城市污水处理系统中抗生素重金属残留、耐药细菌和耐药基因的分布特征对不同污水处理系统中的14种不同抗生素和7种重金属浓度的检测结果表明,乙酰螺旋霉素和林可霉素发酵废水处理系统中,乙酰螺旋霉素和林可霉素的浓度在处理前后分别为10034±198.8 ng L-1、10112±180.3 ng L-1和0 ng L-1、1626±56.9 ng L-1;废水中主要的重金属为Pb、Cr、Ni、As,在剩余污泥中浓度达到52.314±0.50 mg kg-1、9734.2±89.5mg kg-1、129.84±11.80 mg kg-1、635.79±34.12 mg kg-1;核甘类化学合成废水中林可霉素和环丙沙星浓度在处理前后分别为5950±123.6 ng L-1、203.8±12.6 ng L-1和911.6±34.8 ng L-1、164.3±11.4 ng L-1,其重金属主要也是Pb、Cr、Ni、As,浓度达到179.11±10.23 mg kg-1、1094.2±87.23 mg kg-1、416.64±24.84 mg kg-1、975.79±65.2 mg kg-1;肌苷发酵类废水中林可霉素浓度在处理前后分别为229.6±22.3 ng L-1和844.8±78.6 ng L-1,主要重金属为Cr、As,浓度达到444.2±23.80 mg kg-1和353.79±10.2 mg kg-1;城市污水处理厂的抗生素种类多样,浓度较高的四环素和环丙沙星在处理前后分别为2559.2±123.2 ng L-1、1109.4±67.5 ng L-1和832.5±25.3 ng L-1、223.52±12.4 ng L-1,剩余污泥中重金属主要是As,浓度达到365.06±53.2 mg kg-1。利用培养的方法研究了可培养总细菌和多重耐药细菌在各污水处理系统中的丰度,结果表明,进水和活性污泥中可培养总菌的数量最多,达到10~9-1011cfu/L,剩余污泥中相对较少,达到10~7-10~9cfu/Kg,出水中耐药菌丰度在10~3-10~8cfu/L之间。经过处理之后,可培养多重耐药细菌总数在出水中均比进水低1-3个数量级,各处理系统有效降低了单位体积的耐药菌数量。相比于制药废水处理系统,城市污水处理系统中多重耐药菌相对丰度最高,可培养三重耐药菌占总可培养细菌的3%左右,是制药厂的300倍以上。利用高通量测序技术对不同污水处理系统中的微生物群落分析结果表明,核苷化学合成和肌苷发酵废水的曝气池中细菌类群比较相似,丰度最大的属都是Thauera,相对丰度分别达到12.13%,12.04%;城市污水处理系统中丰度最大的菌属是Dechloromonas（6.36%）。主要的功能微生物类群,例如Thauera（反硝化菌）、Dechloromonas（反硝化聚磷菌）、Nitrospira（氨氧化菌）、Nitrosomonas（氨氧化菌）等相对丰度在不同的污水处理系统中差异较大;一些致病菌,例如埃希氏志贺菌属是在城市污水、乙酰螺旋霉素和林可霉素生产废水中发现较多。耐药菌的类群在核苷化学合成和肌苷发酵废水中比较单一,主要是Pseudomonas,Acinetobacter和Alcaligenes,占可培养耐药菌的85%以上,它们均为医院感染的重要革兰氏阴性病原菌。利用实时荧光定量PCR技术研究了不同污水处理系统中耐药基因和可移动元件的丰度和分布,结果表明,制药废水和城市污水处理系统中耐药基因、可移动元件相对丰度的范围在10-6-10-1之间,乙酰螺旋霉素和林可霉素厂的剩余污泥样品中的sul1、sul2、ermB、ISCRI相对丰度明显高于其他样品,进水样品中耐药基因ermB丰度也较高。核苷和乙酰螺旋霉素、林可霉素厂污水处理系统的耐药基因削减效果较好,可能与该处理系统中连续设置两个曝气池有关。相关性分析表明,多种耐药基因、可移动元件和耐药基因、可移动元件丰度之间存在显著的正相关关系,而抗生素和重金属残留浓度与耐药基因和可移动元件丰度之间未发现显著的正相关关系。第二:四环素降解细菌富集过程中微生物群落和细菌耐药性的演化本研究使用四环素作为唯一碳源,取活性污泥作为菌源,构建了实验室条件下的四环素降解细菌富集筛选系统,利用高通量测序和荧光定量PCR技术对该系统进行了群落和耐药性的演化过程研究。结果表明,经过60天的富集,微生物群落中的优势菌在原活性污泥中并不占优势,如Shewanella,Pseudomonas和Bacillus。虽然利用高浓度的四环素作为唯一碳源,一些可能病原菌的丰度在富集后仍然增加,甚至成为优势菌属,例如Enterobacter、Pseudomonas、和Brucella。在耐药性方面,虽然tetA和tetL的相对丰度在富集后出现了一定程度上的减少,但是大部分的四环素耐药基因的丰度都是升高的。我们从富集的菌群中分离出7株四环素降解菌,其中TD-1（Bacillus）和TD-5（Shewanella）表现出高的四环素降解效率（24 h降解50%,6 d降解95%）,并能同时降解土霉素和阿莫西林。多种四环素耐药基因、可移动元件、甚至基因盒在四环素降解分离株中被检测出来。因此,耐药性病原菌和耐药基因的传播、降解菌本身的多重耐药性等风险在利用微生物处理四环素污染废水的过程中需要慎重考虑。第三:重金属Cr（VI）暴露对微生物群落和氮循环功能的影响与机制本研究中以SBR反应器为依托,设置0μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L的进水Cr（VI）暴露浓度,在连续135天的运行过程中,研究Cr（VI）毒性剂量效应对反应器出水水质、不同价态铬的固液相分配、微生物群落的进化、对氮磷循环和耐铬功能基因的影响。结果表明:0μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L的进水Cr（VI）暴露对出水水质（COD、氨氮、总氮、总磷）、污泥颗粒大小无显著影响。大部分的Cr（VI）被微生物还原,毒性被化解。废水处理系统中,铬主要沉积在污泥中,在500μg/L Cr（VI）暴露反应器中,135天时,污泥中总铬浓度甚至达到了2250mg/Kg。通过对不同重金属浓度暴露下反应器中微生物群落的动态分析表明,在门水平上,许多细菌类群对重金属的浓度变化反应敏感,如Bacteroidetes在四个反应器的丰度分别为24.27%、11.75%、12.80%、12.93%,Actinobacteria分别为0.70%、0.25%、0.16%、0.18%,Verrucomicrobia在四个反应器中的丰度分别为0.27%、0.40%、0.33%、0.62%;在属水平上,Nitrosomonas和Dechloromonas对重金属浓度变化敏感,在四个反应器中分别达到分别为0.67%、0.65%、0.54%、0.42%和7.63%、6.94%、7.14%、5.77%。通过对微生物介导的氮磷循环的功能基因定量检测表明,在实验设定Cr（VI）暴露范围内,这些功能基因丰度没有明显变化,说明微生物功能的巨大冗余性;在所有Cr（VI）暴露浓度下,一些聚磷菌类群IID、IIE、IIF和耐铬基因chrA、chrR的相对丰度均随着重金属暴露时间的延长明显升高,特别是耐铬基因的丰度在高浓度Cr（VI）暴露下升高更快,升高幅度更大,说明铬暴露压力下微生物群落明显向着耐铬群落的演化趋势。

关键词：污水处理系统;抗生素;重金属;细菌群落;耐药基因;氮循环功能基因

学科专业：微生物学

摘要

ABSTRACT

第一章 前言

1.1 抗生素和重金属的种类

1.2 污水处理系统的抗生素、重金属污染

1.3 抗生素和重金属的抗性机制

1.4 微生物降解四环素的研究现状

1.5 六价铬对群落微生态的影响研究现状

1.6 本研究的目的和意义

第二章 制药废水和城市污水处理系统中抗生素重金属残留、耐药细菌和耐药基因的分布特征

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 样品采集

2.2.2 仪器、试剂和药品

2.2.3 培养基

2.2.4 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 制药和市政污水处理系统中抗生素和重金属的分布特征

2.3.2 制药和市政污水处理系统中多重耐药菌的分布特征

2.3.3 高通量测序探究多重耐药菌的丰度和多样性变化

2.3.4 实时荧光定量PCR探究耐药基因和可移动元件的丰度变化

2.4 小结

第三章 四环素降解细菌富集过程中微生物群落和细菌耐药性的演化

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 样品采集

3.2.2 仪器、试剂和药品

3.2.3 药品、试剂

3.2.4 培养基

3.2.5 实验方法

3.3 结果和讨论

3.3.1 四环素作为唯一碳源条件下四环素降解细菌的联合进化

3.3.2 富集过程中TRGs and MGEs的变化

3.3.3 四环素降解细菌的分离和鉴定

3.3.4 降解细菌的四环素抗性和抗性的分子特性

3.4 小结

第四章 重金属CR(VI)暴露对微生物群落和氮循环功能的影响与机制

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 样品采集

4.2.2 实验材料

4.2.3 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 不同浓度Cr(VI)暴露下进出水水质的变化

4.3.2 不同价态铬的固液相分配

4.3.3 不同浓度Cr(VI)暴露对污泥颗粒大小的影响

4.3.4 不同浓度Cr(VI)暴露下群落结构的的进化

4.3.5 氮磷循环和耐铬功能基因的变化

4.4 小结

第五章 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

5.2.1 难降解抗生素和重金属的消除

5.2.2 难降解抗生素和重金属的降解转化机制

5.2.3 难降解抗生素和重金属的微生物降解转化

5.2.4 重金属(价态转化基因)和抗生素(降解基因)在污水处理系统中的种类、丰度及其相关性研究

5.2.5 污水处理系统中微生物种群和重金属、抗生素之间的相关性研究

5.2.6 微生物作用下抗生素、重金属降解(转化)的机制研究

5.2.7 抗生素、重金属降解(转化)微生物的应用研究

参考文献

致谢