基因工程论文提纲

论文题目：犬细小病毒基因工程抗体的研究

摘要：犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染引起,严重危害犬类健康的传染病,具有发病率高、传染性强、死亡率高等特点。目前犬细小病毒病没有特效药物,目前采用的单克隆抗体在CPV感染早期有良好的治疗效果,但单克隆抗体为鼠源,具有较高的免疫原性,不能连续注射。本研究通过对已有单克隆抗体进行犬源化改造,制备适合犬用的免疫原性低的抗CPV抗体药物。首先对已有抗CPV的杂交瘤细胞株4H8进行鉴定,4H8抗体亚型为IgG2b,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10~111 L/mol,只与CPV VLPs反应。经RACE-PCR提取4H8抗体可变区序列,用NCBI IgBLAST分析。将4H8抗体可变区序列与在ENA网站上查到的鼠源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H,共转染HEK-293、HEK-293F细胞进行表达。采用间接ELISA检测鼠源CPV基因工程抗体（CA）的表达量,CA在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L;血凝抑制、中和试验检测其生物活性,CA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2~4、1:152,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2~6、1:1 290。纯化CA后进行SDS-PAGE分析在55和25 Ku处出现条带;间接免疫荧光检测,CA能与CPV发生特异性结合。确定经过改造的CA依然保持活性后,进行犬源化改造。将4H8抗体可变区序列与在NCBI网站上查到的犬源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-cL和pcDNA3.1（+）-cH,按照CA的方法进行表达和检测犬源CPV基因工程抗体（CCA）。CCA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2~5、1:203,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2~9和1:2 580。CCA经Protein A亲和层析柱纯化后纯度在95%以上,血抑和中和效价分别为1:212和1:32 768。经BCA法检测CCA在HEK-293F细胞中的表达量为89.65 mg/L。SDS-PAGE分析CCA在55和25 Ku处出现条带,Western-blot检测重链能与兔抗犬IgG-HRP结合,间接免疫荧光检测CCA能中和CPV。以上结果表明,本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度高、免疫原性低的犬源化CPV基因工程抗体。

关键词：犬细小病毒;基因工程抗体;HEK-293F细胞;犬源化

学科专业：生物学

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 基因工程抗体

1.1.1 嵌合抗体

1.1.2 改型抗体

1.1.3 全人源抗体

1.1.4 单链抗体

1.1.5 双特异性抗体

1.2 基因工程抗体的制备

1.2.1 抗体基因的重组及表达

1.2.2 基因工程抗体表达系统

1.3 犬细小病毒的研究进展

1.3.1 犬细小病毒编码的蛋白质及其功能

1.3.2 犬细小病毒的致病机制

1.3.3 犬细小病毒的流行情况

1.3.4 犬细小病毒的现有疫苗

1.3.5 犬细小病毒的治疗研究进展

1.4 研究目的及意义

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3 病毒与细胞

2.2 主要溶液及配制方法

2.3 方法

2.3.1 杂交瘤细胞株的鉴定

2.3.2 鼠源CPV基因工程抗体的制备

2.3.3 表达蛋白鼠源CPV基因工程抗体的活性鉴定

2.3.4 悬浮细胞表达鼠源CPV基因工程抗体

2.3.5 鼠源CPV基因工程抗体表达量检测

2.3.6 鼠源CPV基因工程抗体纯化

2.3.7 SDS-PAGE检测鼠源CPV基因工程抗体

2.3.8 间接免疫荧光检测鼠源CPV基因工程抗体

2.3.9 犬源化CPV基因工程抗体的制备

2.3.10 表达蛋白犬源化CPV基因工程抗体的活性鉴定

2.3.11 悬浮细胞表达犬源化CPV基因工程抗体

2.3.12 犬源化CPV基因工程抗体纯化

2.3.13 SDS-PAGE及 Western-blot检测犬源化CPV基因工程抗体

2.3.14 犬源化CPV基因工程抗体表达量检测

2.3.15 间接免疫荧光检测犬源化CPV基因工程抗体

第3章 结果

3.1 杂交瘤细胞株的鉴定

3.1.1 单克隆抗体亚型鉴定

3.1.2 单克隆抗体相对亲和力测定

3.1.3 单克隆抗体特异性测定

3.2 鼠源CPV基因工程抗体的制备

3.2.1 鼠源CPV基因工程抗体可变区序列的获得

3.2.2 鼠源抗体可变区序列分区

3.2.3 鼠源CPV基因工程抗体真核表达载体鉴定

3.3 表达鼠源CPV基因工程抗体的活性研究

3.3.1 血凝抑制检测

3.3.2 中和试验检测

3.4 鼠源CPV基因工程抗体表达量检测

3.5 SDS-PAGE检测鼠源CPV基因工程抗体

3.6 间接免疫荧光检测鼠源CPV基因工程抗体

3.7 犬源化CPV基因工程抗体表达载体构建鉴定

3.8 表达犬源化CPV基因工程抗体的活性研究

3.8.1 血凝抑制检测

3.8.2 中和实验检测

3.9 犬源化CPV基因工程抗体纯化

3.10 SDS-PAGE及 Western-blot检测犬源化CPV基因工程抗体

3.11 犬源化CPV基因工程抗体蛋白纯度分析

3.12 间接免疫荧光检测犬源化CPV基因工程抗体

第4章 讨论

第5章 结论

5.1 结论

5.2 论文中提出的新方法和新思路

致谢

参考文献