棉花调控技术分析论文提纲

论文题目：棉铃虫共生菌多样性及对棉花防御反应的调控作用

摘要：植物为应对昆虫取食,进化出多种防御反应,而昆虫共生菌又可以通过影响植物信号通路,进而影响植物的防御反应。棉铃虫（Helicoverpa armigera）是棉花上的重要害虫,对其生产造成严重威胁。然而,共生菌介导棉铃虫和棉花间防御及反防御反应的现象及机制尚不清楚。本研究利用生物学、微生物组学、转录组学以及代谢组学等技术手段,研究了棉铃虫共生菌的组成和结构及其受影响的因素,以及共生菌对棉铃虫取食对棉花的防御反应的影响。结果如下:1.棉铃虫不同发育阶段共生菌的群落结构和物种多样性:通过16S r RNA高通量测序技术和宏基因组技术分析并检测了棉铃虫整个生活史体内共生菌和群落结构和多样性。结果显示:棉铃虫共生菌共注释到25个门,60个纲,140个目,264个科,548个属,898个种,厚壁菌门和变形菌门普遍存在于棉铃虫的不同发育阶段,优势菌属为肠杆菌属和肠球菌属,占70%以上,不同龄期共生菌丰度存在差异。1龄幼虫和成虫的共生菌丰富度和多样性较高,而3、4龄幼虫和蛹较低。2.棉铃虫共生菌群落的结构和物种多样性受组织部位的影响,棉铃虫反吐液共生菌有助于棉铃虫生长发育:棉铃虫3龄幼虫整虫共生菌丰富度和多样性高于各组织,其中和反吐液共生菌菌群相似度最高的是肠道共生菌,其次是中肠共生菌、唾液腺共生菌,反吐液共生菌受肠道和唾液腺共生菌共同影响。本研究分析了棉铃虫反吐液的组成和结构,并分离到棉铃虫反吐液相关共生菌。棉铃虫反吐液其优势菌为厚壁菌门,优势菌属包括肠球菌属、克雷伯氏菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌、假单胞菌属等。分离并培养朝井菌Asaia,功能研究显示Asaia可以促进棉铃虫幼虫生长发育。3.棉铃虫共生菌群落的结构和物种多样性受食物的影响:通过分析取食不同食物的棉铃虫（1龄和3龄）的共生菌群落结构和多样性,结果显示,卵和卵壳共生菌的多样性及丰富度并无显著的差异,但取食卵壳降低棉铃虫1龄幼虫共生菌物种丰富度和多样性;取食棉花后,1龄幼虫的共生菌多样性和丰富度降低,但显著高于3龄幼虫;取食棉花叶片的幼虫共生菌多样性高于取食人工饲料的3龄幼虫。4.棉铃虫共生菌群落结构和物种多样性受地理位置影响:对黄河流域不同地理种群（安阳、滨州、沧州、邱县、阳谷及室内种群）棉铃虫体内共生菌群落结构鉴定和多样性分析,结果显示:棉铃虫不同地理种群优势菌门主要为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。室内种群共生菌物种丰度和多样性远远低于野外种群,其变形菌门丰度最高（92.04%）。在属水平上,以肠杆菌属、摩根氏菌属、乳球菌属、朝井杆菌属等菌属为核心菌群,其相对丰度总和在各地理种群中分别为69.13%（安阳）、54.80%（滨州）、68.13%（沧州）、84.66%（邱县）、79.97%（阳谷）、95.13%（室内）。其中,野外种群共生菌组成相似,且地理空间距离越近,相似度越高（安阳-邱县,沧州-滨州）,野外种群与实验室种群共生菌组成差异显著。共生菌功能预测结果表明室内种群在糖合成代谢、核苷酸代谢、维生素代谢等代谢功能及翻译、复制与修复等遗传信息处理功能中相关基因表达量都显著低于野外种群。5.棉铃虫共生菌调控棉花对棉铃虫的防御反应:利用16S r RNA测序分析比较1龄、3龄以及抗生素处理后的3龄幼虫共生菌多样性,多样性指数分析显示1龄幼虫体内共生菌多样性最高,其次是3龄幼虫,抗生素处理的3龄幼虫最低。利用转录组和代谢组测序技术分析棉花叶片经3类幼虫取食后相关差异基因和代谢物表达的变化,结果显示,棉铃虫取食棉花的上下调差异基因分别为978（791）、1776（1195）、1825（1981）和代谢物40（22）、13（29）、5（43）。随着棉铃虫共生菌多样性的降低,棉花差异基因和上调差异代谢物增加,这些差异基因和（或）代谢物参与了系统获得抗性、对昆虫的防御反应的调节、茉莉酸介导的信号通路等多条与植物抗性相关的生物学过程,并注释到亚麻酸代谢、次生物质代谢、双萜类化合物合成、亚油酸代谢、MAPK植物信号通路、丙氨酸代谢、黄酮和黄酮醇的生物合成等与植物抗性相关的代谢通路中。其中,抗虫相关的指示基因包括脂氧合酶、丙二烯氧化物合酶、丙二烯氧化环化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶差异表达倍数随着棉铃虫共生菌多样性的降低呈增加趋势。1龄幼虫引起抗虫相关的黄酮类、鞣质类物质的下调表达,而3龄幼虫取食和抗生素处理的幼虫取食均引起黄酮类物质的上调表达。表明共生菌多样性低的棉铃虫幼虫取食,会引起棉花更强的防御反应。本研究以棉铃虫和棉花为研究对象,分析了棉铃虫共生菌的组成、影响因素和对棉花生长发育的影响,以及棉花经不同共生菌多样性的棉铃虫取食后的反应。极大的丰富了棉铃虫中共生菌相关信息,明确了共生菌可以介导棉花对棉铃虫防御反应。研究结果有助于解析棉铃虫共生菌介导棉花防御反应的机制,对揭示共生菌在棉铃虫中的作用和棉铃虫防治工作意义重大。

关键词：棉花;棉铃虫;共生菌;防御反应;多组学

学科专业：农业昆虫与害虫防治

摘要

ABSTRACT

第一章 文献综述

1 昆虫共生菌研究概况

1.1 起源和传播方式

1.2 昆虫共生菌主要功能

1.2.1 提供营养和进行物质代谢

1.2.2 保护宿主免受病原菌侵害以及抵御天敌

1.2.3 调控宿主生殖

1.2.4 赋予昆虫杀虫剂抗性和抗逆性

1.2.5 利用共生菌杀灭害虫

1.3 共生菌调控昆虫与植物的互作关系

1.3.1 协助宿主取食、消化寄主植物

1.3.2 促进植物病原微生物的传播

1.3.3 促进外来生物入侵

1.3.4 改变寄主植物的防御机制

1.4 共生菌研究趋势

2 昆虫与植物互作机制

2.1 植物对昆虫的防御反应

2.1.1 间接防御

2.1.2 直接防御

2.2 昆虫对植物防御反应的调节

2.2.1 植物的防御反应因昆虫食性而异

2.2.2 多重刺激触发昆虫取食期间的植物防御

2.2.3 共生菌影响植物的防御反应

3 棉铃虫与棉花互作研究

4 研究目的和意义

第二章 棉铃虫共生菌群落结构及其多样性

1 前言

2 材料与方法

2.1 供试虫源

2.2 样品收集

2.2.1 不同发育阶段棉铃虫

2.2.2 棉铃虫不同组织

2.2.3 取食不同食物的棉铃虫

2.2.4 不同地理种群的棉铃虫

2.3 16SrRNA高通量数据分析

2.3.1 DNA提取及检测

2.3.2 Illumina Miseq测序

2.3.3 优势菌群的绝对定量分析

2.4 卵宏基因组分析

2.4.1 样品收集

2.4.2 DNA提取

2.4.3 文库构建和测序分析

2.5 反吐液微生物分离培养

2.5.1 培养基的配制

2.5.2 微生物培养

2.5.3 微生物初步筛选

2.5.4 生理生化特征检测

2.5.5 16SrRNA鉴定

2.5.6 微生物对棉铃虫体重影响的测定

3.结果与分析

3.1 棉铃虫不同发育阶段共生菌群落结构及其多样性

3.1.1 数据评估与物种注释

3.1.2 棉铃虫不同发育阶段微生物的群落组成

3.1.3 棉铃虫不同发育阶段微生物比较分析

3.1.4 棉铃虫不同发育阶段微生物功能预测

3.1.5 棉铃虫卵微生物多样性分析

3.2 棉铃虫不同组织共生菌群落结构及其多样性

3.2.1 数据评估与物种注释

3.2.2 棉铃虫幼虫不同组织微生物多样性的差异

3.2.3 反吐液微生物组成分析和功能预测

3.2.4 反吐液微生物分离初步鉴定

3.2.5 反吐液微生物菌株鉴定

3.2.6 反吐液微生物对棉铃虫生长发育的影响

3.3 食物对棉铃虫共生菌的影响

3.3.1 数据评估与物种注释

3.3.2 棉铃虫卵和卵壳微生物比较分析

3.3.3 取食卵壳对1龄棉铃虫幼虫微生物多样性的影响

3.3.4 食物对棉铃虫3龄幼虫微生物多样性的影响

3.3.5 叶片饲养的不同龄期棉铃虫幼虫微生物多样性的差异

3.4 棉铃虫不同地理种群共生菌群落结构及多样性

3.4.1 数据评估与物种注释

3.4.2 不同地理种群棉铃虫微生物α多样性差异分析

3.4.3 不同地理种群棉铃虫微生物组成及丰度分析

3.4.4 不同地理种群棉铃虫微生物菌群LEfse分析

3.4.5 地理环境对棉铃虫微生物群落功能的影响

3.4.6 不同地理种群棉铃虫卵微生物绝对定量验证

4 讨论

第三章 代谢组和转录组联合解析棉花对棉铃虫幼虫防御反应

1 前言

2 材料与方法

2.1 样品收集

2.2 转录组数据分析

2.2.1 总RNA提取及转录组测序

2.2.2 基因功能注释

2.2.3 筛选差异基因

2.3 代谢组检测分析

2.3.1 样品提取流程

2.3.2 色谱采集条件

2.3.3 代谢物定量与定性原理

2.3.4 数据分析

3 结果与分析

3.1 转录组检测结果分析

3.1.1 转录组测序统计和评估

3.1.2 样品相关性分析

3.1.3 差异基因的筛选

3.1.4 差异表达聚类分析

3.1.5 差异表达基因功能注释及分类

3.1.6 差异表达基因参与代谢通路分析

3.1.7 防御反应相关基因分分析

3.1.8 转录因子分析

3.2 代谢组检测结果分析

3.2.1 数据结果与评估

3.2.2 差异代谢物的筛选

3.2.3 差异代谢物分析

3.2.4 差异代谢物KEGG注释及功能分析

3.2.5 不同棉铃虫诱导棉花差异基代谢物表达趋势分析

3.3 代谢组转录组联合分析

3.3.1 相关性分析

3.3.2 KEGG通路分析

3.3.3 相关性网络图分析

3.3.4 O2PLS分析

4 讨论

第四章 全文总结与展望

1 全文总结

2 创新点

3 展望

参考文献

附录 Ⅰ 数据质控处理分析及引物

附录 Ⅱ 抗生素处理对棉铃虫共生菌的影响

附录 Ⅲ 个人简历

致谢