Notch1（精选四篇）
Notch1 篇1
1 材料与方法
1.1 标本来源
选择2010年3月~2012年6月手术治疗并经病理证实为肝细胞癌的患者35例,每例患者均取癌组织及癌旁肝组织(距癌组织2~3 cm处)。其中,男22例,女13例,平均年龄(53.2±11.1)岁;低分化癌15例,中、高分化癌20例;癌旁组织中正常肝组织22例,肝硬化组织13例。每份标本取部分组织液氮速冻后-80℃保存备用。其余组织4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,4μm厚连续切片。
1.2 主要试剂
RNA提取试剂盒RNAprep Cell Kit购自北京TIAN-GEN公司,AMV第一链c DNA合成试剂盒购自上海生工生物工程公司、SYBR Green supermix购自BIO-RAD公司、扩增引物由上海赛百盛生物技术有限公司合成。山羊抗人Notchl多克隆抗体、Jagged1多克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品;免疫组织化学SP试剂盒,二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自武汉博士德公司;
1.3 实验方法
1.3.1 实时荧光定量PCR
每份标本取100 mg组织,按RNA提取试剂盒提取总RNA,2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪鉴定RNA完整性和纯度。A260/A280值在1.8~2.0之间符合要求。取2μg RNA样品,Oligo(d T)18作为引物,重组鼠白血病毒逆转录酶(MMLV)逆转录合成c DNA。实时荧光定量PCR反应体系:SYBR Green supermix 10μL,上、下游引物各0.5μL,c DNA样品1μL,d H2O 8μL,共计20μL。反应条件:预变性95℃15 s,1个循环;PCR反应,95℃15 s,60℃30 s,45个循环;熔解曲线分析,95℃1 min,1个循环,55℃1min,1个循环,95℃30 s,81个循环。Notch1基因引物序列:上游5'-GGACTGTGCGGAGCATGTACC-3',下游5'-TTGTCGTCCATGAGGGCACCG-3',扩增产物750 bp;Jagged1基因引物序列:上游5'-CTCATCAGCCGT-GTCTCAAC-3',下游5'-GGCACACACACTTAAATCCG-3',扩增产物297 bp;内参基因引物β-action:上游5'-GGCG-GCACCACCATGTACCCT-3',下游5'-AGGGGCCGGACTCG TCATACT-3',扩增产物202 bp。采用2-△△Ct分析法。每样品平行3管。
1.3.2 免疫组化
组织切片常规脱蜡水化后,3%H2O2室温孵育30 min,以消除内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗,磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5 min;微波抗原修复;按照免疫组化SP法操作;DAB显色;自来水充分冲洗、复染、封片。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.4 结果判断
参考文献[1],根据阳性细胞着色程度和阳性细胞数量判断结果。细胞阳性着色程度按无色、淡棕黄色、棕黄色、棕褐色分别计为0、1、2、3分。随机计数5个高倍镜中阳性细胞的百分比,阳性细胞数量按<5%、5%~<35%、<35%~<70%、70%及以上分别计为0、1、2、3分,两项相乘分数为0~4分者计阴性表达(-),5~9分者计阳性表达(+)。
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。相关分析Spearman检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Notch1 m RNA、Jagged1 m RNA的表达结果
实验扩增曲线均为典型的S型,基线平整。熔解曲线均为单一峰。肝细胞癌组织中Notch1 m RNA、Jagged1m RNA的表达显著高于癌旁正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.05);与癌旁肝硬化组织比较,差异有统计学意义(P<0.05);而癌旁正常肝组织与癌旁肝硬化组织比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.2 Notch1、Jagged1免疫组化染色结果
Notch1、Jagged1均在细胞膜、细胞质呈阳性染色(图1、2)。肝细胞癌组织中,Notch1、Jagged1的阳性表达率分别为71.4%(25/35)、68.6%(24/35);癌旁正常肝组织中,Notch1、Jagged1的阳性表达率分别为36.4%(8/22)、40.9%(9/22);癌旁肝硬化组织中,Notch1、Jagged1的阳性表达率分别为30.8%(4/13)、30.8%(4/13)。Notch1、Jagged1的阳性表达率在肝细胞癌组织中明显高于癌旁正常肝组织(χ2Notch1=6.81,χ2Jagged1=4.24,P<0.05)及肝硬化组织(χ2Notch1=6.55,χ2Jagged1=5.57,P<0.05)。Notch1、Jagged1的阳性表达率在癌旁正常肝组织与肝硬化组织间差异无统计学意义(P>0.05)。Spearman相关分析显示,肝细胞癌组织中Notch1的表达与Jagged1的表达呈正相关(r=0.38,P<0.05)。
注:肝细胞癌组织比较,t=3.67,(1)P<0.05;t=4.32,(2)P<0.05;t=4.01,(3)P<0.05;t=4.64,(4)P<0.05
2.3 Notch1、Jagged1蛋白在肝细胞癌组织中阳性表达率与临床病理特征的关系
Notch1、Jagged1蛋白的阳性表达率与患者的年龄、性别、肿瘤直径、数目、有无癌栓形成无关(P>0.05);与有无淋巴结转移、病理分级密切相关。有淋巴结转移者Notch1、Jagged1阳性表达率高于无淋巴结转移者;低分化癌组织Notch1、Jagged1的阳性表达率明显高于中高分化癌组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。
3 讨论
Notch信号通路是一种进化保守的细胞间相互作用机制[2]。目前哺乳动物有4种Notch同源受体(Notchl-4)及5种同源配体,Detal样配体包括Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4,Serrate样配体包括Jaggedl、Jagged2。Notch信号通路在细胞的发育、增殖、分化、生存和凋亡中起着十分重要的作用[3,4],因此其受体、配体的表达与肿瘤发生发展的关系一直是研究的热点。Notch1、Jagged1是其与肿瘤相关的重要关键分子[5]。
注:与无淋巴结转移比较,χ2=4.54,#P<0.05;与无淋巴结转移比较,χ2=45.38,▲P<0.05;与中高分化比较,χ2=4.44,*P<0.05;与中高分化比较,χ2=9.62,△P<0.05
我国是肝细胞癌高发区,发病率已上升到恶性肿瘤的第二位,年病死率位于恶性肿瘤病死率的第2~3位,肝细胞癌现已成为严重危害人民生命安全的恶性肿瘤之一[6,7]。Notch信号通路在肝内胆管形成、血管发育中起重要作用[8]。但有关Notch信号通路与肝细胞癌的研究报道不尽相同。Gao等[9]研究认为Notch促进肝癌细胞的生长增殖能力,加快细胞周期进展,减少细胞凋亡。与患者年龄及肿瘤的分化程度显著相关。不同的观点认为Notch1信号通过抑制Akt/Hdm2通路,抑制P53被蛋白酶体降解,导致P53水平升高,同时Notchl信号以P53依赖的方式增强DR5的表达,从而使肝癌细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感性增加[10],表明Notch在肝癌中起抑癌基因的作用。在对转移性肝细胞癌的研究中,Wang等[11]发现Notch1的高表达与肝细胞癌患者的肿瘤淋巴结转移显著相关,敲除Notch1的小鼠模型肿瘤细胞的转移活性明显降低,因此针对Notch通路的靶向治疗可抑制肿瘤的转移。
Notch1 篇2
关键词：小细胞肺癌,VEGF,Dll4,Notch1
肺癌是目前全球发病率最高的癌症, 小细胞肺癌 (SCLC) 约占肺癌总数的20%, 是肺癌中远处转移最早、恶性程度最高、预后最差的一种类型, 大多患者就诊时既已发生远处转移, 失去手术治疗机会, 因此寻找更加有效的非手术治疗方法是目前研究的热点。抗血管生成药物贝伐珠单抗给非小细胞肺癌 (NSCLC) 治疗带来的生存获益已被临床证实, NCCN指南将其列入对NSCLC的一线及二线治疗推荐[1]。SCLC相关血管信号通路的研究报道甚少, 但抗血管生成药物在SCLC的治疗中显示出了一定的应用前景[2,3], 受到众多学者的高度关注, 因此有必要研究SCLC肿瘤组织中血管信号因子如VEGF、Dll4及Notch1等的表达情况及相关性, 寻找更加合适的治疗靶点。
1 资料与方法
1.1 标本
标本为2009-2014年青岛市市立医院病理科SCLC (术前均未进行放化疗) 术后的存档蜡块, 共45例, 术后诊断均经过免疫组化检测CD56、Syn、CK和NSE四项证实。同时选取癌旁正常肺组织蜡块20例作为对照组。
1.2 试剂
兔/鼠抗人多克隆抗体 (Ⅰ抗) 、PBS缓冲液购自北京中杉金桥生物技术有限公司, 快捷型酶标羊抗鼠/兔Ig G聚合物 (Ⅱ抗) 、EDTA抗原修复液及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫组化法染色
载玻片预先经防脱片处理, 组织蜡块经4μm厚连续切片, 60℃烘烤, 二甲苯、酒精脱蜡水化, EDTA高压热修复, 3%H2O2灭活, Ⅰ抗 (工作液浓度为1∶500) 37℃孵育1 h, Ⅱ抗于室温下作用10 min, DAB显色3~5 min, 充分水洗后苏木素对比染色, 酒精、二甲苯脱水, 中性树胶封片, 显微镜下观察分析结果。
1.3.2 阳性判断标准
肿瘤细胞的胞膜或胞浆中出现棕黄色或黄褐色颗粒者为着色细胞, 着色定位 (Notch1在胞浆/膜, VEGF和Dll4分别在胞浆和胞膜) 准确为阳性细胞。按细胞着色程度评分:无着色为0分, 淡黄色为1分, 黄色为2分, 棕褐色为3分;按阳性细胞所占比例评分:<5%为0分, 5%~25%为1分, 25%~50%为2分, ≥50%为3分。然后将两项得分相加, 根据所得总分判断结果:0分为阴性 (-) , 1~2分为弱阳性 (+) , 3~4分为阳性 (++) , 5~6分为强阳性 (+++) 。
1.4 统计学处理
应用SPSS 15.0软件对数据进行统计分析, 组间阳性率比较采用X2检验, 各指标间的相关性采用Spearman等级相关分析, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGF、Dll4及Notch1在SCLC组和对照组中的表达情况
45例SCLC患者中, VEGF的阳性表达率为71.1%, 其中阳性6例, 强阳性2例;Dll4的阳性表达率为62.2%, 其中阳性6例;Notch1的阳性表达率为8.9%, 均为弱阳性。VEGF在SCLC组阳性率明显高于对照组 (字2=28.013, P<0.01) , Dll4组间 (对照组阳性率10%) 比较阳性表达率差异显著 (字2=15.194, P<0.01) ;Notch1在两组间 (对照组阳性率25%) 的表达差异无统计学意义 (字2=1.814, P>0.05) 。详见表1。
2.2 VEGF、Dll4及Notch1在SCLC中表达的相关性
应用Spearman等级相关分析对数据分析显示:VEGF与Dll4的表达呈高度正相关 (rs=0.867, P<0.01) , Notch1与VEGF的表达呈负相关 (rs=-0.425, P<0.01) , Notch1与Dll4的表达亦呈负相关 (rs=-0.370, P<0.05) 。
3 讨论
Folkman最早提出“恶性肿瘤生长依赖新生血管”的观点, 认为肿瘤的生长与肿瘤的血管生成密切相关。抗血管生成即是将肿瘤血管作为靶点从而有效控制肿瘤生长的治疗, 是目前最有希望在肿瘤缩小后维持其长期稳定、将之转变成慢性病的手段。
VEGF是肿瘤血管新生过程中最重要的因子之一, 通过与血管内皮细胞上的络氨酸受体 (VEGFR) 结合而发挥作用。抑制VEGF-VEGFR路径是目前研发抗肿瘤药物的关键目标, 而且在NSCLC治疗中已被批准应用于临床并获益。在SCLC有研究发现VEGF高表达者生存期短, 预后不良[4]。陈建华等[5]采用恩度联合CE方案治疗晚期SCLC患者, 取得了较好的临床疗效。本研究结果显示:SCLC肿瘤组织中VEGF的阳性表达率明显高于癌旁正常组织, 据此有理由推测VEGF促进了SCLC肿瘤血管的生成。但近年来临床实践显示, VEGF抑制剂并不是对所有肿瘤都有效, 有的肿瘤虽然在治疗初期有效, 但在治疗过程中可以发展为耐药。因此, 单一抑制VEGF-VEGFR显然是远远不够的, 有必要研究更多血管信号通路, 寻找新的血管治疗靶点。
Dll4-Notch是另外一条影响肿瘤血管生成的重要信号通路, 是近些年肿瘤研究的热点。Dll4是唯一特异性存在于血管内皮细胞的Notch配体, 是VEGF的下游基因, 与VEGF一起作用来调控血管萌发和分支的形态。Dll4只存在于内皮细胞的表面, VEGF高表达可使其表达显著升高, 减少VEGF, Dll4表达也同时下降;同样抑制Dll4, 也可使VEGF表达下降。本项研究结果显示:VEGF、Dll4在SCLC肿瘤组织中的表达均明显高于癌旁正常组织, 且两者在肿瘤组织中的表达呈高度正相关。提示VEGF与Dll4相互影响, 共同促进肿瘤生长;同时阻断VEGF和Dll4信号, 可能起到协同抑制肿瘤生长的作用。
Notch1受体包括Notch1~4, 是多种器官和组织正常发育所必需的调节信号, 同时也是一些肿瘤发生、发展的影响因子。胚胎肺发育研究显示Notch1在小鼠胎肺正常发育过程中发挥重要作用, 从胚胎到成熟个体Notch1表达呈现逐渐增多的动态变化。而Sriuranpong等发现Notch1的过量表达可以引起SCLC肿瘤细胞形态发生改变, 使细胞周期停滞在G1期, 抑制其继续生长。本研究结果显示:Notch1在癌旁正常组织中的阳性率略高于SCLC肿瘤组织, 且Notch1在肿瘤组织中的表达与具有促癌作用的VEGF、Dll4因子均呈负相关, 提示Notch1可能存在抑制SCLC肿瘤生长的趋势。如在阻断VEGF和Dll4信号的同时, 调节Notch1因子的表达, 有望提高SCLC的治疗效果, 改善预后。
目前, SCLC的治疗仍以放化疗为主, 预后欠佳。靶向治疗为SCLC患者带来了新的希望, 有望成为最有前途的治疗策略之一。但尚需通过增加样本数量, 进一步研究各种血管信号在SCLC发病过程中的作用机制及信号通路间的相互影响, 从而寻找更加合适的靶点。
参考文献
[1]National Comprehensive Cancer Network.NCCN Clinical practice guidelines in oncology:non-small cell lung cancer[M].Version 2.NCCN, 2013:16.
[2]Spigel D R, Townley P M, Waterhouse D M, et al.Randomized phaseⅡstudy of bevacizumab in combination with chemotherapy in previously untreated extensive-stage small-cell lung cancer:results from the SALUTE trial[J].J Clin Onco1, 2011, 29 (16) :2215-2222.
[3]Ready N E, Dudek A Z, Pang H H, et al.Cisplatin, irinotecan, and bevacizumab for untreated extensive-stage small-cell lung cancer:CALGB30306, a phaseⅡstudy[J].J Clin Oncol, 2011, 29 (33) :4436-4441.
[4]王阿曼, 蔡欣, 周涛, 等.MMP-2、VEGF、CD105和Ki-67在小细胞肺癌中的表达及预后相关性研究[J].临床肿瘤学杂志, 2012, 17 (11) :988-993.
Notch1 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
材料来源于中南大学湘雅医院2010年1月～2011年1月经病理检查证实的肝癌样本150例和及其相应癌旁正常组织。其中,男98例,女52例,年龄32～72岁,中位年龄52岁。术前均未接受过非甾体类抗炎药治疗及放、化疗。标本取出后立即以10%中性甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,5μm连续切片备用。临床与病理证实均未发现转移,肿瘤分化程度根据Edmondson四级分级法.将HCC分为I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级。
1.2 主要试剂
Notchl抗体(鼠抗人单克隆抗体,美国Neomarker公司,clone A6),工作浓度为1∶50;Jagged1抗体(鼠抗人单克隆抗体,美国Santa-cruz公司,sc8303),工作浓度为1∶50,SP免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。
1.3 方法
标本经10%中性甲醛液固定,常规处理,石蜡包埋,连续切片厚4μm。采用免疫组化SP法:石蜡切片脱蜡至水;3%H2O2室温孵育30 min,以消除内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min;微波抗原修复;10%正常山羊血清封闭,室温孵育15 min,倾去血清,分别滴加Notch1、Jagged1一抗工作液,4℃孵育过夜,PBS冲洗。5 min×3次:滴加生物素标记的二抗,37℃孵育20~30 min,PBS冲洗,5 min×3次;滴加辣根酶标记链酶卵白素.37℃孵育20～30 min,PBS冲洗,5 min×3次;DAB显色;自来水充分冲洗、复染、封片。实验中同时设阳性和阴性对照。
1.4 染色结果判断
Notch1和Jagged1阳性染色定位于胞浆。参照CARCANGIU等[2]的半定量评分方法。根据阳性细胞着色程度和阳性细胞数量判断结果。细胞阳性着色程度按无色、淡棕黄色、棕黄色、棕褐色分别计为0、1、2、3分,阳性细胞数量按<5%、5%～35%、36%～70%、>70%分别计为0、1、2、3分,然后根据两项评分相乘之积判断结果≤1分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),4～5分为中度阳性(++),≥6分为强阳性(+++)。
1.5 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件包进行等级资料的秩和检验和等级相关分析。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 Notch1受体和配体分子J a gge d1在肝癌和癌旁正常组织中的表达
免疫组化结果显示,肝癌组织中Notch1及Jagged1分子主要表达于肿瘤细胞的胞浆(附图)。由表1可见,Notch1受体分子和配体Jagged1分子在肝癌和癌旁正常组织中均有不同程度的表达,在肝癌和癌旁正常组织中,Notch1的阳性表达率分别为16.4%和91.3%;Jagged1的阳性表达率分别为10.9%和85.7%,两组间差异均有显著性(P=0.000)。
A:Notch1在肝癌组织中的强阳性表达;箭头所指为阳性颗粒;B:Notch1在肝癌旁组织中的弱阳性表达;箭头所指为阳性颗粒;C:Jagged1在肝癌组织中的强阳性表达;箭头所指为阳性颗粒;D:Jagged1在肝癌旁组织中的阴性表达。
2.2 肝癌组织中Notch1、J a gge d1蛋白的表达与临床病理特征的关系
2.2.1 肝癌组织中N otch1、Jagged1蛋白的表达与患者性别及年龄的关系
2.2.2 肝癌组织中N otch1、Jagged1蛋白的表达与病理特征的关系
表3可见,Notch1分子的表达与肝癌组织学分级、Edmondson分期及有无淋巴结转移均无关(P>0.05)。表4可见,Jagged1分子在肝癌不同分化级别间差异显著,中高分化组肝癌Jagged1表达(82.9%)显著低于低分化组(100.0%,P<0.05);分化程度越低,Jagged1的表达越高,两者呈负相关(rs=-0.392,P=0.002);不同Edmondson分期间Jagged1表达差异也显著,Edmondson(I+II)期Jagged1表达(78.3%)显著低于Edmondson(III+IV)期(96.4%,P<0.05);从Edmondson I期到IV期,表达逐渐增高,两者呈正相关(rs=0.276,P=0.001);有淋巴结转移者Jagged1的表达(97.1%)显著高于无淋巴结转移者(73.3%,P<0.05),且两者之间也呈正相关(rs=0.252,P=0.006)。
2.2.3 肝癌组织中N otch1与Jagged1的表达的关系
由表4可见,肝癌组织中Notch1与Jagged1的表达呈正相关(rs=0.247,P=0.007)。
3 讨论
Notch信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之一,对多细胞生物中细胞命运的决定起关键作。在哺乳动物中共发现4类Notch基因,编码4种Notch受体,分别为Notchl1-4。Notch受体是一种跨膜受体,成熟的Notch受体分子是由胞外域和跨膜区/胞内域2个亚基组成的异三聚体。Notch胞外区与其配体结合后调节细胞间的相互作用并进而激活Notch,经3次裂解后产生NICDN,此为Notch受体的活化形式。
1991年,Notch1与肿瘤的关系首先在人类T淋巴母细胞白血病中被确定[1]随后的研究发现,染色体易位t(7;9)(q34;q34.3)使位于9号染色体上的Notch1基因断裂,导致Notch1胞外区丢失,其胞内区获得组成性活性而呈现致癌作用。但Notch信号与肿瘤的关系极其复杂,在不同状况下,分别充当癌基因或抑癌基因的作用。如TONON等[2]阐述了Notch在黏液表皮样癌中作为癌基因在信号通路中的作用,而NICOLAS等[3]则发现在鼠皮肤癌发生中,Notch1起抑癌作用而不是促癌作用。在不同组织、肿瘤发展的不同阶段,Notch的作用也可能不同。ZAGOURAS等[4]实验显示,从正常宫颈组织到宫颈上皮内瘤变,再到早期分化好的宫颈癌,Notch1的表达量逐渐增高,其定位由胞质至胞核,而晚期宫颈癌Notch1表达水平显著下降,提示Notch1在宫颈癌发生早期阶段为促癌作用,而晚期表现为抑癌作用。COLLINS等[5]研究发现,非小细胞肺癌(NSCLC)组织中Notch1和Notch2呈高表达,在小细胞肺癌(SCLC)中却很少能检测到Notch1表达,Notch2也只偶有表达。Notch1信号激活对NSCLC是促进肿瘤细胞生长,对SCLC则抑制肿瘤细胞生长。
人的Notch配体包括Delta1、Delta3、Delta4、Jaggedl和Jagged2五种。Jagged1是Notch受体的主要配体之一,参与调控许多组织的生长发育,对正常造血前体细胞的维持及其增殖的调控起着重要作用。Jagged1通过与邻近细胞表面Notch受体的胞外域结合而触发Notch信号通路,通过HES-1,Deltex和NF-κB等转录因子调节靶基因的转录。DICK-SON等[6]发现乳腺癌组织中Notch1和Jagged1表达增强,并与恶性肿瘤侵袭性增强、预后不良有显著关系,其十年生存率及中位生存期明显降低。配体Jagged1蛋白的表达在转移性前列腺癌中的表达明显高于无转移者及前列腺良性组织,提示Jagged1与前列腺癌转移及复发有关。
本研究显示,Notch1蛋白在肝癌中的表达明显高于癌旁正常组织,与CHU等[7]的研究结果相符;本研究表明肝癌组织中Jagged1蛋白表达显著增强,且Notch1蛋白与Jagged1蛋白表达呈正相关。说明Notch1信号也参与了肝癌的致病过程。本研究还表明肝癌中Notch1及Jagged1蛋白的表达与患者性别与年龄,肿瘤的部位与大小均无关;但Jagged1蛋白的表达与大肠癌的分化程度有关,中高分化大肠癌Jagged1蛋白的表达显著低于低分化大肠癌,且两者呈负相关:不同Edmondson分期间Jagged1表达差异也显著,Jagged1表达在Edmondson(I+II)期患者中低于Edmondsons(III+IV)期,两者呈正相关;有淋巴结转移者Jagged1的表达高于无淋巴结转移者,也呈正相关关系。这些结果进一步提示Jagged1可能在肝癌的发生发展中起促进作用。因为肿瘤组织学分级、Edmondsons分期及淋巴结转移与预后密切相关。因此,肝癌组织中Jagged1蛋白的表达可能作为预测肝癌预后的一个指标,有待进一步随访研究。
综上所述,笔者发现:肝癌组织中Notch1受体及其相关配体Jagged1的蛋白表达明显增强,且后者与肝癌分化程度、Edmondson分期及淋巴结转移密切相关。提示Notch信号在肝癌致病过程中起促癌作用。Jagged1在促进肝癌发生发展中可能起重要作用。有待进一步进行体内和体外实验证实。
摘要：目的 探讨Notch1及Jagged1蛋白在肝脏肿瘤中的表达特点及其与肝癌的临床病理学特点的关系。方法 采用免疫组织化学SP法检测65例肝癌组织及其相应癌旁正常组织中Notch1和Jagged1蛋白的表达。结果 在肝癌和癌旁正常组织中,Notch1的阳性表达率分别为16.9%和90.8%;Jagged1的阳性表达率分别为10.9%和86.2%,两组间差异均有显著性(P=0.000)。Notch1受体和Jagged1配体分子的表达与患者年龄、性别,肿瘤大小无关;Notch1受体表达与肝癌组织学分型、Edmondson分级及有无淋巴结转移无关(P>0.05);而Jagged1配体表达则与肝癌组织学分型、Edmondson分级及有无淋巴结转移有关(P<0.05);在肝癌组织中Notch1与Jagged1的表达呈正相关(rs=0.301,P=0.005)。结论 Notch1蛋白和Jagged1蛋白可以作为诊断肝癌的特异性指标,也有望成为肝癌基因治疗的新靶点。
关键词：肝细胞癌,Notch1受体,Jagged1配体
参考文献
[1]ARTAVANIS TSAKONAS S,RAND MD,LAKE RJ.Notch sig-naling:cell fate control and signal integration in development[J].Science,1999,284(5415):770-776.
[2]TONON G MODI S,WU L,et a1.t(1l,19Xq21,p13)translo-cation in mucoepidermoid carcinoma creates a novel fusion prod-uct that disrupts a Notch signaling pathway[J].Nat Genet,2003,33(2):208-213.
[3]NICOLAS M,WOLFER A,RAJ K,et a1.Notch1 functions as atumor suppressor in mouse skin[J].Nat Genet,2003,33(3):416-421.
[4]ZAGOURAS P,STIFANI S,BLAUMUELLER CM,et a1.Alter-ations in Notch signaling in neoplastic lesions of the humancervix[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(14):6414-6418.
[5]COLLINS BJ,KLEEBERGER W'BALL DW.Notch in lung de-velopment and lung cancer[J].Semin Cancer Biol,2004,14(5):357-364.
[6]DICKSON BC,MULLIGAN AM,ZHANG H,et a1.High-levelJAG 1 mRNA and protein predict poor outcome in breast cancer[J].Mod Pathol,2007,20(6):685-693.
Notch1 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2012年1月-2014年1月来我院就诊的乳腺增生伴癌变患者140例，经皮下乳腺癌切除术后有效患者119例，为有效组，年龄25～50(36.5±7.8)岁;无效患者21例，为无效组，年龄25～50(36.5±7.7)岁。2组患者年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 纳入与排除标准
纳入标准:(1)患者经术后病理检查确诊为乳腺增生伴癌变，且单侧乳腺发病;(2)患者符合手术治疗适应证;(3)患者及家属了解研究目的，同意配合研究。排除标准:(1)患者存在乳腺纤维腺瘤、乳腺良性增生性病变等乳腺良性疾病;(2)患者存在心肺肝肾功能不全，神经功能异常等内外科基础疾病。
1.3 方法
所有患者均接受皮下乳腺切除术，给予全身麻醉，上肢向外张开10°～25°，沿其乳房外边缘切开，游离并切除乳腺浅筋膜表层和内层间的增生和癌变组织，并用组织钳将浅筋膜层拉至乳头部位切开，夹起乳腺腺体翻开，切除浅筋膜间游离疏松结缔组织以便完整切除乳腺腺体。同时探查乳腺周围淋巴结有无癌细胞转移并尽可能切尽，结扎血管、置引流管、逐层缝皮，加压包扎，术闭。术后给予抗生素预防感染、营养支持等常规治疗措施。手术切除的乳腺组织迅速放入-80℃冰箱中冻存，待检，采用免疫组化S-P法检测Notch1与Cyclin D1阳性表达率。首先制作乳腺癌组织石蜡切片，每一标本制作3张，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后行高温高压煮沸，修复抗原。采用0.3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，滴加正常山羊血清1滴静置10min封闭抗原。每一切片分别给予一抗稀释液稀释的抗Notch1和抗Cyclin D1抗体一滴(ABCAM公司生产，稀释浓度1∶50),4℃过夜。次日室温放置30min后PBS洗净，滴加二抗，置于37℃水浴箱中孵育30min,PBS洗净后滴加DAB显色液1滴，静置显色3～5min，流水冲洗10min。苏木素复染细胞核1min，再次经脱水和透明处理，45℃烤箱干燥，中性树胶封片，判断乳腺癌组织Notch1和Cyclin D1阳性表达率。
1.4 阳性率诊断标准
所有免疫组化切片均由我院病理科经验丰富的病理医师检测，每张切片均由3位病理医师于光学显微镜下进行盲法比较，若三者诊断不一致则需综合讨论决定阳性表达率。Notch1阳性表达特点为细胞膜和细胞浆被染成黄色颗粒，而Cyclin D1阳性表达特点为细胞核被染成黄色颗粒。随机选择高倍镜视野5个进行判断，确保每个视野细胞数≥100个[2]。根据肿瘤细胞染色强度和阳性百分数进行计分:(1)染色强度评分:细胞染色呈无色0分，浅黄色1分，黄色2分，棕褐色3分。(2)Notch1阳性细胞百分数:0分:无阳性细胞表达或表达<5%,1分:阳性细胞比例5%～35%,2分:阳性细胞比例36%～70%,3分:阳性细胞比例>70%。(3)Cyclin D1阳性细胞百分数:0分:无阳性细胞表达或表达<5%,1分:阳性细胞比例5%～30%,2分:阳性细胞比例30%～70%,3分:阳性细胞比例>70%。染色强度与阳性细胞百分数评分之积即可评估阳性表达率:Notch1:<2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中阳性(++)，>5分为强阳性(+++);Cyclin D1:0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。阳性表达率为弱阳性、中阳性和强阳性之和[3]。
1.5 统计学方法
应用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Notch1表达水平相关性
有效组Notch1阴性(-)检出率明显低于无效组，阳性检出率高于无效组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
注:与无效组比较，*P<0.05
2.2 Cyclin D1表达水平相关性
有效组Cyclin D1阴性(-)检出率明显高于无效组，阳性检出率低于无效组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
注:与无效组比较，*P<0.05
3 讨论
由于现代女性生活和工作方式的改变，持续快节奏生活和巨大精神心理压力严重影响女性的健康安全，导致育龄期女性发生乳腺增生，甚至乳腺癌等乳腺疾病。乳腺增生治疗不规律、不彻底可致严重乳腺疾病，如乳腺增生、乳腺癌等。虽乳腺癌切除术是目前临床治疗乳腺癌较为常用的措施，但由于乳腺切除术对女性巨大的精神心理和生理创伤，其临床应用率较低，且治疗乳腺癌根治效果亦不理想[4]。因此，部分临床继续致力于乳腺癌治疗新型措施的研究，而部分研究认为术后积极有效预防对提高乳腺癌治疗效果和患者预后结局具有重要意义。为此，本文着重分析乳腺癌发生中较为密切的Notch1和Cyclin D1，探讨其与乳腺增生伴癌变治疗效果的相关性。
Notch信号传导通路广泛存在于脊椎和非脊椎动物中，其进化具有高度保守性。研究发现Notch信号传导途径参与多种细胞的生长、分化和凋亡，其在人类中的Notch抗体包括4类，而Notch1与肿瘤发生最为密切。Notch1在多种恶性肿瘤的发生发展中既具有促癌作用，又具有抑癌效应。如Notch信号在早期宫颈癌的发展中表现为促癌效应，但在晚期宫颈癌中则可抑制其发展。但针对人类乳腺癌的免疫组化研究、免疫荧光实验均证实其在乳腺癌细胞中的表达明显低于正常水平，即Notch1信号在人类乳腺癌的发生中呈抑癌作用[5]。而本文观察结果亦证实疗效较好患者具有较高的Notch1阳性表达率，因此有助于乳腺癌患者术后复发的抑制。
大量研究已证实大量细胞周期因子在细胞恶性转化、肿瘤发生过程中具有重要促进作用，尤其是G1期相关各种因子，如正向调节作用细胞周期蛋白(Cyclins)[6]。Cyclin D1是Cyclin家族中最重要成员之一，具有较强的致癌作用，并主要表达于恶性肿瘤中。研究认为Cyclin D1在乳腺癌发生中的具体作用为缩短细胞周期，促进乳腺组织增生、进而发生癌变导致乳腺癌的发生。大量免疫组化研究均证实各期乳腺癌组织Cyclin D1阳性表达率明显高于正常水平[7]。本文检测结果发现疗效较差乳腺癌组织Cyclin D1阳性表达率高于疗效显著患者，与上述分析结论相符。
因此，通过术后病理检查Notch1和Cyclin D1的阳性表达率，可评估患者乳腺癌术后效果，进而为早期预防和干涉乳腺癌提供指导意见。
参考文献
[1]周毅,周勤,吴池华,等.皮下乳腺切除术治疗乳腺增生伴癌症临床分析[J].现代生物医学进展,2015,15(8):1492-1495.
[2] 杜平.具有癌变性状的乳腺增生组织手术切除的临床治疗效果[J].当代医学,2012,18(30):89-90.
[3] 金科.Notch1与Cyclin D1在乳腺增生症与乳腺癌中的表达[D].大连:大连医科大学,2009.
[4] 徐五琴,武世伍,马莉,等.Notch1和FSCN1在乳腺癌中的表达及其临床意义[J].上海交通大学学报:医学版,2014,35(9):1365-1371.
[5] Tominaga M,Sueoka N,Irie K,et al.Detection and discrimination of preneoplastic and early stages of lung adenocarcinoma using hnRNP B1combined with the cell cycle-related markers p16,cyclin D1,and Ki-67[J].Lung Cancer,2013,40(1):45-53.
[6] 王阳,徐细明,邓君健,等.p16及cyclin D1在乳腺癌组织中的表达及其临床意义[J].医学综述,2014,20(23):4358-4360.