α1抗胰蛋白酶（精选八篇）
α1抗胰蛋白酶 篇1
1 资料与方法
1.1 病例选择
2010年5月~2010年12月在宁夏地区,采用多级分层整群抽样的方法,分别在银川市、大武口市、吴忠市、泾源县进行COPD流行病学调查。选取40周岁以上居民,所有被选取人员均进行调查问卷及肺功能检查。COPD组:根据2002年中华医学会呼吸病学分会制定的COPD诊断标准,即吸入支气管舒张剂后第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FE V1/FVC)<70%并除外其他疾病者诊断为COPD,诊断明确后抽血备用。COPD组均经过详细的询问病史、胸部X线及心电图检查,均不伴有支气管扩张、肺结核、支气管哮喘等慢性肺疾病及急性心脏病,所有COPD组均为COPD稳定期患者。对照组:既往无呼吸系统慢性疾病,经肺功能检查正常,即FEV1≥80%预计值,FEV1/FVC≥70%。
COPD组267例。男178例,女89例;平均年龄(60.99±10.91)岁。不吸烟组125例,吸烟组142例,吸烟包年数为(37±18)py,吸烟率为53.18%。汉族137例,回族129例。城镇137例,乡村130例。银川市75例,大武口市62例,吴忠市59例,泾源县71例。
对照组280例,其中部分人员拒绝抽血,最终选取213例,男129例,女84例;平均(58.53±9.94)岁。不吸烟组132例,吸烟组81例,吸烟包年数为(29±17)py,吸烟率为38.02%。汉族115例,回族97例。城镇127例,乡村86例。银川市69例,大武口市58例,吴忠市47例,泾源县39例。
1.2 试剂和仪器
检验试剂盒由北京瑞格博科技发展有限公司提供,美国R&D System ELISA 96T;采用酶联免疫吸附法(ELISA)直接测定人血清α1-AT水平;肺功能仪采用意大利生产的便携式MIR SPIROLABⅡ型肺功能仪,由培训过的操作人员检测。
1.3 标本提取
所有COPD组及对照组人员用标准5 m L速凝管采集静脉血4 m L,2 h内离心后放入-80℃冰箱保存,暂无-80℃冰箱保存条件的,先放入-20℃冰箱保存,一周内放入-80℃冰箱保存,标本收足后,将血清一并解冻检测,避免反复冻融。
1.4 统计学处理
采用SPSS 11.5软件对结果进行统计分析,统计数据应用均数±标准差表示,均数95%可信区间、COPD组和对照组之间计量资料比较采用两样本t检验,组间计量资料比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 α1-AT血清水平测定
COPD组α1-AT血清水平显著低于对照组(P=0.000,见表1)。
2.2 吸烟与α1-AT血清水平的关系
吸烟对α1-AT血清水平的影响,在对照组(P=0.739)和COPD组(P=0.306)之间差异无统计学意义。见表2。
2.3 回、汉民族与α1-AT血清水平的关系
回汉民族的α1-AT血清水平的影响,在对照组(P=0.105)和COPD组(P=0.355)之间差异无统计学意义。见表3。
2.4 城乡与α1-AT血清水平的关系
城乡对α1-AT血清水平的影响,在对照组(P=0.052)和COPD组(P=0.006)之间差异无统计学意义。见表4。
2.5 不同地区间α1-AT血清水平的对比
4个地区α1-AT血清水平的影响,在对照组(P=0.939)和COPD组(P=0.689)之间差异均无统计学意义。见表5。
2.6 性别与α1-AT血清水平的关系
性别对α1-AT血清水平,在对照组(P=0.441)和COPD组(P=0.135)之间差异无统计学意义。见表6。
2.7 年龄与α1-AT血清水平的关系
各年龄段α1-AT血清水平的影响,在对照组中(P=0.382)和COPD组(P=0.193)之间差异无统计学意义。见表7。
3 讨论
本调查结果显示,213例对照组中α1-AT平均血清水平为(19.10±7.57)g/L,267例COPD患者中α1-AT平均血清水平为(11.31±4.87)g/L,COPD组α1-AT血清水平显著低于对照组(P=0.000),没有发现α1-AT明显降低者。α1-AT血清水平高低及相对缺乏与国人COPD的发病是否有相关性一直受到关注。在针对国人的研究中,张彦[5]的研究显示对照组α1-AT血清水平为(2.7±0.8)g/L,COPD组α1-AT血清水平为(2.3±1.1)g/L,COPD组α1-AT血清水平显著低于对照组(P=0.012)。陈颖[6]的研究显示对照组α1-AT血清水平为(15.68±4.64)g/L,COPD组α1-AT血清水平为(9.88±6.36)g/L,COPD组α1-AT血清水平显著低于对照组(P<0.05),上述结果与本研究结果相同,均显示COPD组α1-AT血清水平低于对照组,原因考虑如下:COPD患者反复感染增加了α1-AT的负担,α1-AT抑制蛋白酶是一个自毁的反应过程,在这一过程中,α1-AT蛋白酶复合物被巨噬细胞吞噬并从血浆中清除,如果机体代偿不足,则会导致α1-AT减少。上述结果表明α1-AT的相对低浓度参与了COPD的发病过程,α1-AT的降低与COPD的发病有关。以上研究所检测的α1-AT血清水平的具体数值有所偏差,考虑与以下因素有关:(1)测定方法不一样,本研究采用ELISA法直接测定血清中α1-AT的绝对含量,而其他研究有的采用间接法,测定方法不同可能出现数据的差异。(2)所购买试剂盒不同在测定的过程中也会存在差异。(3)α1-AT是一种蛋白酶,半衰期为3~5 d,因此,离体的血标本是否保存得当直接影响检测结果[7]。
吸烟是COPD最重要的发病因素,在中国吸烟约占COPD病因组成的71.6%[8],随着吸烟量的增加,患COPD的机会也越高,可高达40%以上[9]。本研究显示,在对照组、COPD组中不吸烟和吸烟者α1-AT血清水平差异无统计学意义;但在两组中,吸烟者的α1-AT血清水平较不吸烟者有所降低,这说明烟草对吸烟者的α1-AT血清水平可能会产生一定影响。国内外已有研究显示,吸烟能促使肺泡巨噬细胞释放中性粒细胞趋化因子,刺激中性粒细胞释放大量的弹性蛋白酶。烟草中含有的氧化剂可以氧化α1-AT的活性中心,从而抑制α1-AT的活性,造成蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡[10,11],但目前尚缺乏吸烟与α1-AT含量的报道。
宁夏是我国惟一的省级建制的回族自治区,根据2010年全国人口普查结果,宁夏现有人口约为630万人,其中回族人口为219万人,占34.77%。回族的生活方式、遗传基因和汉族存在差异,尚无报道显示民族之间的α1-AT血清水平是否存在差异,本研究结果显示,COPD组和对照组回汉族之间的α1-AT血清水平差异无统计学意义,说明在宁夏地区民族差异对α1-AT血清水平无明显影响。
在宁夏地区,城乡经济发展不平衡,城镇居民生活水平、卫生状况优于乡村,本调查显示,城镇和乡村的α1-AT血清水平差异无统计学意义,说明城乡差异对α1-AT血清水平无明显影响。本次调查涉及宁夏的4个地区,4个地区的地理位置完全不同,自南向北贯穿宁夏,每个地区的自然环境和气候不尽相同,而4个地区的α1-AT血清水平的多重比较结果表明,宁夏地区地理位置对α1-AT血清水平无明显影响。
在本研究中还将性别、年龄纳入,根据不同的年龄段分为4层,结果显示α1-AT血清水平与性别和年龄均无明显关系。
参考文献
[1]SENN O,RUSSI EW,IMBODEN M,et al.a1-Antitrypsin defi-ciency and lung disease:risk modification by occupational anden-vironmental inhalants[J].Eur Respir J,2005,26:909-917.
[2]RUSSI RW.Alpha-1 antitrypsin:now available,but do we needit[J].Swiss Med Wkly 2008,138(13-14):191-196.
[3]FREDERICK J.World wide racial and ethnic distribution ofAAT deficiency surveys[J].Chest,2002,122:1818-1829.
[4]李衡,刘蔼成,陈秀銮,等.中南地区正常人血清α1-抗胰蛋白酶检测结果分析[J].实用预防医学,1994(1):132-133.[4]LI H,LIU AC,CHEN XL,et al.Analysis ofα1-antitrypsintest results of normal in central and southern regions[J].PracticalPreventive Medicine,1994(1):132-133.Chinese
[5]ZHANG Y,HE P,ZHAO MW,et al.The investigation of geno-type and expression ofα1-AT in patients with COPD[J].NatMed J China,2005,85(18):1270-1273.Chinese
[6]CHEN Y,YANG XH.The investigation ofα1-AT changes inpatients with COPD[J].Xinjiang Medicine,2008,38:9-11.Chi-nese
[7]LIU YX,YANG T,YE YP,et al.Researches on the co-rela-tions between serumα1-antitrypsin level and ariway inflamma-tion,and pulminary function in COPD patients during the sta-tionary phases[J].Journal of Capital University of Medical Sci-ences,2006,27:35-37.Chinese
[8]CHENG XS,LI JZ,ZHANG XZ,et al.Analysis of basic data ofthe study on prevention and treatment of COPD and chronic corpulmonale[J].Chin J Tubere Respir Dis,1998,21:749-752.Chinese
[9]CHENG XS,LI JZ,ZHANG ZX,et al.The relationship betweensmoking and the incidence of COPD[J].Chin J Tubere RespirDis,1999,22(5):290-292.Chinese
[10]EDEN E,TUR INO GM.Alpha1-antitrypsin deficiency:lessonsfrom longevity[J].Chest,2009,135(3):591-592.
α1抗胰蛋白酶 篇2
【摘要】目的:观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在卵泡不同发育期中的表达，初步探讨其与卵泡发育的关系。方法:选择不同周龄的C57BL/6J小鼠卵巢，用免疫组化法检测卵泡不同发育期中HIF-1α蛋白。结果:HIF-1α蛋白在不同发育期卵泡卵母细胞及颗粒细胞中均有表达，表达随卵泡发育而增强。且不同发育阶段卵泡中卵母细胞及颗粒细胞中HIF-1α蛋白表达差异具有统计学意义( P < 0. 05)。结论:卵泡发育不同阶段HIF-1α均有表达，在卵泡发育后期强表达。提示HIF-1α在卵泡的生长发育可能起重要调控作用。
【关键词】HIF-1α；卵泡发育；免疫组织化学；小鼠
【中图分类号】R339.2【文献标志码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0029-02
【Abstract】Objective:To explore the protein expression of HIF-1α in different developmental stages of the mice follicles. Methods Mice ovaries of different developmental stages were collected. The expression of HIF-1α protein was detected and evaluated by immunohistochemistry. Results HIF-1α proteins were expressed in the oocyte and granulosa cells of all different developmental stages. The expression of HIF-1α increased with the follicle development. HIF-1α protein levels in oocyte and granulosa cells of all different developmental stages were significantly lower
compared with each other stages(P < 0. 05). Conclusion The expression of HIF-1α protein especially at the late stage of the follicle development, suggests that the HIF-1α protein may play important roles in the follicle development.
【Key words】HIF-1α; follicle development; Immunohistochemistry; Mice
女性成年后卵巢即出現周期规律性排卵直至绝经时终止。经过多年研究表明：这是一个多因素相互作用的复杂的生物过程：伴随着下丘脑-垂体-卵巢轴（Hypothalamus-Pituitary-Ovary Axis，H-P-O轴）中相关激素如：卵泡刺激素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH），黄体生成素（Luteinizing Hormone，LH）等精确调控下卵巢中卵泡发育及其微环境改变，如卵泡液雌孕激素浓度上升及卵泡周围出现较多新生血管［1］。缺氧诱导因子1 (Hypoxia-Inducible Factor，HIF 1) 即，是广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成，其中HIF-1α是主要的氧调节亚基，可以调节多种靶基因如萄葡糖转运因子、血管内皮生长因子 (Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)［2］，对细胞适应缺氧状态至关重要。本研究从蛋白水平检测了小鼠卵巢中不同发育期卵泡HIF-1α的表达，旨在探讨HIF-1α在不同发育期卵泡的作用，并为今后进一步研究奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 实验动物:C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。由于昆C57BL/6J小鼠生后3周断奶，5～7周为性成熟期，9～12周为繁殖适龄期，为使处于不同时期的卵泡分布均匀，选取3周、6周、11周、15周各10只小鼠。苯巴比妥(15mg.kg -1) 腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定。卵巢取出后脱水透明、包埋、制4μm厚的石蜡切片。
1. 2 免疫组织化学法检测HIF-1α蛋白表达: 行超敏二步法免疫组化检测。HIF-1α一抗为羊抗小鼠单克隆抗体，购自武汉博士德公司；超敏二步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。石蜡切片脱蜡至水。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，抗原修复15分钟，室温冷却。3%过氧化氢室温孵育10分钟，PBS冲洗，2分钟×3次。滴加1: 500一抗4℃孵育过夜。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加试剂1，37℃孵育20分钟，PBS冲洗，5分钟×3次。滴加试剂2，37℃孵育20分钟，PBS冲洗5分钟×3次。DAB显色剂显色。自来水冲洗，苏木素复染，酒精逆浓度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照。
1. 3 结果判读:参照张爱群等［3］的标准，根据着色强度及范围分为： 阴性（-）， 无阳性染色细胞或细胞着色数 <5%； 弱阳性（+）， 阳性细胞数 5%- 25%；阳性（++），阳性细胞数（26%-50%） ； 强阳性（+++）， 阳性细胞数 >50%，
卵泡发育可分为5期：始基卵泡，由一个初级卵母细胞和一层梭形的前颗粒细胞组成。初级卵泡，颗粒细胞形成单层立方形并且在卵母细胞外形成透明带。次级卵泡，卵泡继续增大出现双层或多层颗粒细胞,此时尚无卵泡腔形成。窦状卵泡，颗粒细胞间聚集的卵泡液增加最后融合形成卵泡腔［4］。
1.4统计学处理 :采用SPSS13. 0 软件对数据进行分析。对数据行双向有序资料的χ2检验。
2 结果
2. 1 HIF-1α蛋白免疫组化结果：①着色部位: HIF-1α蛋白主要分布于细胞质,少量分布于细胞核。见图1，2，3。②HIF-1α蛋白表达于各级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞，且表达水平随卵泡发育逐渐增强。始基卵泡与次级、窦状卵泡相比，卵母细胞和颗粒细胞中HIF-1α蛋白表达明显较低，差异有统计学意义( P < 0. 05)。其在初级卵泡卵母细胞与颗粒细胞中表达均显著低于次级、窦状卵泡，差异有统计学意义( P < 0. 05)。次级卵泡与窦状卵泡相比，卵母细胞和颗粒细胞HIF-1α蛋白表达明显降低，差异有统计学意义( P < 0. 05)。见表1，表2。
3 讨论
HIF是作为促红细胞生成素基因表达的转录因子被首先确定的 ,后来发现 ,大多数低氧诱导基因的低氧诱导途径是通过 HIF 实现的。因此 , HIF 被称为低氧适应调节的管家转录因子［5］。其表达主要受缺氧及P53等转录因子的调控。HIF-1是氧气敏感的二聚体，由HIF-1 α和芳香烃受体核转位（芳香烃受体核转位，Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator, HIF-1 β/ARNT）亚基组成。在常氧状态下，HIF-1β位于细胞核中，而HIF-1α则在细胞质中，并被泛素-蛋白酶体系统快速降解；当氧气含量低于5%时会令HIF-1 α蛋白在细胞质中积聚，随后HIF-1α转位到细胞核中，结合HIF-1β形成HIF-1复合物,才能激活促红细胞生成素，VEGF等基因的转录进而发挥调节红细胞生成，血管形成等作用［6］。
卵泡发育是一个受到多种因素精细调控的复杂过程，其中氧气含量也是调控卵泡生理功能的重要因素之一［7,8］。有文献表明：一方面由于卵巢内氧气浓度较低，其范围在1.3%-5.5%左右［9］；另一方面随着卵泡卵母细胞的生长发育以及颗粒细胞的增殖分裂，颗粒细胞需氧量逐渐上升，使卵泡处于缺氧状态。在本实验中观察到，作为缺氧状态主要感受器的HIF-1 α表达于卵泡的整个生长阶段，且其强度随着卵泡发育逐渐增强，证实了随着卵泡发育卵泡内氧需求量逐渐上升并且在始终处于相对缺氧状态。Alam［10］等研究表明：HIF-1α在体外培养颗粒细胞中通过 磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K）途径参与到FSH诱导的卵泡血管生成，本研究中观察到HIF-1α在窦状卵泡中强烈表达，为此实验提供了直接的体内实验证据，同时亦提示HIF-1α可能参与到GnRH，FSH，LH等调控卵泡发育的过程。说明HIF-1 α参与了卵泡发育整个过程，并可能在此过程中通过上调VEGF等基因表达进而促进卵泡中新生血管形成，从而对卵泡的生长发育发挥重要调控的作用。
综上，卵泡生长发育的过程受到众多因素的调节，对其中卵泡局部氧气浓度对于调节其生长发育至关重要。本试验提出卵泡中HIF-1 α表达在调控生长卵泡中新生血管发挥一定作用。实验结果为探索局部氧气浓度在调控卵泡生长发育中具体作用提供了新的思路，并为日后的进一步研究奠定基础。
参考文献
［1］Broekmans FJ; Soules MR;Fauser BC et al. Ovarian Aging: Mechanisms and Clinical Consequences ［J］. Endocr. Rev. 2009 30:465-493
［2］Wenger RH, Gassmann M. Oxygen(es) and the hypoxia – induced factor［J ］ .Bioll Chem,1997 ,378(7) :609 - 16.
［3］张爱群，孙富国，曾博文 等 MMP-13在卵巢子宫内膜异位症中的表达及临床意义［J］ 中国现代医学杂志 2010 21 (1) 61-3.
［4］丰有吉,沈铿主编.妇产科学.第1版.北京:人民卫生出版社,2005.21-23
［5］Harris SE, Leese HJ, Gosden RG, et al. Pyruvate and oxygen consumption throughout the growth and development of murine oocytes ［J］. Mol Reprod Dev. 2009 Mar;76(3):231-8.
［6］Wang GL , Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1 ［J ］ . J Biol Chem , 1995 , 270 :1230- 37.
［7］Sutton-McDowall ML, Mitchell M, Cetica P, et al. Glucosamine supplementation during in vitro maturation inhibits subsequent embryo development: possible role of the hexosamine pathway as a regulator of developmental competence ［J］. Biol Reprod. 2006 May;74(5):881-8.
［8］Van Blerkom J, Antczak M, Schrader R. The developmental potential of the human oocyte is related to the dissolved oxygen content of follicular fluid: association with vascular endothelial growth factor levels and perifollicular blood flow characteristics ［J］. Hum Reprod. 1997 May;12(5):1047-55.
［9］Semenza GL, Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation［J］. Mol Cell Biol, 1992, 12 （12 ）： 5447-54.
［10］Alam H, Weck J, Maizels E, et al. Role of the Phosphatidylinositol-3-Kinase and Extracellular Regulated Kinase Pathways in the Induction of Hypoxia-Inducible Factor (HIF)-1 Activity and the HIF-1 Target Vascular Endothelial Growth Factor in Ovarian Granulosa Cells in Response to Follicle-Stimulating Hormone ［J］. Endocrinology. 2009 Feb;150(2):915-28.
α1抗胰蛋白酶 篇3
In the following study,in order to study the functional activities of Fab Abs and discuss their application foreground in immunotherapy,the specific antiTNF-αFab Abs were screened from a‘na觙ve’human Fab antibody phage display library and expressed in their soluble form.The products were examined in greater details and found to have high antigenic specificity and combining activities with specific antigens(Ags).
1 Materials and methods
1.1 Materials
A‘na觙ve’human Fab fragment phage display library was constructed by Ph.D MA Xiao-bing[3].Phage complexity is 6.6×106.The pComb3 vector was provided by Dr.Carlos Barbas(Scripps Research Institute,La Jolla,CA).Restriction enzymes Spe I,Nhe I,Xho I,Xba I and T4-DNA ligase were purchased from TaKaRa.Pure midi plasmid kit and gel midi plasmid purification kit were the products of Tiangen Biotech.HRP-conjugated goat anti-human Fab IgG and Isopropylβ-D-thiogalacto-pyranoside(IPTG)were purchased from Sigma.Polyvinylidene difluoride(PVDF)membranes and ECL detection kit were the products of Amersham.
1.2 Methods
1.2.1 Phage biopanning
A high-binding microtiter plate was coated with 50μL TNF-αprotein(50μg/mL,diluted by pH 9.5,0.05 M bicarbonate buffer)overnight at 4℃.After blocking the plate with 3%bovine serum albumin(BSA),1.0×1012phages(50μL of diluted original antibody library)were added.After2 hours of incubation at 37℃,the non-binding phages were discarded and the plate was extensively washed with PBST buffer once to remove the non-specific binders.The bound phages were eluted with 50μL buffer of 0.1 M HCl-Glycine,pH 2.2,containing0.1%BSA,and the eluate was immediately neutralized with 2 M Tris(pH 9.0)buffer.The eluate was added to E.coli XL-1 blue cells(OD600≈1)and cultured at 37℃shaking for 6、8 hours.Then the amplified phages were added for the next round of panning.Four rounds of panning were carried out.For the purpose of obtaining high-affinity phage Abs displayed against TNF-α,the washing time was lengthened from once to ten times.The determination of phage titer was carried out after each elution[4].
1.2.2 Construction of soluble Fab expressedvector
Following phage biopanning,phage clones af-ter four rounds panning were amplified by infection of E.coli XL-1 blue cells.Phage-infected cells were cultured at 37℃overnight in super broth(SB)containing 50μg/mL Ampicillin(Amp)and 10μg/mLTetracycline(Tet).pComb3 DNA containing heavy and light chain DNA antibody segments was purified using the pure midi plasmid kit(Figure 1).
To excise geneⅢ,phagemid DNA was digested with Spe I/Nhe I.After gel purification using gel midi purification kit,fragments containing the heavy and light chains were self-ligated at 16℃overnight using T4-DNA ligase.The ligated DNA was transformed to E.coli BL21(DE3)pLysS cells.Single colonies on the Luria Broth(LB)agar plates containing 50μg/mL Amp and 35μg/mL Chloromycetin(Chl)were selected and confirmed by restriction enzyme digestion with Xho I/Xba I.
1.2.3 Preparation of soluble Fab Abs
The positive clones without geneⅢfragments were incubated at 37°C overnight in 5 mL SB containing 50μg/mL Amp and 35μg/mL Chl.Then 200μL cell mixture was incubated in 20 mL SB containing Amp and Chl at 37℃until OD600of 0.5 was achieved.IPTG was added to 1 mM for inducing the expression of soluble Fab Abs at 30℃overnight.
The cell pellet was collected by centrifugation at12 000 rpm for 3 minutes at 4℃and suspended in PBS.The cells were splitted by freeze-thawing.Cell debris was removed by centrifugation at 13 000 rpm for 5 min at 4℃.The supernatant containing Fab Abs was collected and stored at 4℃.
1.2.4 Protein SDS-PAGE and Western blotanalysis
Protein samples containing Fab Abs wereelectrophoresed on a SDS-polyamylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)(10%separation/5%stacking)under non-inducing conditions.The control units were the products expressed by empty pComb3(without heavy and light chain gene segments)induced by IPTG.
Part of the protein samples were stained by Coomassie brilliant blue for 3 hours and protein bands were identified after decolorization.Other protein samples were transferred to polyvinylidene difluoride membrane.After blocking with 2%protein powder in PBST at 4℃overnight,the membrane was washed in PBST buffer,incubated with HRP-conjugated goat anti-human Fab IgG(diluted 1∶10 000)for 1 hour at37℃.Finally,the membrane were washed four times in PBST and developed using the ECL detection kit.1.2.5 ELISA analysis The microtiter plates were coated at 4℃overnight with TNF-αprotein and BSA(50μg/mL,diluted by p H 9.5,0.05 M buffer bicarbonate),respectively.After being blocked with 3%BSA,series of protein samples containing Fab Abs were added to the plate and incubated at 37℃for 2hours.The plate was washed 6 times with PBST,then the samples were added with HRP-conjugated goat anti-human Fab IgG(diluted 1∶40 000)and incubated at 37℃for 1 hour.The plate was washed with PBST for 6 times,then TMB substrate buffer was added into the wells.The absorbance was determined at 450 nm by all automated ELISA reader.
2 Results
2.1 Phage enrichment of biopanning
A repeated selection of phages from the combinatorial Fab library resulted in an enrichment of phages that bound to TNF-αprotein.Greater than289-fold enrichment for TNF-α-specific phage was achieved.The enrichment effects of affinity adsorbent screening are shown in Table.It indicates phages dis-playing Abs that can bind with TNF-αprotein were efficiently enriched.
2.2 Production of soluble anti-TNF-αFab Abs
Bacterial colonies producing anti-TNF-αAbs were used to express soluble anti-TNF-αFab molecules.pComb3 DNA containing heavy and light chain DNA antibody segments was digested with restriction endonucleases Nhe I/Spe I to remove the geneⅢphage coat protein sequence(684 bp).The 4700 bp DNA was purified and self-ligated to create new phagemids which were transformed into E.coli BL21(DE3)pLysS cells.The phagemids which showed 3 000 bp and 1 600 bp DNA segments after being digested with Xho I/Xba I were the positive ones that encoded separated heavy and light chain polypeptide chains assembled in the periplasmic space to form disulfide-bridged Fab molecules(Figure 2).Bacterial cultures were induced with IPTG.The assembled Fab molecules from the bacterial periplasmic space were released by freeze-thawing.
M:DNA marker,1:pComb3 containing Fd and L chain,2:p Comb3containing Fd and L chain digested with SpeⅠ/NheⅠ,3:p Comb3 containing Fd and L chain lacking gⅢgene,4:Soluble Fab phagemid,5:Soluble Fab phagemid digested with XbaⅠ/Xho.
2.3 SDS-PAGE and Western blot
The production yielded 47 kD bands on Coomassie-stained unreduced SDS-polyacrylamide gels(Figure 3).
M:Protein maker,1-2:The products expressed by empty p Comb3 induced by IPTG,3-4:The products expressed by soluble expression phagemid induced by IPTG.
Western blot under non-inducing conditions applied by the system of HRP-conjugated goat anti-human Fab IgG further identified the expression of Fab Abs.There was no obvious color development in the control units(the products expressed by empty pComb3 induced by IPTG)(Figure 4).
1-2:The products expressed by empty pComb3,3-4:The products expressed by soluble expression phagemid.
2.4 ELISA
The Fab supernatants prepared from 2 clones(TA-04,TA-13)of positive E.coli BL21(DE3)pLysS cells with p Comb3 lacking the geneⅢsequence showed the significant binding activity with TNF-αproteins by ELISA analysis.There were no cross-reactions with the control units containing BSA(Figure5).
3 Discussion
Phage antibody library technology creates a new age of genetic engineering antibody.We could prepare various human Abs using this technology without immunity.Comparing with traditional hybridoma technology,phage antibody library technology possesses many advantages such as short-time,large-capability of panning and has bright foreground[5].
In this study,combinatorial Fab Abs against TNF-αwere screened out from a‘na觙ve’human Fab antibody phage display library(phage complexity is6.6×106).Though the washing time was increased from1 time to 10 times,the recovery rate of phage increased by degrees.Our study showed that the phage Fab libraries were enriched about 289-fold after 4rounds of panning.It suggested that the TNF-αAgs had selected the phages in the libraries displaying Fab.We constructed soluble expressed vector and expressed Fab Abs in E coli.BL21(DE3)pLysS cells.SDS-PAGE showed the expression of about 47 kD protein in the supernatants of split products which was consistent with interested protein.Western blot analysis further showed that there was the expression of Fab Abs.ELISA analysis showed that the phage displaying Fab Abs from 2 clones(TA-04,TA-13)had the significant binding activity with the TNF-αAgs and had no cross-reaction with BSA.
We could screen out specific phage Abs against exterior Ags from a‘na觙ve’human phage antibody library.We also could screen out a lot of specific phage Abs against self Ags.The objective of this study was to prepare tumor-specific Abs using phage antibody library technique,then to use these Abs to“fish”specific Ags such as glycoprotein 96 from tumor organization or cells for immunotherapy[6,7].In this study,the preparation and identification of specific Fab antibody against TNF-αhas laid a foundation for subsequent work.We will continue to proceed purification and further characterization in order to gain ideal specific Fab Abs for subsequent experiments[8].
参考文献
[1] PINI A, BRACCI L. Phage display of antibody fragments[J]. Curr Protein Pept Sci, 2000, 1(2): 155-169.
[2] WILLATS WG. Phage display: practicalities and prospects[J]. Plant Mol Biol, 2002, 50(6): 837-854.
[3] MA XB, CHANG JW, WANG HT, et al. Construction of a ‘nave’ human Fab antibody phage display library [J]. Shandong Medical Journal, 2005, 45(35): 12-14.
[4] WANG L, QIAO YY, WANG G, et al. Screening of human scFv a- gainst IL-8 from phage antibody library [J]. Chin J Cell Mol Im- munol, 2005, 21(2): 185-187.
[5] BRISSETTE R, PRENDERGAST JK, GOLDSTEIN NI. Identification of cancer targets and therapeutics using phage display[J]. Curr Opin Drug Discov Devel, 2006, 9(3): 363-369.
[6] ARNOLD-SCHILD D, KLEIST C, WELSCHOF M, et al. One-step single-chain Fv recombinant antibody-based purification of gp96 for vaccine development[J]. Cancer Res, 2000, 60(15): 4175-4178.
[7] LI J, PEREIRA S, VAN BELLE P, et al. Isolation of the melanoma- associated antigen p23 using antibody phage display[J]. J Immunol, 2001, 166: 432-438.
α1抗胰蛋白酶 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
糖尿病组:选取本院2010年2月~2012年12月接受治疗的糖尿病患者108例,其中男71例,女37例,年龄28~82(53.22±7.78)岁,体重58~80(70.1±6.9)kg,接受治疗的时间为6个月~20年。符合WHO的糖尿病诊断标准、1997年美国的糖尿病协会确定的诊断标准及1992年的全国肾脏病的诊断标准。对照组:选取本院接受体检的健康者60例,男31例,女29例,年龄26~80(52.31±8.52)岁,体重55~78(68.7±7.2)kg。所有选取的对象都没有高血压、原发性肾病、心功能不全及泌尿系感染等一系列疾病。
1.2 方法
将空腹8h以上得到的晨尿送检,之前要进行3000转/min的离心运动10min,运用的是离心半径8cm的离心泵。利用速率免疫散射比浊法对108例不同程度的糖尿病患者及60例健康对照者的尿蛋白定性、尿α1￣微球蛋白(α1-MG)、尿微量白蛋白(MA)和尿转铁蛋白(TRF)的含量行检测。检测的仪器是Beckman Immage,试剂为Beckman。一切检测操作都严格按照说明书进行,均在室温环境下2h内完成[2]。
1.3 统计学处理
数据采用SPSS 12.0软件,用t检验来进行组间的比较,用±s表示计量资料。P<0.05表示差异显著。
2 结果
人体正常的TRF含量是0~2.0mg/L,α1-MG含量是0~12.5mg/L,MA含量是0~30mg/L。该研究的结果显示,对照组的TRF含量为1.12±0.44mg/L,α1￣MG含量为5.02±1.12mg/L,MA含量为13.32±2.70mg/L;糖尿病组的TRF含量为4.87±1.61mg/L,α1-MG含量为34.54±5.47mg/L,MA含量为146.17±64.96mg/L。见附表。
由数据的对比附表可以看出,糖尿病组的TRF、α1-MG、MA的测定结果明显高于健康对照组(P<0.01)。糖尿病病人的TRF、MA和α1-MG的情况异常:α1-MG升高的有者50例(占41.51%),MA升高的有者45例(39.62%),TRF升高的有者39例(35.85%)。
3 讨论
肾小球有电荷屏障与分子屏障的存在,所以在正常情况下只能通过小分子蛋白。该研究结果表明了糖尿病的尿液中MA、TRF、α1-MG的含量明显高于对照组,可以认为尿MA、TRF、α1-M含量的检测在糖尿病肾损伤早期的诊断中有重要的实用价值。
在糖尿病病人的尿液中检测到MA含量升高,则表示肾损伤的程度已经到了“早期糖尿病肾病期”,此时治疗病人能够延缓与阻止病情的发展。而且因为MA含量的检测结果准确,灵敏度高,操作简单,方便,在临床诊断中得到了广泛的应用[3]。
该研究的结果表明,糖尿病组尿液α1-MG的含量要明显比对照组高,所以可以认为α1-MG能够成为肾小管的重吸收功能是否受损的一个标志,在糖尿病肾损伤早期的诊断中有重要的实用价值。
综上所述,通过对糖尿病患者的尿TRF、MA和α1-MG含量进行检测,TRF的敏感性最低,α1-MG的敏感性最高,正因为此,在检测时易发生漏诊、误诊的现象,联合检测尿α1-微球蛋白和尿微量白蛋白和尿转铁蛋白有助于了解糖尿病病人早期肾损伤的情况,更有利于糖尿病肾病的早期诊断,对临床的治疗有重要意义。
参考文献
[1]赖凌云,林善锬.糖尿病肾病的诊断[J].中华全科医师杂志,2004,3(1):10-11.
[2]黄景西,陈万坤.尿微量白蛋白检测对糖尿病肾病早期诊断的意义[J].健康大视野,2012,20(9):441.
α1抗胰蛋白酶 篇5
1 资料与方法
1.1研究对象
我院2012 年3 月27 日至2013 年9 月24 日首诊的61 例患者,满足以下条件:1肺内单发结节,结节直径>2 cm;2无碘对比剂禁忌证;3周围血管弹性好;4患者知情同意并能配合检查;5灌注前及手术前未行任何抗肿瘤治疗;6病灶无明显钙化或脂肪组织;7灌注成功,图像满意。
61 例患者术后均取得了完整的病理结果,证实40 例为肺癌;由于部分患者的病理靠活检取材,标本较小,未能进行下一步的切片及免疫组织化学研究,最终纳入27 例患者行免疫组织化学研究。
1.2 仪器与方法
1.2.1 CT全瘤灌注仪器及扫描参数:本实验采用西门子128 排多层螺旋CT(MSCT)进行低剂量肺肿瘤灌注扫描模式,首先定位平扫,找到病灶位置,确定扫描范围(确定病灶位置后,将扫描框包齐整个病灶)。使用西门子4D-Spiral扫描方案作摇篮式灌注扫描,参数为:80 k V,60 m As,96 mm覆盖方位,1.5s旋转时间,共扫描30 次,总共45 s,延时时间2 s。重建方案:B20 重建核,FOV 380 mm,1.5 mm层厚,1 mm层间距。所有数据传输到工作站,并使用西门子工作站动态体部容积CT灌注软件进行后处理,得出血流量(BF)、血容积(BV)、平均通过时间(MTT)、透析度(PMB)4 个灌注参数值及不同灌注参数的伪彩图像。
1.2.2 MMP-9 及HIF-1α 免疫组织化学检测主要仪器及试剂(保存条件):切片机、50 ℃摊片仪、57 ℃的烘干箱、37 ℃电热恒温培养箱、37 ℃电热恒温水温箱、高压锅、微波炉、电磁炉、通风柜、塑料染色架、染色缸;Gill改良苏木精染液(室温)、1%盐酸-乙醇分化液(室温)、饱和碳酸锂促蓝液(室温)、TO脱蜡液(室温)、乙醇(室温)、原修复液(4 ℃冰箱)、蒸馏水(室温)、兔抗人MMP-9 单克隆抗体(4 ℃冰箱)、兔抗人HIF-1α 单克隆抗体(4 ℃冰箱)。对27 例患者标本进行切片(厚度为3 μm)、脱蜡、修复、蒸馏水洗、3%双氧水、蒸馏水洗及画圈、PBSX3 冲洗、加一抗、PBSX3 冲洗、加二抗、PBSX3 冲洗、二氨基联苯胺(DAB)显色、复染、自来水冲洗、脱水、烘干后封片、染色结果(阳性部位:细胞质呈棕色)。染色结果由2 名病理科主治医生评定,遇到分歧时由1 名主任医师参与评定;显微镜下观察MMP-9 及HIF-1α免疫组织化学信号为棕褐色颗粒,前者的阳性部位为细胞质,后者为细胞核。染色结果分别在100 倍镜和200 倍镜下观看。染色的级别依据肿瘤血管染色强度及其染色阳性细胞百分率进行评定:1染色强度:未着色或浅黄色为0,棕黄色或棕褐色为1。2阳性细胞百分率:阳性细胞<10%为0,阳性细胞10%~30%者为1,阳性细胞30%~60%为2,>60%为3。1+2之和为0 或1 为阴性(-),2 为弱阳性(+),3为中度阳性(++),4 为强阳性(+++)。
1.3 统计学处理
使用SPSS 22.0 进行统计学分析。计量资料用±s表示;对肺癌4 个灌注参数与MMP-9、HIF-1α的相关性,采用Spearman等级相关资料进行分析,以P<0.05 差异有统计学意义;当两者相关有统计学意义时,做误差条图呈现数据来自的总体情况。
2 结果
2.1 一般资料:27 例肺癌患者中,男性22 例,女性5 例,年龄39~75 岁,平均(59±10)岁,中位年龄59岁;6 例为中央型肺癌,21 例为周围型肺癌。病理分型中,15 例腺癌、9 例鳞癌、2 例小细胞肺癌、1 例肺淋巴瘤样上皮癌。
2.2 肺癌CT全瘤灌注参数值:BF平均值为(69±31)ml/(100 ml·min),BV平均值为(8±3)ml/100 ml,MTT平均值为(8.6±2.0)s,PMB平均值为(15±6)ml/(100 ml·min)。
2.3 MMP-9 及HIF-1α 表达情况:27 例肺癌患者,MMP-9:阴性(-)4 例,占15%;弱阳性(+)15 例,占56% ;中度阳性(++)8 例,占30% ;强阳性(+++)0例;总阳性率85%。HIF-1α:阴性(-)10 例,占37%;弱阳性(+)12 例,占44%;中度阳性(++)5 例,占19%;强阳性(+++)0 例;总阳性率63%。
2.4 肺癌CT全瘤灌注参数与MMP-9 及HIF-1α 相关性:1BF、BV、PMB、MTT与MMP-9的P值分别为0.044、0.001、0.000、0.143,前三者均<0.05,差异有统计学意义,且相关系数分别为0.391、0.611、0.700;而MTT与MMP-9的相关P值>0.05,差异无统计学意义(见表1);BF、BV、PMB分别与MMP-9的的误差分析图显示3个CT全瘤灌注参数与MMP-9的表达均呈正相关趋势,且MMP-9的阳性表达以弱阳性或中阳性为主。2BF、BV、MTT、PMB与HIF-1ɑ的P值分别为0.017、0.067、0.528、0.285,仅BF与HIF-1ɑ的P值小于0.05,差异有统计学意义,相关系数为0.454,误差分析图显示HIF-1ɑ的表达以弱阳性为主。
［a：BF 参数伪彩图,其值为52.92 ml/(100 ml·min);b:BV参数伪彩图,其值为5.69 ml/100 ml;c:MTT参数伪彩图,其值为7.36 s;d:PMB参数伪彩图,其值为9.22 ml/(100 ml·min)]
3 讨论
3.1 MMP-9 与肿瘤血管:MMP-9 属于基质金属蛋白酶家族(MMPs),相对分子质量92 000,是该家族中相对分子质量最大的酶,也是目前对该家族研究最多的,能参与人体多种生理病理过程［5-7］。Thomas等［8］报道非小细胞肺癌组织中MMP-9 的阳性表达明显高于正常组织和良性肺病组织,差异具有统计学意义,而正常组织和良性肺病组织之间差异无统计学意义,提示MMP-9 可作为肺癌诊断的一个生物学指标;并且还发现MMP-9 的表达与非小细胞癌的临床分期、病理分级以及有无淋巴结转移有关。
肿瘤灶的新生血管形成最基本步骤是癌细胞对细胞外基质和血管基底膜的降解和破坏。而MMP-9是降解细胞外基质最重要的酶,参与肿瘤血管内皮细胞通透性的调节以及血管内皮屏障破坏,并最终导致血管通透性升高［9］。肿瘤血管的这种改变恰好为CT肺灌注扫描提供了理论基础。
3.2 HIF-1α 与肿瘤血管:缺氧是实体肿瘤微环境特征之一,与肿瘤发展、浸润、转移等恶性生物学行为密切相关,对肿瘤的化疗及放疗失败起了很大的影响［10］。研究认为HIF在肿瘤细胞缺氧适应性反应和耐受放射线损伤中起到关键作用,能够影响肿瘤细胞的糖代谢、有丝分裂、凋亡和肿瘤组织血管生成［11］。HIF-1 是由HIF-1α 及HIF-1β 亚单位构成的异二聚体,且HIF-1α 对缺氧更具有敏感性,可通过检测HIF-1α 的表达间接反映组织缺氧状况。肿瘤的快速增长过程中,形成局部缺氧及低糖的微环境是其增长过程中的普遍现象,在缺氧这种状态下,HIF-1α 能通过诱导糖酵解相关酶的表达,使糖酵解活动增加,从一定程度改善肿瘤缺氧造成供能和耗能之间的失衡状态。
在大多数人类正常组织中检测不到HIF-1α 的表达,而在许多肿瘤组织中可检测到HIF-1α 的高表达。Zhong等［12］认为肿瘤生长过程中因其不断生长、体积增大,进而血供不足,诱导HIF-1α 的表达,进而诱导多种参与肿瘤细胞恶性转化的基因和蛋白的表达,并且促进肿瘤组织的血管生成,有利于肿瘤的侵袭和转移。有学者研究发现缺氧肺癌细胞中HIF-1α 的表达水平与肺癌肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期和患者预后的关系非常密切［13］。
3.3 CT灌注成像参数与MMP-9 表达的相关性:MMP-9 对肿瘤血管的影响主要是参与肿瘤血管内皮细胞通透性的调节以及血管内皮屏障破坏,并最终导致血管通透性升高。而CT肺灌注恰好就是反映肿瘤血管的微环境,灌注参数PMB所反映的又是血管的透析度。我们的研究显示27 例肺癌患者,MMP-9 的表达阳性率达85%,但以弱阳性表达为主,PMB与MMP-9 呈正相关(r=0.700,P=0.00)。这就说明,PMB值能很好地间接反映MMP-9 的表达。
虽然MMP-9 的表达与PMB值有显著的相关性,但我们发现这种表达是以弱阳性表达为主,没有强阳性的表达。我们推测其中的可能有以下原因:一是MMP-9 在肺癌中的表达量不多,但是这些不多的量却已经能够改变肿瘤血管的通透性并反映在PMB的改变上,但由于样本量和时间的原因,我们未能对不同分期的肿瘤的MMP-9 表达进行分组比较,也未对PMB值进行肿瘤与阴性组进行比较,所以尚不能做出定论,有待于进一步研究;另外由于我们所做的是EnvisionTM二步法免疫组织化学半定量分析,取得的结果受观察者的主观因素影响,如能定量分析,那所获取的数据可能会更准确,更能反映两者之间的关系。
MMP-9 作为血管生成因子,它的高表达有可能导致肿瘤血管生成增多,结果就有可能被BF、BV的升高所反映。通过对数据的分析我们发现,BV与BF均与MPP-9 具有相关性,之间的相关系数分别为0.611、0.391,呈正相关。与BF相比,BV与MMP-9的表达表现出更高的相关程度。BV反映的是病灶的血容量,与血管的管径、数量以及是否开放有关;而BF值反映的是血液在肿瘤内流动的速率,它与组织内的血管数量直接相关。那么之间存在这样一种关系,即MMP-9 在促进肺肿瘤血管增多的改变方面,更多的可能是影响它的开放,这也就与之前所提到的影响了肿瘤血管的通透性,导致血管之间形成交通相符。
3.4 CT灌注成像参数与HIF-1α 表达的相关性:我们对27 例肺癌患者进行免疫组织化学检测,发现HIF-1α 的阳性表达率为63%,有10 例(占37%)表达为阴性,在剩余17 例阳性表达中,以弱阳性表达为主(12 例),没有强阳性的表达。通过对CT灌注参数值与HIF-1α 的表达量作Spearman相关分析,我们发现4 个灌注参数中,仅BF与HIF-1α 存在相关,且为正相关,相关系数为0.454,其余灌注值均不存在相关。CT肺肿瘤灌注参数中,BF反映的是血液在肿瘤或器官内流动的速率,它与组织内的血管数量直接相关,尤其是小血管的数量为著。这也就提示HIF-1α 对肿瘤血管的调节改变,可能主要是促进新生血管数量的增加为主,而对肿瘤血管的通透性等改变不明显。
本实验研究主要利用CT全瘤灌注这一较为前沿的影像技术,并通过对MMP-9 及HIF-1α 较为简单的免疫组织化学半定量分析方法,将两者所得的数据进行相关,获得了利用CT这一无创、简单的影像工具反映了肿瘤分子层面的信息。此研究结果可为临床肺癌诊断和分子靶向治疗以及预后评估提供一定的辅助信息。
摘要：目的 探讨肺肿瘤CT全瘤灌注参数与肿瘤血管生成因子基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达量的相关性,为肺癌的诊疗提供更多的帮助。方法 对61例肺内单发≥2 cm的肿块性病变进行前瞻性CT全瘤灌注成像(CTPI),经后处理得出血流量(BF)、血容积(BV)、平均通过时间(MTT)、透析度(PMB)4个灌注参数;对手术或活检病理证实为肺癌的27例病灶进行免疫组织化学分析,对MMP-9及HIF-1α的表达进行半定量分析,并分别与CT灌注参数进行相关研究。统计学方法采用Spearman等级相关分析法。结果 27例肺癌BF平均值为(69±31)ml/(100 ml·min),BV平均值为(8±3)ml/(100 ml),MTT平均值为(8.6±2.0)s,PMB平均值为(15±6)ml/(100 ml·min)。MMP-9:阴性(-)4例,占15%;弱阳性(+)15例,占56%;中度阳性(++)8例,占30%;强阳性(+++)0例;总阳性率85%。HIF-1α:阴性(-)10例,占37%;弱阳性(+)12例,占44%;中度阳性(++)5例,占18%;强阳性(+++)0例;总阳性率63%。病灶BF、BV、PMB与MMP-9有相关性,呈正相关(r值分别0.391、0.611、0.700,P值均<0.05),MTT与MMP-9差异无统计学意义(r值为0.290,P值>0.05);BF与HIF-1α差异有统计学意义(r=0.454,P值<0.05),BV、MTT、PMB与HIF-1α差异无统计学意义(r值分别0.067、0.528、0.285,P值均>0.05)。结论 CT全瘤灌注参数与MMP-9、HIF-1α表达有一定相关性,可为临床对肺癌的个体化治疗提供一定的辅助信息。
α1抗胰蛋白酶 篇6
1 资料与方法
1.1一般资料
收集潍坊市人民医院2013年8月~2014年6月经手术切除并病理确诊的原发性NSCLC患者55例, 术前未行放化疗。 本研究入选患者均知情同意并签署知情同意书,且经医院伦理委员会通过。 NSCLC组男32例,女23例;年龄35~76岁,平均(58.82±8.21)岁; 组织学类型:鳞癌19例,腺癌36例 ;分化程度:高23例,中23例,低9例;淋巴结转移:有转移27例,无转移28例;依据1997年国际抗癌联盟(UICC)修订的标准进行TNM分期:Ⅰ期16例,Ⅱ期13例,Ⅲ期20例,Ⅳ期6例。 取肺良性病变组织20例作为对照组,其中炎性病变11例,肺大疱5例,肺结核4例。
1.2 主要试剂
兔抗人HIF-1α 单抗、兔抗人Glut1多抗、鼠抗PCNA单抗、SP试剂盒 、PBS、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术公司。
1.3 方法
采用免疫组化SP法,高压微波行抗原修复,其他步骤严格按照试剂盒说明进行。 阴性对照采用PBS代替一抗,阳性对照采用已知阳性癌组织。
1.4 疗效判定标准
HIF-1α 以胞浆或胞核呈棕黄色为阳性, 阳性判读标准参考Zhong等[3]报道:在400倍镜下随 机取5个视野,每个视野计数200个细胞,计算每张切片阳性细胞百分率,无阳性细胞为阴性(-),阳性细胞数< 10%为弱阳性 (+),10%~50%为中度阳性 (++),>50% 为强阳性(+++)。Glut1以胞膜呈棕黄至棕褐色颗粒者视为阳性,阳性细胞数<5%为(-),5%~<25%为(+), 25%~50%为(++),>50%为(+++)。 PCNA以胞核呈棕黄色颗粒为阳性,计数阳性细胞百分比作为PCNA标记指数(PCNA labeling index,PCNALI),PCNALI<50% 为低表达,≥50%为高表达。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行数据分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,计数资料采用百分率表示,组间比较采用 χ2检验。 不同指标之间相关性分析选用Pearson等级相关分析,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组 HIF-1α、Glut1 和 PCNA 的表达情况
NSCLC组及对照组HIF-1α 阳性表达率分别为76.36%(42/55)、15.00%(3/20),两组比较差异有高度统计学 意义 (P < 0.01);Glut1阳性表达 率分别为85.45%(47/55)、25.00%(5/20), 差异有高度统计学意义 (P < 0.01)。 PCNA在NSCLC组中的表 达指数 [(75.00±21.99)%] 明显高于对照组 [(26.75±10.55)% ] (P < 0.01)。 见图1~3(封三)。
2.2 HIF-1α、Glut1 和 PCNA 的表达与 NSCLC 临床病理特征的关系
HIF-1α 表达与TNM分期 、淋巴结转移相关 ( 均P < 0.05)。 Glut1表达与病理类型 、TNM分期、淋巴结转移有关(均P < 0.05)。 PCNA的表达与有无淋巴结转移相关(P < 0.05),而与其他因素无关。 见表1。
注:与鳞癌比较,*P < 0.05;与无淋巴结转移比较 ,#P < 0.05;与 TNM 分期Ⅰ+Ⅱ比较,△P < 0.05;n 代表阳性数;HIF-1α:缺氧诱导因子 1α;Glut1:葡萄糖转运蛋白 1;PCNALI:增殖细胞核抗原标记指数
2.3 HIF-1α、Glut1 与 PCNA 三者表达相关性
经Pearson等级相关分析,NSCLC组织中HIF-1α 与Glut1表达呈正相关 (r = 0.598,P < 0.01)(表2)。 HIF-1α、Glut1的表达与PCNA均呈正相关(r = 0.514, P < 0.01;r = 0.608,P < 0.01)(表3)。
注:HIF-1α:缺氧诱导因子 1α;Glut1:葡萄糖转运蛋白 1
注:PCNA:增殖细胞核抗原:HIF-1α:缺氧诱导因子 1α:Glut1:葡萄 糖转运蛋白 1
3 讨论
在实体肿瘤发生发展过程中,局部缺氧及糖缺乏是普遍现象。 HIF-1是氧平衡调节因子,HIF-1由 α和 β 两个亚基组成,其中HIF-1α 是活性亚基,是细胞内一类介导缺氧反应适应性的转录因子,是决定HIF-1活性的关键部分[4]。 大多数癌症及其癌前病变时,细胞内产生大量的HIF-1α。缺氧条件下,活化的HIF-1与下游靶基因Glut1、VEGF相结合,并激活诱导这些靶基因转录表达, 促进葡萄糖转运代谢及血管生成,使肿瘤适应缺氧环境而促进肿瘤增殖、浸润和转移等[5]。 本实验结果显示,NSCLC组织中HIF-1α 表达明显高于肺良性病变组织,有淋巴结转移者阳性表达率高于无转移者,与TNM临床分期亦有关,分期相对晚则阳性表达强,推断HIF-1α 的过表达在肿瘤快速增殖和侵袭转移中发挥重要作用。
Gluts是分布于细胞膜的跨膜葡萄糖转运蛋白 , 主要介导葡萄糖的转运和摄取,Glut家族确认共有13个成员 ,其中研究最多的是分布广泛的Glut1。 早有研究应用免疫组化技术在人类正常上皮和良性肿瘤组织中未检测到Glut1蛋白, 而在恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌等Glut1却高表达,说明Glut1可作为恶性肿瘤的诊断指标[6,7]。 而对肾癌及胰腺癌的一些研究也显示Glut1与肿瘤的临床分期、 淋巴结转移有关,可作为判断预后的参考指标[8,9]。 本研究发现Glut1在NSCLC组的表达水平明显高于对照组 ,鳞癌Glut1的阳性表达明显高于腺癌(100.0%比77.8%),且在肿瘤癌巢中央染色较深, 推测可能与鳞癌多呈巢状生长, 病灶中央血供差继发葡萄糖转运增多以供给能量满足其恶性增殖需要有关。 本研究结果与陆国华等[10]报道一致,但其研究结果统计学未表现出差异性,仍需扩大样本验证。 有淋巴结转移组Glut1表达高于无转移组,中晚期的表达高于早期者,这与Noguchi等[11]实验结果相符。 Glut1的过表达可为肿瘤细胞的增殖、分化及转移提供能量支持,从而与肿瘤的侵袭性生长遥相呼应,提示Glut1可能是肿瘤早期诊断和恶化进展的重要指标。本研究中HIF-1α 和Glut1两者表达呈显著相关,47例Glut1阳性者有39例同时表达HIF-1α, 且在TNM分期和淋巴结转移上共同表现出差异性, 提示两者在肿瘤的发生发展过程有协同作用。
PCNA是仅存在于增殖期细胞中特异性表达的细胞核蛋白。 目前,PCNA已成为检测肿瘤细胞增殖程度的有效指标,并评估肿瘤生物学行为[12]。 周建美等[13]研究显示,NSCLC中PCNA表达与淋巴结转移及肿瘤大小有关,并成为影响患者预后的因素。 本研究检测NSCLC组及对照组PCNA的表达指数显示,肺癌组PCNA表达明显高于对照组,且有淋巴结转移组表达高于无转移组,差异有统计学意义。 陈涛等[14]通过研究NSCLC中PCNA、Glut1表达与FDG摄取的关系表明,Glut1表达与SUV值及PCNA表达之间呈正相关,且PCNA高表达的区域与Glut1高表达的区域一致。 本研究实验中,HIF-1α 及Glut1与PCNA之间均存在正相关, 说明HIF-1α 及Glut1蛋白表达增高与肺癌细胞的增殖活性有关。 可能是组织增殖旺盛并缺氧情况下,HIF-1α 上调一些癌基因和生长因子(表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、-2等)的活性表达,促进肿瘤形成新生血管,Glut1则通过增高糖代谢及转运提供细胞能量需要,其促进肿瘤增殖的机制尚待进一步研究。
总之,HIF-1α、Glut1及PCNA在NSCLC组织中存在高表达,并与其增殖、侵袭调控密切相关。 对三者的联合检测,有望成为评估肿瘤恶性程度及预后的重要指标, 并为NSCLC进行新型靶向治疗提供理论依据。
摘要：目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)与增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及其相关性,并探讨其临床意义。方法 采用免疫组化法检测HIF-1α、Glut1及PCNA在55例NSCLC组织和20例肺良性病变对照组织中表达及与临床病理参数间的关系。结果 NSCLC组和对照组中HIF-1α阳性率分别为76.36%(42/55)、15.00%(3/20),差异有高度统计学意义(P<0.01)。两组Glut1阳性表达率分别为85.45%(47/55)、25.00%(5/20),差异有高度统计学意义(P<0.01)。HIF-1α表达与TNM分期、淋巴结转移有关(均P<0.05);Glut1表达与病理类型、TNM分期、淋巴结转移有关(均P<0.05)。HIF-1α与Glut1表达呈正相关(r=0.598,P<0.01)。PCNA在NSCLC组中的表达[(75.00±21.99)%]明显高于对照组[(26.75±10.55)%](P<0.01)。HIF-1α、Glut1的表达与PCNA均呈正相关(r=0.514,P<0.01;r=0.608,P<0.01)。结论 NSCLC中HIF-1α、Glut1及PCNA过表达与NSCLC发生发展关系密切,联合检测三者有助于判断NSCLC临床分期及评估预后。
α1抗胰蛋白酶 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2008年1月-2009年1月在我院住院的58例窒息新生儿为研究对象。其中宫内窘迫12例,产时窒息38例,同时有宫内及产时窒息8例。58例新生儿出生后1min Apgar评分≤3分者26例为重度窒息组;Apgar评分4~7分者32例为轻度窒息组。同期选择30例健康足月新生儿作为健康对照组。3组患儿的胎龄、日龄、性别、体质量差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 检测方法与试剂
窒息组患儿及健康对照组新生儿在生后3d内留取外周静脉血3ml,检测其血清BUN、Scr水平,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测尿中的α1-MG浓度,并与BUN、Scr水平进行对比。Cr检测采用酶法,BUN检测采用谷氨酸脱氢酶法,试剂均由德赛诊断系统(上海)有限公司提供。操作步骤严格按说明书由专人进行实验操作。
1.3 统计学方法
用SPSS 10.0软件进行数据处理,计量资料用表示,组间比较采用F检验,计数资料以率(%)表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同程度窒息新生儿尿α1-MG、血清BUN、Scr水平的变化情况
重度窒息组和轻度窒息组的BUN、Scr和尿α1-MG水平高于健康对照组,且重度窒息组BUN、Cr和尿α1-MG水平显著高于轻度窒息组,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。
注:与健康对照组比较,*P<0.01;与较度窒息组比较,#P<0.01
2.2 轻度窒息组与重度窒息组新生儿尿α1-MG、BUN、Scr的异常检出率
轻度窒息组和重度窒息组尿α1-MG异常检出率均显著高于同组血清BUN和Scr异常检出率,差异均有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。见表2。
注:与同组BUN及Scr异常检出率比较,*P<0.05,#P<0.01
3 讨论
新生儿窒息是指婴儿出生后无自主呼吸或呼吸抑制而导致低氧血症和混合型酸中毒,易引起多器官功能损害,是引起新生儿死亡和儿童脑瘫的重要原因之一。新生儿窒息可引起各脏器功能损伤,使血液重新分配,肾血管收缩,肾血流急剧减少,导致肾组织缺氧、缺血、肾功能损伤[2,3]。近端肾小管细胞对缺氧特别敏感,因此缺氧缺血性肾损伤主要发生在近端肾小管细胞,而且多为微小损伤和亚细胞结构的损害,与能量代谢障碍、胞浆内钙离子升高,一氧化氮、氧自由基及细胞间黏附分子等产生过多有关[4]。早期诊断、积极治疗可以防止肾功能衰竭的发生。过去临床上对于新生儿肾功能的判断多依赖尿量减少、血清BUN及Cr升高等,但由于新生儿尿量收集比较困难,采血不方便,临床上往往不易发现新生儿急性肾功能衰竭,特别是非少尿型。血清BUN是最早用来评价肾小球滤过率GFR的物质之一,但只有当肾小球滤过功能下降>1/2时血中BUN浓度才会升高,而且易受肾外因素的影响,其敏感性及准确性均欠佳。Cr作为肾功能主要评判指标已有40余年,但只有当GFR下降到正常的1/3时血清Scr才会升高。Scr本身测量存在多种误差,受年龄、性别、身高、肌肉量及膳食结构等因素影响[4];而且在新生儿中还观察到Cr过低,估计GFR的现象。因而Cr不宜作为新生儿肾损害早期检测的指标。
α1-MG是一种低分子量蛋白(分子量为26 000~36 000),由体内核细胞产生,产生量较稳定,经肾小球滤出,99.9%被肾小管再吸收分解,尿中α1-MG升高提示肾小管功能受损。在正常情况下,尿中α1-MG含量甚微,当肾小管受损时,尿中α1-MG排泌增高。Hong[5]研究亚裔新加坡人2型糖尿病肾病患者的肾小管损害,用α1-MG作为检测指标,能早期发现肾脏损害。Narisawa等[6]研究发现,可以用术前的尿α1-MG与尿Cr的比值来预测体外循环后的肾功能的改变,结果提示随着术前比值的升高,术后需要透析的几率增高。尿α1-MG在成人中研究较多,但在新生儿中少有涉及。
本试验结果显示:与健康对照组相比,窒息组新生儿血清BUN、Scr和尿α1-MG水平均有升高,且重度窒息较轻度窒息组升高更为显著。说明新生儿窒息后肾功能下降,窒息程度越重,肾功能下降越明显。而健康组BUN和Scr与轻度窒息组间差别无统计学意义。说明尿α1-MG在早期肾损害时即有变化,比BUN和Scr更为敏感。在轻度窒息组和重度窒息组尿α1-MG的异常检出率显著高于同组血清BUN和Scr的异常检出率,与既往文献报道[7]相符。
综上所述,尿α1-MG能较早反映肾脏受损时GFR下降,可作为反映新生儿窒息后肾损伤的早期敏感指标之一。
参考文献
[1]Perlman JM,Tack ED,Martin T,et al.Acute systemic organ injury in term infants after asphyxia[J].Am J Dis Child,1989,143(5):617-620.
[2]Akinbi H,Abbasi S,Hilpert PL,et al.Gastrointestinal and renal blood flow velocity profile in neonatal with birth asphyxia[J].J Pediatr,1994,125(4):625-627.
[3]吴捷,魏克伦,黄丽萍,等.新生儿窒息的肾血流动力学改变及影响因素的研究[J].中华围产医学杂志,1998,1(1):42-45.
[4]陈文彬.诊断学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2002:341-342.
[5]Hong CY,Hughes K,Chia KS.Urinary alpha1-microglobulin as amarker of nephropathy in type2diabetic Asian subjects in singapore[J].Diabe-tes Care,2003,26(2):338-342.
[6]Narisawa T,Murakami A,Aiba M.Evaluation of highly damaged renal function following extracorporeal circulation-usefulness ofalpha1-micro-globulin index[J].Japanese Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery,1998,46(11):1097-1104.
α1抗胰蛋白酶 篇8
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
本次研究时间为2014年1月～2015年12月。选取100只雄性健康SD大鼠,4只一笼。依据实验设计要求分为缺灌(缺血再灌注)组、Ado缺灌(Ado预处理)组、假手术组、Ado假手术(Ado预处理)组,共计4组,每组25只。
Ado缺灌组、Ado假手术组在术前3d应用2ml Adc注射液(生产企业:沈阳光大制药有限公司,产品拟号:20100506,1.5mg/kg,1次/d)予以腹腔注射。缺灌组、假手术组应用2ml生理盐水(生产企业:四川科伦药业股份有限公司,产品批号:c14081007-2,1次/d)腹腔注射。
1.2 模型建立
线栓法建立大鼠MCA0 (大脑中动脉栓塞)模型。对大鼠进行注射麻醉处理,使其呈仰卧位并固定于操作台,经颈部正中线纵向切口,对颈部的皮下组织及腺体予钝性分离,暴露右侧CCA (颈总动脉)并穿线备用,依次分离ECA (颈外动脉)、ICA (颈内动脉)、PPA (翼腭动脉)。将甲状腺的上动脉、ECA的分支枕动脉电凝烧断,以血管夹对ICA、CCA临时阻断,ECA近端预留、远端结扎。对PPA结扎后将ECA切断,自断端将线栓插入至ICA,线栓缓慢插入。
1.3 实验试剂
VEGF兔抗鼠多克隆抗体、HIF-1α兔抗鼠多克隆抗体、Tau-5鼠抗单克隆IgG抗体、兔抗p-Tau199/202Ser多克隆IgG抗体、原位杂交tau试剂盒等。由上海酶联生物研究所提供。
1.4 实验仪器与设备
S08A-01冷光源立式手术灯、MCAO线栓、动物手术器械、4号缝合线SZ97/1810C三蒸水机、FA1004HANGPING电子天平、半自动RM2255型切片机、恒温水浴箱等。
1.5 标本制备
分别对各组大鼠进行麻醉,将大鼠固定于手术台,将胸腔剪开,完全暴露心、肺、肝各脏器及主动脉[2]。插入输液器针头,于升主动脉方向进针并固定针头。右心耳剪开即开放静脉血,以生理盐水进行灌注,再取出依次脱水、透明及石蜡包埋和切片等常规制片[3]。
1.6 HE染色
依次将切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡,再分别置于梯度酒精100.0%乙醇Ⅰ、Ⅱ,95.0%乙醇Ⅰ、Ⅱ,80%、75%乙醇中各浸泡3min。再于苏木素染液内浸染10min并以水浸洗。之后浸于盐酸酒精(浓度1.0%)溶液中完成分色,以自来水进行浸洗。再浸于伊红染液中,达3min后以自来水进行30s浸洗。之后依次置于乙醇(浓度70.0%～80.0%)中各30s,置于乙醇(浓度90.0%)中1min,置于乙醇Ⅰ、Ⅱ中各2min,最后置于无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各3min,完成脱水。再将其置于二甲苯内进行3次透明后进行封片。
1.7 免疫组化
将切片置于60℃恒温箱内进行烘烤,将枸橼酸盐缓冲液200ml微波加温达96℃后冷却为室温。再以PBS缓冲液进行浸洗完成抗原修复。再以H202水避光孵于切片,以MPBS缓冲液进行冲洗,封闭血清进行室温孵育。再滴加VEGF、HIF-1α兔抗鼠多克隆抗体孵化过夜。以PBS缓冲液作阴性替代一抗对照。以PBS缓冲液进行冲洗。再滴加羊抗兔IgG工作液进行孵育,以PBS缓冲液进行冲洗。滴链酶卵白素辣根酶标记工作液于切片,孵育20min,取出以PBS缓冲液进行3次冲洗。再滴DAB液于切片(50μl/片),最后置于梯度乙醇进行脱水,以二甲苯透明后进行封片[1]。
1.8 Tau免疫组化
室温凉干切片后开始免疫组化,血清封闭20min后分别滴加一抗4℃过夜、二抗室温持续1h。再加SABC(过氧化物酶-链霉亲和素复合物)室温持续30min,完成DAB显色,每个步骤均以PBS (0.01M)缓冲液进行3次冲洗,5min/次。最后置于梯度乙醇进行脱水,以二甲苯透明后进行封片。
1.9 Westernblot检测
各组选取2只大鼠,断头取出右侧海马保存。按1:9比例将标本加至匀浆缓冲液内,经裂解、匀浆、离心后取上清,再进行蛋白含量测定。置于沸水进加热,蛋白质变性完成。再制备浓缩胶、分离胶,并进行电泳[5]。之后将蛋白凝胶在NC膜上转印,再转移至丽春红染液内,标出参照蛋白。再以TTBS洗NC膜8min后,将正面向上使其浸入脱脂奶粉封闭液内过夜。完成一抗、二抗孵育后于暗室内进行ECL反应。
1.1 0 TaumRNA表达及图像分析
以原位杂交Tau检测试剂盒对TaumRNA进行检测,地高辛标记寡核苷酸Tau探针,严格按照说明书完成操作。将切片经H202进行室温处理,以PBS洗2次,在枸橼酸胃蛋白酶新稀释溶液中消化,进行原位杂交以PBS缓冲液进行3次冲洗,将切片进行2h预杂交后,再滴加杂交液过夜,再2倍SSC洗2次,5min/次,0.5倍SSC洗1次,持续15min,0.2倍SSC洗1次,于37℃环境下滴加封闭液封闭30min,于37℃环境下滴加鼠抗地高辛生物素化60min,于37℃环境下滴加SABC维持20min,于37℃环境下滴加过氧化物酶生物素化20min,每个步骤均以PBS缓冲液进行4次冲洗,最后DAB显色、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶完成封片[6]。
1.11统计学处理
SPSS19.0软件包统计处理数据,()示计量资料比,选择t检验;P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠再灌注12h、
24h海马区VEGF阳性表达对比假手术组、Ado假手术组VEGF阳性表达较低,缺灌组、Ado缺灌组VEGF表达增多,且Ado缺灌组12h、24h VEGF表达较缺灌组增多,P<0.05。
注:*组间对比,P<0.05。
2.2 大鼠再灌注12h、
24h海马区HIF-1α阳性表达对比假手术组、Ado假手术组HIF-1α阳性表达低,缺灌组、Ado缺灌组HIF-1α表达增多,且Ado缺灌组12h、24h时HIF-1α表达较缺灌组增多,P<0.05。
注:*组间对比,P<0.05。
2.3 大鼠再灌注12h、
24h海马区P-Tau表达对比Ado假手术组、Ado缺灌组各时点P-Tau阳性表达均较假手术组、缺灌组低(P<0.05)。
注:*组间对比,P<0.05。
3 讨论
利用缺血再灌注对濒临死亡的部分神经元细胞有积极作用,常规缺血再灌注能够使神经元细胞损伤加重,甚致神经元细胞可因此死亡[7]。HIF-1α(低氧诱导因子-1α)属于对目标基因进行转录调节的因子,且机体状态处于缺血缺氧时,能够有效保护神经元[8]。本文结果显示,对缺灌组、Ado缺灌组免疫组化时,两组HIF-1α表达升高,且Ado缺灌组显著高于缺灌组。VEGF (血管内皮生长因子)可于机体应激时起到关键性作用,并且局灶性IR时能够起到神经保护的作用[9]。神经元在缺氧状态下,可以对细胞具有保护作用[10]。本文结果中,假手术组、Ado假手术组VEGF阳性表达较低,缺灌组、Ado缺灌组VEGF表达增多,且Ado缺灌组12h、24h三个时点VEGF表达较缺灌组增多。
Tau蛋白(脑特异性细胞骨架蛋白)对微管组装具有积极作用,短暂性的脑缺血能够诱导Tau的蛋白位点呈过度特异性磷酸化。本文结果中显示,Ado假手术组、Ado缺灌组各时点P-Tau、Tau5阳性表达均较假手术组、缺灌组低(P<0.05)。也进一步说明Ado (腺苷)预处理干预Tau蛋白水平、通过降低P-Tau、Tau5阳性表达以减轻Tau蛋白磷酸化,对脑缺血靶点选定具有非常重要的临床意义。
综上所述,腺苷预处理应用于局灶性IR大鼠,通过增加VEGF、HIF-1α表达以保护脑组织,从而保护缺血神经元,减少大鼠脑组织损伤、改善其神经功能,因此应结合临床,进一步探讨缺血性脑病治疗的新靶点。
参考文献
[1]支中文,杨龙,杜波,等.Necrostatin-1对大鼠脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞和炎症因子的影响[J].中华神经医学杂志,2015,14(8):757-763.
[2]赵刚,王伟民,杨帅,等.白藜芦醇对大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用研究[J].中华神经医学杂志,2014,13(1):26-29.
[3]王敏,李瑜,王士雷,等.线粒体分裂抑制剂改善大鼠海马神经元缺血再灌注损伤时的能量代谢障碍[J].中华神经医学杂志,2014,13(6):562-567.
[4]王展波,朱沂,党辉,等.抑制磷酸腺苷活化蛋白激酶活性对小鼠脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡的影响机制研究[J].中华神经医学杂志,2014,13(4):358-361.
[5]张俊华,于明,苏建华,等.瑞舒伐他汀对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡及凋亡诱导因子表达的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2015,17(8):868-870.
[6]杨迎春,任占川,张小良,等.大鼠脑缺血再灌注损伤后环氧合酶2诱导基质金属蛋白酶9表达增多[J].解剖学杂志,2015,42(3):298-301.
[7]陈胜,彭沪,庄育刚,等.盐酸法舒地尔对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡和细胞色素C释放的影响[J].同济大学学报(医学版),2012,33(6):36-40
[8]李岩,吴捧莲,杜良鹤,等.PARP-1抑制剂PJ34对脑歃血再灌注损伤大鼠血脑屏障的影响[J].中国医科大学学报,2015,44(8):709-713.
[9]彭影,朱雨岚,陈莉,等.15-HETE参与的脑缺血再灌注损伤中P-ERK1/2表达变化的研究[J].现代生物医学进展,2014,14(35):6855-6858,6873.