十种中草药提取物用作新型多功能天然植物饲料添加剂初探

2022-12-28

饲料的安全性能是食品安全的重要组成部分, 保障饲料安全既是构筑坚实食物安全链的重要一步, 也是我们落实十八大和“两会”精神, 切实保障食品安全和人民健康的一个有力的落脚点。本文立足于天然植物饲料添加剂, 针对当前广泛使用的传统的合成药物、抗生素等药用添加剂存在的安全性低、残留高、产生耐药性等问题的现状, 对选取的公丁香等10种中草药提取物的抗霉菌、抗氧化和减轻黄曲霉素对人肝细胞损伤的活性做了系统的研究, 旨在为新型多功能天然植物饲料添加剂的开发提供启示。

1 材料与方法

1.1 仪器

电热恒温水浴锅 (DK-524;上海精宏) , 旋转蒸发仪 (RE-52AA;上海亚荣) , 生化培养箱 (SHP-150型) , 二氧化碳培养箱 (MCO-20AIC) , 酶标仪 (BIO RAD680) , 恒温培养箱, 可见分光光度计 (722S) , 卧式落地培养摇床 (TS-21113) 。

1.2 试剂

小猪饲料 (玉米-豆粕型) 购于九鼎集团, 货号my0158。人正常肝细胞系HL-7702。DPPH、DMSO、维生素C、硫酸亚铁晶体、水杨酸、邻苯三酚、山梨酸钾、高盐察氏培养基、MH肉汤培养基、RPMI-1640培养基、血清、胰酶和青链霉素。

1.3 方法

1.3.1 中草药醇提物和饲料发霉菌的获得

将选取的10种中草药粉碎成粉末, 各称取200 g, 用无水乙醇浸没, 80℃冷凝回流三次得醇提物, 滤液用旋转蒸发仪45℃, 0.095 MPa抽提得到浸膏[1]。参考董妍玲[2]等的方法获得饲料发霉菌:小猪饲料自然发霉 (湿度75%、温度28℃) 9 d后, 分离纯化发霉菌。

1.3.2 防霉活性检测

1.3.2. 1 纸片扩散法测抑菌圈

参考文献[3]、[4]的方法:DMSO滤纸片做空白对照, 0.3 g/m L山梨酸钾做阳性对照, 10种中草药提取物0.3 g/m L用量10μL, 霉菌培养箱28℃培养3 d, 测量抑菌圈直径。

1.3.2. 2 中草药最小抑菌浓度MIC值的测定

参考文献[5]、[6]的方法:采用MH肉汤培养, 96孔中1孔为空白对照组:200μL MH肉汤培养基;2孔为正常生长对照组:150μL 10‘ cell/m L菌液和50μL MH肉汤培养基;3孔为150μL 10‘ cell/m L菌液和50 m L DMSO;其他孔为样品组:150μL 10‘ cell/m L菌液和50μL不同浓度的样品溶液。28℃培养箱培养20 h后, 进行涂布。

1.3.2. 3 饲料防霉效果评价

小猪饲料预混中草药提取物, 自然发霉16 d后检测霉菌数量 (方法按GBl3092-91《饲料中霉菌检测方法》) , 计算提取物抑菌率:提取物的抑菌率 (%) = (对照样品的霉菌含量-试验样品的霉菌含量) /对照样品的霉菌含量×100%。

1.3.3 抗氧化活性检测

将10种中草药提取物分别进行DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力的测定, 方法分别按参考文献[7]、[8]和[9]的方法进行, 再综合3方面结果, 参考陈永钧等[9]的方法做抗氧化能力综合评价。

1.3.4 霉菌毒素 (AFB1) 减毒实验

HL-7702细胞常规培养, 设计如下。 (1) 对照组:加入含1%DMSO的1640培养液; (2) AFB1组 (求AFB1的IC50值) :分别加入含60、50、40、30、20、10、5μg/m LAFB1的1640培养液, 每一浓度设3个复孔, 48小时后, MTT检测细胞存活率[10]。 (3) AFB1+中草药组:加入不同浓度的中草药提取物, 每一浓度设3个复孔, 48 h后加入AFB1的IC50浓度, 再48 h后MTT法检测, 计算细胞存活率。

2 结果与分析

3.1 中草药醇提物和饲料发霉菌的获得

依据饲料添加剂相关国标, 结合传统中医药理论和相关研究报道, 有针对性的选取10种中草药:山苍子、厚朴、公丁香、炒苍术、姜黄;积雪草、牛蒡子、金荞麦、升麻、淡豆豉。饲料发霉后分离纯化的霉菌:黄曲霉 (Aspergillus flavus) 、寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus) 、雪白曲霉 (Aspergillus niveus) 、黑曲霉 (Aspergillus niger) 、橘青霉 (Penicillium citrinum) 。

3.2 防霉活性检测结果

3.2.1 纸片抑菌圈

阳性对照山梨酸钾抑菌圈直径在12 mm;空白溶媒对照DMSO几乎没有抑菌圈出现;实验组里公丁香抑菌圈为14 mm, 具强抗菌活性;厚朴次之, 抑菌圈12 mm;姜黄 (6 mm) 、山苍子 (5 mm) 抗菌效果较弱;其余中草药的抑菌效果近于无。因此下面实验中只选取有抑菌效果的4种中草药进行。

3.2.2 最小抑菌浓度 (MIC) 的测定

阳性对照山梨酸钾的MIC值是70 mg/m L, 公丁香、厚朴、姜黄、山苍子的MIC值分别是20、30、63、65 mg m L。因此, 这4种有抑菌效果的中草药提取物的抗霉菌能力大小为:公丁香>厚朴>姜黄>山苍子。

3.2.3 饲料防霉效果评价

将有抑菌效果的4种中草药与饲料预混后, 公丁香抑制饲料发霉效果最好, 抑菌率为60%, 厚朴52%、姜黄12%、山苍子14%。

3.3 抗氧化活性检测结果

将3大体系的数据结果进行处理, 总分值越大体外抗氧化活性越好。由表1可见, 公丁香是综合抗氧化能力最强的中草药。

3.4 公丁香提取物对肝细胞AFB1损伤的减轻作用

MTT法测得AFB1对HL-7702细胞的IC50浓度为21μg/m L。加入公丁香提取物预处理HL-7702细胞后再加入 (21μg/m L) AFB1, 规定细胞存活率大于70%为有损伤减轻作用。结果显示, 预处理公丁香提取物终浓度30μg/m L时细胞存活率达到81.74% (大于70%) , P<0.01, 认为有一定的损伤减轻作用。给予公丁香提取物预处理的细胞, 细胞数目与对照组比较无明显减少, 且细胞生长状态良好, 见图1。

1:DMSO空白对照组细胞。

2:AFB1 (21μg/m L) 处理的细胞。

3:公丁香提取物 (30μg/m L) 预作用后又暴露于AFB1 (21μg/m L) 的细胞。

4 结论

公丁香提取物在饲料防霉、抗氧化和减轻AFB1肝细胞损伤方面都有较好的作用。现在有关公丁香的研究还很少, 基本都是一些中药材鉴定或加工方法的文献报导, 而作为多功能饲料添加剂的防霉、抗氧化和解毒作用还属首次报导, 尤其是首次证明了公丁香提取物能减轻黄曲霉素的肝细胞损伤, 使得公丁香提取物突破了以往化学合成类和现有的植物饲料添加剂, 具有了预防保健的生物学功效。因此, 公丁香在开发新型多功能绿色植物饲料添加剂及其实际应用方面的前景十分乐观。

摘要：目的:研制新型多功能天然植物饲料添加剂。方法:选取10种中草药, 获得乙醇提取物后进行饲料防霉, 抗氧化和减轻黄曲霉毒素损伤的活性检测, 最后综合实验结果, 确定在三方面相对功能佳的中草药。结果:公丁香 (Syzygium aromaticum) 在这三方面的效果最佳, 其抑制饲料发霉菌的最小抑菌浓度 (MIC值) 为20 mg/m L, 抑菌率为60%。公丁香的综合抗氧化能力得分最高为7.77分。公丁香提取物 (30μg/m L) 预处理人肝细胞HL-7702细胞后显著减轻了黄曲霉素AFB1 (21μg/m L) 对细胞的损伤 (P<0.01) 。因此, 公丁香在开发新型多功能绿色植物饲料添加剂方面有着较好的前景。

关键词：中草药提取物,饲料,防霉,抗氧化,黄曲霉素,公丁香