检测pcr技术

检测pcr技术（精选6篇）

篇1：检测pcr技术

多重PCR技术在病原检测中的应用

多重PCR能够同时扩增不同片段,具有普通PCR方法不可比拟的优势.简要论述了多重PCR在细菌病原体的检测、病毒病原体的检测、支原体和衣原体及寄生虫的检测、微生物耐药性检测等方面的应用,分析了多重PCR的.影响因素及条件优化,并进一步综述了多重PCR的应用前景.

作 者：赵红庆 苑锡铜 黄留玉 ZHAO Hong-qing YUAN Xi-tong HUANG Liu-yu 作者单位：军事医学科学院,疾病预防控制所传染病控制中心,北京,100071刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：18(5)分类号：Q503 R372关键词：多重PCR 病原 检测 影响因素

篇2：检测pcr技术

PCR技术检测金黄色葡萄球菌进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,其传统方法包括选择性培养、生化鉴定等步骤,耗时长、灵敏性差,很难满足食品安全快速检测要求.PCR技术是近年来广泛应用于食品中致病微生物快速检测的现代方法之一,其目的基因多种多样,主要包括耐药性相关基因、毒素基因、酶基因及多种特异性鉴别基因.本文综述了PCR技术应用于金黄色葡萄球菌检测的.各种目的基因,并简要介绍了多重PCR及实时定量PCR等新技术的应用.

作 者：姜延龙 张宇 田波 霍贵成 JIANG Yan-long ZHANG Yu TIAN Bo HUO Gui-cheng 作者单位：东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150030刊 名：食品科学 ISTIC PKU英文刊名：FOOD SCIENCE年，卷(期)：27(5)分类号：Q939.11关键词：金黄色葡萄球菌 PCR 基因

篇3：检测pcr技术

1 材料和方法

1.1 病料

来自山东某规模化猪场送检的3头疑似CSF的发病仔猪, 采集其扁桃体、脾、肾等组织作为病料。

1.2 试剂

TRIzol试剂购自Invitrogen公司;AMV reverse transcriptase (10 U/μL) 、RNA酶抑制剂、d NTP (40 U/μL) 购自Promega公司;Taq DNA polymerase (5U/m L) 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DEPC水购自上海生工生物技术公司;异丙醇、氯仿、氯化钠为天津市化学试剂三厂产品。

1.3 主要仪器

高速微量离心机 (Sigma, USA) ;PCR仪Gene Amp System 2400 (PE公司) ;紫外凝胶成像系统 (UVP公司) ;稳压稳流电泳仪DYY-31A型为北京六一厂产品。

1.4 引物的设计与合成

参照Alfort株、Brescia株和C-株 (SK-6) 核苷酸序列, 利用primer5.0软件设计4条引物, 其中正负链各1条, 由宝生物工程 (大连) 有限公司合成, 其引物代号、位置见表1。

1.5 组织中总RNA的提取

参照Invitrogen公司的TRIZOL!LSReagent的Total RNAisolation system进行, 方法如下:

剪取50~100 mg的组织, 用生理盐水冲洗后加1 000μLTRIZOL!LS Reagent在匀浆器中匀浆 (样品量不应超过用于匀浆的TRIZOL!LS Reagent的10%) , 将液相转移到1.5m LEppendorf管内。在15~30℃ (一般室温) 孵育5 min, 使核酸蛋白完全降解, 加入0.2 m L氯仿, 颠倒混匀 (轻轻) , 置于15~30℃孵育2~15 min。在2~8℃ (4℃) 以11 500 r/min离心15min, 取上层水相于一新Eppendorf管中。每1 m LTRIZOL!LS Reagent处理样品加0.2 m L异丙醇沉淀RNA。先在15~30℃孵育2~15 min, 在2~8℃ (4℃) 以11 500 r/min离心10 min。弃上清, 用750 m L/L乙醇 (1g/L DEPC水配制) 洗涤沉淀, 每1 m LTRIZOL!LS Reagent处理样品加至少1 m L750m L/L乙醇, 在2~8℃ (4℃) 以7 400 r/min离心5 min, 混匀样品。弃上清, 室温干燥沉淀5~10 min。用无RNase酶水 (30μL) 溶解沉淀, 加1μL (40 U/μL) RNA酶抑制剂 (Ribonu-clease inhibitor, 冰上操作) , 置-20℃备用。

1.6 目的片段的RT-PCR和RT-n PCR扩增

反转录合成c DNA:在一新Eppendorf管中加入:总RNA提取液8μL, CSFV-E2-p1a B (20 pmol/μL) 1μL, 5×AMV buffer 4μL, d NTP (25 mmol/μL) 6μL, RNasin (20 U/μL) 0.5μL, AMV (10 U/μL) 0.5μL。42℃水浴1.5~2 h, 置-20℃备用。

目的片段扩增 (一扩) :在一新Eppendorf n PCR管中加入:灭菌双蒸水13.25μL, 反转录c DNA液5μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, d NTP (25 mmol/μl) 2μL, CSFV-E2-p1a (20pmol/μl) 1μL, CSFV-E2-p1a B (20pmol/μL) 1μL, Taq DNA polymerase (5 U/m L) 0.25μL。反应条件为:95℃变性4 min;然后94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s, 35个循环;最后在72℃下延伸10 min。

扩增 (二扩) :将上步 (一扩) 的PCR产物作为模板, 用CSFV-E2-p2a和CSFV-E2-p2B做为配对引物完成的PCR (二扩) 。灭菌双蒸水16.25μL, 一扩PCR产物2μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, d NTP (25 mmol/μL) 2μL, CSFV-E2-p2a (20 pmol/μL) 1μL, CSFV-E2-p2B (20 pmol/μL) 1μL, Taq DNA polymerase (5 U/m L) 0.25μL。反应条件为:95℃变性4 min;然后94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s, 35个循环;最后在72℃下延伸10 min。

1.7 琼脂糖凝胶电泳PCR产物鉴定

取上述PCR (一扩产物, 预计305 bp;二扩产物, 预计172 bp) 产物5μL在10g/L TAE琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶中含0.5μg/m L溴化乙锭, 电泳缓冲液为1×TAE, 90~100V, 25 min电泳完毕后, 于紫外凝胶成像系统观察。

2 结果与讨论

Marker左侧2、3、4为一扩引物扩增结果, 如图1。Marker右侧2、3、4为二扩引物扩增结果, 如图2。表明用引物p1a/p1a B进行扩增产物电泳后, 在预计的305 bp处有阳性条带;再用p2a/p2B做为配对引物完成的PCR二扩电泳, 在预计的172 bp处有更加明显的阳性条带。说明被检病猪存在CSFV感染。

巢式PCR的原理就是使用2对PCR引物扩增完整的片段, 第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似, 第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部, 使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增, 巢式PCR的好处在于, 如果第一次扩增产生了错误片断, 则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低, 因此, 巢式PCR的扩增非常特异[9]。Liu等[11]提取CSFV感染组织中总RNA进行RT-PCR反应, 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测表明, 其灵敏性可检测到104TCID50的病毒。Sand-Vik等[12]和Goldrick等[13]分别利用巢式PCR对CSFV进行检测, 结果证实扩增灵敏性较普通RT-PCR可提高1 000倍。

篇4：检测pcr技术

关键词：PCR 原理与技术 食品检验 应用

中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0038-01

1 引言

上世纪80年代中期，分子生物学领域诞生了一项新技术，称作DNA体外扩增法，简称为PCR技术。其基本原理是在生物体的体外，对指定DNA双链片断进行扩增。第一步：挑选出指定DNA双链片断，人工合成指定DNA双链片断端头邻近序列互补的寡核苷酸片断，将该互补片段称作引物（Primer），引物也是双链结构，分作左端引物和右端引物。第二步：加热指定DNA双链片断，使之发生变性，分裂成单链，把左右引物与之分别配对进行互补结合。第三步：在DNA聚合酶和4种dNTPs底物的共同作用下，引物沿模板DNA链按5/→3/方向延伸，合成DNA双链，这个步骤被称为DNA多聚酶链反应。第四步：以新合成的DNA双链作为扩增模板，重复DNA多聚酶链反应步骤。历经25～35次循环，可将DNA序列扩增到近百万倍。该技术具有特异性强、灵敏度高、扩增快速准确等优点，自诞生之日起，其实用性在医学、农学、环境科学、食品检验等领域得到了很好的印证。

2 PCR技术在食品检测方面的应用

2.1 PCR技术的检测原理

PCR技术最根本的鉴定依据是生物的DNA结构具有唯一性。在食品检测中，起到鉴定标准模板作用的是引物，从理论上说，①如果引物来自DNA保守区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA保守区的片段；②如果引物来自DNA特异区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA特异区的片段。以上两种理论依据就是PCR技术的检测原理。

在实际应用中，人工有选择地截取DNA片段，使用DNA多聚酶链反应，可以在2～3小时之内达到常规检测需要数天才能达到的培养效果，另外还省去了繁琐的种属鉴定等工作，简化了检测流程。

2.2 PCR技术的操作程序

（1）待检样品的浓集（增菌）。食品中待检的微生物群落浓度一般都是比较低的，达不到检测要求。这就需要进行待检微生物的浓集。

（2）核酸的提取。为了实现PCR扩增，必须提取待检样品的核酸。常用的处理方法包括：加热、反复冻融、化学裂解。

（3）PCR扩增。在扩增过程中，最关键的莫过于引物，它直接关系到PCR检测的成败。扩增需要20—40个反应循环，每个循环都由高温变性、低温退火、适温延伸组成。高温时，氢键打开，双链变为单链，生成扩增模板；低温时，左引物和右引物分别与模板DNA的2条单链做互补结合，完成配对；适温时，在聚合酶作用下，4种三磷酸脱氧核苷（A、T、G、C）按碱基互补配对原则不断进行配对添加，按5/→3/方向自动合成新的DNA双链片段。

变性温度一般需保持在94℃左右，如果待扩增区域DNA的G+C含量太高，则可考虑适当提高变性温度。

退火温度与引物的G+C含量有关，根据公式：Ta=4×（G+C）+2×（A+T）-5。

延伸温度一般需保持在72℃左右，此时DNA聚合酶的聚合速度约1000（碱基）/min。

（4）扩增产物的检测。常用的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法，琼脂糖质量分数在0.8%～2%之间。待分离DNA片断的分子量越小，所需琼脂糖质量分数则越大，反之亦然。

3 PCR技术用于食品检测的优缺点

3.1 PCR技术的优点

传统检测方法多采用平板培养法，通过菌落计数来判断菌体浓度。传统方法的优点是操作简单，其最大的缺点是消耗的时间太长，检测周期一般在3——10天。

PCR技术的最大优点就是检测速度快，使用特异区扩增检测，只要在几个小时内成功扩增，即可检验并判断出待检测样品的种类，非常迅捷、灵敏。

3.2 PCR技术的缺点

任何事物都不是完美的，PCR技术一样存在缺点，正是这些缺点的存在，导致其不能完全取代传统检测法。其主要缺点包括：（1）假阳性问题。核酸受到污染而造成假阳性的问题，是PCR技术的最大缺点。这个缺点来自扩增本身，在扩增的过程中，即使只有一个污染源，结果也会出现成十万成百万倍的污染现象，造成检测结果出现阳性，称之为假阳性。

防止假阳性问题，目前只有做好隔离这一种办法。（2）假阴性问题。假阳性问题来自PCR技术本身，假阴性问题则来自待测样品。食品成分复杂，其中多种成分发生了复杂的化学反应，不能排除模板液中带有某种或某些抑制PCR反应的成分。防止假阴性问题的办法是设置阳性对照环节。（3）定量检测困难。由于影响PCR产率的原因比较多，在定量检测方面不能提供较为精准的数据，导致PCR技术无法胜任定量检测。直至目前，尚没有实质性的突破与进展，限制了PCR技术在检测方面的应用范围。

4 结论

PCR检测有一定的局限性，但是，其高灵敏度的检测反应、明显的特异性辨别、快速简便的检测流程，是其它检测方法所不能替代的。相信随着生物技术的快速进步，PCR检测技术的应用范围會越来越广泛。

参考文献

[1]常玉华，仇农学.基于PCR技术快速检测食品微生物的原理方法与应用[J].农产品加工，2011（11）.

[2]张泽民，李曼.PGR技术在转基因食品检测中的应用与发展趋势[J].农牧产品工程，2011（7）.

篇5：PCR实验检测标准操作规范

一、PCR 实验室的设置及管理

1．目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。2．适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。3．负责人： 4．细则：

4．1流感实验室为急传所的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作等。4．2 本实验室采用实时荧光定量（定性）PCR 技术作为病毒基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。标本的接收则在检验科标本接收处进行。

4．3 各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。4．4 各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP 文件。

4．5 严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。

4．6 非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区）需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。4．7 实验完毕后做好清洁消毒工作。

二、PCR 实验室工作制度

1．目的 ：保持良好的工作环境，以确保检测结果的可靠性，防止交叉污染，防止差错、事故及纠纷的发生。

2．适用范围：所有本实验室人员。3．负责人： 4．细则： 4．1 本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作，不得进行其它实验操作。4．2 各区的用品不得混用。

4．3 在各区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程。4．4 试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP 文件）。

4．5 标本处理区只能进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA 时cDNA 的合成（见相关SOP 文件）。

4．6 扩增分析区只能进行DNA 或cDNA 的扩增、实时荧光PCR 扩增产物的分析（见相关SOP 文件）。

4．7 进行实验时严格执行本实验室的各项操作规程，及时做好各种操作记录，力求准确、可靠。实验完毕，做好清洁、整理及分析统计等工作。

4．8 室内仪器由专人负责，未经许可，不得随意使用或挪用；爱护使用仪器，定期进行保养与维修。

4．9 爱护科室财产，注意安全；离开实验室前应关好门窗，检查水、电等。

三、PCR 实验室内务管理制度

1．目的：保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。2．适用范围：实验室相关人员及相关清洁工人。3．负责人： 4．细则：

4．1 非本室工作人员未经允许不得进入实验室。4．2 各区的用品不得混用。

4．3 实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。

4．4 进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定，禁止逆向走动。

4．5 所有仪器（如PCR 扩增仪）须有专人负责，并有使用维护记录；实验人员必须熟悉仪器性能后方允许操作，并严格遵守操作规程。

4．6 所有试剂进购、配制、质检、使用均要有记录，未经允许不得随意带出本实验室。4．7 每天了解仪器运转情况及试剂使用情况，确保仪器整洁安全，试剂合格使用。4．8 各区的各种清洁消毒均应有记录，工作衣消毒时注意各区应分开进行处理。4．9 注意保持实验室卫生整洁，严禁在室内抽烟、吃零食，非实验操作人员应尽量少入。4.10下班前检查门、窗、水、电，节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备。

四、PCR 实验室人员的配置及管理

1．目的：保证实验室有足够数量的合格的具备开展该类实验能力的实验人员。2．适用范围：适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。3．负责人： 4．细则： 4．1 人员要求

4．1．1 本实验室工作人员应为医学检验专业或相关专业毕业，具有中级以上技术职称或专科以上学历。

4．1．2 实验室工作人员应参加卫生部或省临检中心举办的PCR 技术培训，并取得合格证。4．1．3 对于新进入本室的人员，如尚未取得PCR 技术培训合格证，应在实验室有培训合格证的上级技术人员的指导下进行实验工作，实验报告由有资格人员出具，并应在最短的时间内取得上岗培训合格证。4．2 人员配置

4．2．1 实验室应根据工作需要配备足够的工作人员。4．2．2 各级技术人员履行相应的工作职责。4．3 人员培训及考核

4．3．1 实验室负责人或负责人指定人员参加每年卫生部PCR 室间质评总结会。

4．3．2 实验室工作人员每1～2 年至少参加1 次PCR 技术的省级或国家级继续教育项目，参加相关学术交流会议。

4．3．3 安排未取得上岗培训合格证的工作人员在合适的时间内参加技术培训。

4．3．4 科室不定期组织实验室内部实验人员学习、更新核酸扩增方面的相关知识，提升自身的理论学习水平。特别是在标本接收区采血、接收标本的人员，需定期对其进行有关核酸扩增技术，标本采集、保存、运输等知识的培训。一些科室的送检标本由该科室的人员送到标本接收区，对这些临床医护人员也要定期进行有关核酸扩增技术，标本采集、保存、运输等知识的培训。

4．3．5 本实验室工作人员每年进行考核一次,考核内容: a)日常工作质量 b)室内质控测评 c)室间质控测评 d)在抱怨处理中的表现

4．3．6 本实验室工作人员实行严格奖惩制度,有下列表现者可受奖: a)工作质量高, 质控测评成绩优秀者

b)有科研能力,并有一定数量和质量的论文发表 c)有独创性工作成果,经鉴定认可者 d)受到有关部门或群众嘉奖者 有下列情况者将受到惩处: a)工作质量问题较多，质控测评成绩不合格； b)不遵守规章制度并造成一定影响； c)不求上进。

4．3．7 本实验室工作人员奖惩方法分精神及物质两类,经实验室上报及有关部门批准后执行。

4．3．8 本实验室工作人员均建立业绩档案,实行能进能出制度,不断吸收高质量人员,加强培训和提高,对于不适合本室工作的人员要及时调离。4．4 人员管理

4．4．1 实验室建立所有工作人员的技术档案，包括：学历、任职资格、发表论文、研究成果、培训等相关材料复印件。

4．4．2 技术档案分文本档案和电子档案，文本档案每年更新1 次，电子档案随时更新。

五、PCR 实验室清洁程序

1．目的：保证实验室环境的整洁，防止污染。

2．适用范围：适于实验室工作环境、实验台面、工作服、移液器等的清洁消毒工作。3．负责人： 操作人： 4．细则：

4．1 实验室地面必须平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。

4．2 合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，常用的物品要容易寻找到。

4．3 抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。4．4 实验结束后用2%戊二醛对台面进行清洁，并用移动紫外灯进行消毒。

4．5 每天对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭。每周1 次对移液器咀进行75%酒精浸泡15 分钟左右，若使用过程中发生污染应随时浸泡处理。

4．6 实验过程中如发生标本或试剂外溅，应立即用2%戊二醛滴上，滤纸盖上半小时，然后用酒精擦洗，并用移动紫外灯消毒。

4．7 每天实验前开启各区的通风系统，各区实验结束后，分别打开传递窗紫外灯、移动紫外灯（对实验台面消毒）、天花板紫外灯消毒实验室，每次开启 30～60 分钟。4．8 待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并记录。

4．9 依次清洁三个区的实验台面和地面，各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。4．10 处理好各区废弃物。

4．11 每周将工作服洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。

六、PCR 标本唯一标识编号规则

1．目的：保证标本编号的唯一性，也是准确发放报告的基础。

2．适用范围：使用核酸扩增荧光检测实验室所开展的病毒以及基因检测项目： 3．负责人： 操作人： 4．程序：

4．1 按检测日期分类标记

根据标本送检的日期，每天的标本对应标记一种唯一的代号。4．2 按检测类型分类标记

根据检测项目的不同，每种检测项目对应标记一种唯一的代号。4．3 按验单接收顺序编号

在同种检测类型的验单中，按验单顺序编号。4．4 特殊标本的编号

如有特殊情况，应在标记前面增加特异字母区别开。4．5 编号步骤 a）对当天送来的标本，根据编号的基本原则编号，每个样本的每个检测项目对应一个唯一的编号。

b）用笔在每张检验申请单和对应的样品管上作好相同的标记。

c）做好标本的接收记录，每个样本的记录都应包括以下信息：接收时间、医院、科室、送检医生、患者姓名、性别、年龄、标本类别、标本状态、送标本者、接收人、检验单号、标本唯一统编号等。

d）处理好样品、点样后，将反应管放入扩增仪上开始扩增。

f）扩增得到结果后，先在统计簿上填入结果，作好记录，再一一把实验结果填入相应申请单。

g）发放检验报告单。

七、PCR 基因扩增实验室的要求

1．目的：规定在各区内所进行的工作及其操作。2．适用范围：所有在本区内进行的工作。3．负责人： 操作人： 4．程序：

一、临床基因扩增检验实验室的设计

（一）临床基因扩增检验实验室区域设计原则。原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。各区的功能是：

1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

2.标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。

3.扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。

4.扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。

（二）临床基因扩增检验实验室的空气流向。临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。

（三）工作区域仪器设备配置标准。

1.试剂储存和准备区。

（1）2～8℃和-20℃以下冰箱。

（2）混匀器。

（3）微量加样器（覆盖0.2-1000µl）。

（4）可移动紫外灯（近工作台面）。

（5）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。

（6）专用工作服和工作鞋(套)。

（7）专用办公用品。

2.标本制备区。

（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。

（2）高速离心机。

（3）混匀器。

（4）水浴箱或加热模块。

（5）微量加样器（覆盖0.2-1000µl）。

（6）可移动紫外灯（近工作台面）。

（7）生物安全柜。

（8）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。

（9）专用工作服和工作鞋(套)。

（10）专用办公用品。

（11）如需处理大分子DNA，应当具有超声波水浴仪。

3.扩增区。

（1）核酸扩增仪。

（2）微量加样器（覆盖0.2-1000µl），（视情况定）。

（3）可移动紫外灯（近工作台面）。

（4）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。

（5）专用工作服和工作鞋。

（6）专用办公用品。

4.扩增产物分析区。

视检验方法不同而定，基本配置如下：

（1）微量加样器（覆盖0.2-1000µl）。

（2）可移动紫外灯（近工作台面）。

（3）消耗品：一次性手套、加样器吸头（带滤芯）。

（4）专用工作服和工作鞋。

（5）专用办公用品。

上述各区域仪器设备配备为基本配备，实验室应当根据自己使用的扩增检测技术或试剂的特点，对仪器设备进行必要的增减。

二、临床基因扩增检验实验室工作基本原则

(一)进入各工作区域应当严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→ 扩增产物分析区。

(二)各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。

(三)不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。

(四)实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

(五)工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。工作区的实验台表面应当可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应当方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基对（bp），对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。

(六)实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

三、临床基因扩增检验实验室各区域工作注意事项

(一)试剂储存和准备区。贮存试剂和用于标本制备的消耗品等材料应当直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过扩增检测区，试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在该区，应当保存在标本处理区。

(二)标本制备区。由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染，可通过在本区内设立正压条件，避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序。

(三)扩增区。为避免气溶胶所致的污染，应当尽量减少在本区内的走动。必须注意的是，所有经过检测的反应管不得在此区域打开。

(四)扩增产物分析区。核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标记）、直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法、质谱分析等。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1 mol/L HCl中，并且不能在实验室内倾倒，而应当至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。

由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故应当注意实验人员的安全防护。

八、PCR 废弃物的处理程序

1．目的：保证实验室、实验人员和外部环境的安全。

2．适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用化学试剂（NaOH、EDTA、乙醇、生理盐水等）、实验室废弃物的处理； 3．负责人： 操作人： 4．细则：

4.1 科室职责应对本室工作人员讲明本程序在预防交叉、实验室污染及切断传播途径中的重 要性，并要求严格执行。

4.2 实验室所有垃圾，装入专用污物袋内，各区备有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾 袋（黄色）。使用过的一次性消耗品(如试管、吸头、离心管、等)，先放入10%次氯酸钠溶 液中浸泡2～4 小时后，再放入黄色垃圾袋内，使用过的手套、鞋套等直接放入黄色垃圾袋 内集中处理。

4.3 夹取标本的工具，如钳、镊、接种环、吸管等，用后均应消毒清洁，进行微生物检验时，应重新灭菌，金属工具可烧灼灭菌或消毒液浸泡；玻璃制品干热或压力蒸汽灭菌。4.4 一次性塑料痰盂，用2%戊二醛液浸泡2～4小时后，放入黄色垃圾袋内集中处理。4.5 废弃标本如血、尿、胸水、腹水、脑脊液、唾液、胃液、肠液、关节腔液等用10%的84 液浸泡2～4小时后，集中处理。

4.6 盛标本的容器，若为一次性使用的纸质容器及其外面包被的废纸，放入污物袋里 处理；对可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15 分钟或加入10%次氯酸钠溶液浸泡2～4 小时，消毒液每日更换，消毒后用洗涤剂及流水刷洗，沥干，用于微生物培养采样者，用压力蒸汽灭菌后备用。

4.7 废弃标本及其容器装入黄色垃圾袋内、封闭，污物处理中心处理。

九、基因扩增检测实验及结果分析

1、目的：保证扩增及结果分析的标准化、规范化。2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。3．负责人： 操作人：

4、标准程序：

4.2.8 发放报告：及时登记检测结果记录，发放临床报告。

4.3 实验结果无效的判断标准：出现下述四种情况中的任何一种或多种，当次实验结果不可 发，查找原因，重做实验。4.3.1 阴性对照出现扩增。4.3.2 阳性对照无扩增。

4.3.3 大批甚至所有的标本都扩增了。4.3.4 室内质控血清检测结果出现失控情况，实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程 序。

4.4 实验结果有效的判断标准：达到下列要求后，当次实验有效，可以发放结果。4.4.1 阴性对照没有扩增，阳性对照扩增。

4.4.2 阳性标准品梯度曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数三个参数的数值均在范围内。4.4.3 室内质控血清检测结果处于在控状态，具体标准详见

十、临床标本的保存操作程序

1．目的：临床标本正确保存，以便必要时复查。2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。3．负责人： 操作人： 4．程序：

4．1 处理前的标本保存

a）全血标本可4℃下短期（24h 内）保存，长期保存则需分离出血清（血浆），保存于-20℃下。

b）咽拭子、痰或胸腹水、脑脊液、脓液标本短保存于-70℃下。4．2 报告发出后的标本保存：

a）提取的核酸标本当天检测可置4℃保存，如当天不检测应置-20℃保存。报告发出后第二天丢弃。

b）原始血清/血浆样本在报告发出后放入低温冰箱-20℃保存1 个星期，以备复查。超过1 个星期保存期的标本由室负责人酌情处理，一般按生物传染性物品统一处理。

c）血清/血浆标本放置低温冰箱保存时须有记录，按编号顺序存放，并由专人负责管理。4．3 特殊标本的处理：

对暂不检测的项目和规定时间外收到的零散样本，要随时登记和交班，以免漏检，遗失和延误检验。对特殊样本或特殊病人的样本，实行“首接”负责制，所谓特殊样本是指难于采集的样本，以及特殊病人的样本一律实行“首接”负责制，无论那位工作人员，一旦收到样本后，均须负其责任，不得以任何借口推托，及时和正确保管和转送样本到有关实验室或有关人员，同时作交班记录和双签名。

十一、临床标本的采集、运送、接收程序

1．目的：规范临床待检标本的正确采集、送检和处理。2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。3．负责人： 操作人： 4．程序： 4．1 标本的采集

4．1．1 标本由临床各科室接受过临床基因扩增检测有关标本采集、保存、运输知识培训的医护人员采集并送至实验室。4．1．2 标本采集要求

a）血液标本：用2ml 真空采集管或1.5ml 高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2 小时内送达实验室。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml 的离心管中，编号。

b）痰标本：用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰标本送检。（对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl 水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。）标本在室温下保存不能超过24 小时。4．2 标本的运送

标本采集后，密闭、标（贴）姓名，应尽可能快的送至检测实验室，如运送时间需2 小时以上，必须用冰盒送至实验室。4．5 接收

4．5．1 严格对各类样本的查对和双签制度，对病房各样本及时进行验收，查对，不符合要求的样本一律退回，并有书面记录。

十二、PCR 生物安全防护措施

1．目的：预防工作人员在实验过程中被感染或污染。2．适用范围：适用于本室所有工作人员。3．负责人： 操作人： 4．细则： 4．1 实验人员在实施生物防护措施时，应严格遵守各项相应的规章制度，建立起强烈的生物防护意识。

4．2 每天更换废液缸的2%戊二醛溶液，并保证2%戊二醛溶液用量为废液缸内总液量的五分之一左右。

配置消毒液时，正确量取足量的消毒剂（用量杯，保证浓度），水的用量也要正确，缸体密封性良好。

4．3 实验台面日常清洁时使用75%的酒精擦拭。

4．4 每区每次实验后紫外灯照射30～60 分钟，如有需要可延长照射时间。

4．5 所有来自病人的血液或体液标本均应视作传染源，因此在标本的采集、运输过程中，标本容器应完好无泄漏。

4．6 处理标本时应穿工作服、戴手套，以免沾上皮肤。如手或其它部位的皮肤沾上血液或体液标本以及试剂，应立即冲洗干净。有下列情况之一者，需另外消毒：手接触有传染性的微生物，水龙头、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量细菌污染。消毒剂可用“84”消毒液。4．7 在实验过程中，病人标本（血液、体液）或试剂不慎溅入眼内应立即用清水洗。4．8 实验过程中在使用针具等锐器时，尽量小心防止受伤。若被锐器刺破时，应立即脱下手套，尽量挤压伤处，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要时进行预防补救措施。4．9 在实验过程中病人标本（血液、体液）外漏时，应立即用2%戊二醛滴上，滤纸或纱布盖上半小时，然后用酒精擦洗，并用紫外灯消毒。

4．10 实验完毕离开时，应脱下所有该实验区个人防护装备。4．11 实验完毕后应对实验室进行紫外消毒。

4．12 遇有意外事故应立即报告科室负责人，当事人应立即注射相关疫苗或进行预防性治疗，并进行医学观察，严重者应报告技术负责人。

十三、PCR 实验室化学试剂配制程序

1．目的：保证实验中用到的各种溶液符合实验要求。

2．适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用溶液：4%NaOH 溶液、75%酒精、消毒剂（三氯异氰尿酸或 二氯异氰尿酸钠）、2%戊二醛溶液等。3．负责人： 操作人： 4．程序： 4．4 化学试剂的配制：

4．4．1 用具：干燥洁净的250ml 量桶一只，1000ml 量桶一只，1000ml 烧杯一只，三角烧瓶两只，天平一架，100ml 塑料试剂瓶、2000ml 广口瓶各一只。4．4．2 配制步骤：

4．4．2．1 配制4%NaOH 溶液: a）用天平称取4 克分析纯的NaOH 固体，置于一只三角烧瓶中。

b）用250ml 量桶准确取100ml 水，缓缓注入盛放NaOH 固体的三角烧瓶中。c）摇荡三角烧瓶使NaOH 固体充分溶解。

d）然后缓缓倾倒入100ml 塑料试剂瓶中密封保存备用。4．4．2．2 配制消毒剂: a）一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯达到500mg/L，即可达到消毒作用。

b）消毒剂为粉状（20 克/袋），如配制一升的消毒剂溶液，则取500g，倒入烧杯中，缓缓加入1000ml水充分溶解，备用。

c）如需加大消毒力度，则有效氯浓度加大。4．4．2．3 配制2%戊二醛溶液: a）准确量取戊二醛原液20ml 倒入1000ml 烧杯中。

b）量取980ml 水，缓缓倒入1000ml 烧杯中，混匀，加至2000ml 广口瓶中备用。注意事项：每份配制好的溶液保质期为14 天

十四、PCR 应急处理程序

1．目的：在实际工作中，仪器设备发生故障、试剂盒发生质量问题时，为保证检验结果的准确性、及时，应正确采取应急措施，最大程度上避免或减轻不利影响。

2．适用范围：适用于满足核酸扩增荧光检测实验室检测需要并可能对检验结果造成误差的仪器设备和试剂盒。3．负责人： 4．细则： 4．1 核酸扩增荧光检测实验室工作人员在职责范围内均有责任熟悉各种仪器和相关设备的性能、要求、维护和保养、常见故障的排除、尤其要严格按照操作规程操作。

4．2 工作人员在职责范围内均有责任有意识地注意以求及时发现并报告仪器设备和试剂盒的异常情况。

4．3 作为应急处理，潜在着一定的可能影响检测质量的不确定因素。室负责人负责在第一时间检查核实应急措施的有效性。4．4 仪器设备故障

4．4．1 室负责人接到异常情况报警后，立即现场确认异常情况的性质：观察有误、误操作、偶发现象或确属不能立即排除的故障。

4．4．2 用红牌故障标志标示故障仪器，以防被错误使用。

4．4．3 有满足要求的替用设备的，启用替用设备（准用仪器）。借用其他部门仪器设备时，及时联系借用并核实该设备的使用状态。替用、借用或备用设备的使用在满足质量要求的同时，必须同时满足实验室管理措施（特别是防污染）的要求。

4．4．4 不能解决的问题，应及时与供应方会同解决。根据双方合同约定，及时通知供应方。供应方技术支持人员将在规定的时间内随身携带备用设备到达现场。

4．4．5 仪器维修后，必须经验收合格并供需双方签字，调试实验通过后才能重新启用。取下红色故障标示（暂停使用），换上蓝色正常标示（正常使用）。4．4．6 科室主任须检查并随时跟踪所采取措施的有效性。

4．4．7 对未能及时排除故障时，必须及时上报科室，在科主任批准下，应积极联系附近的其他已得到卫生部临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检验，以满足病人和临床或科研需求。

4．5 试剂盒质量发生问题，经核实后，及时通知供货商迅速更换另一批次试剂，使用前需先作质量检测，合格后方可使用。

4．6 仪器设备故障或试剂质量问题不能得到解决，预期将会影响到检测报告的及时发出，可将标本送至其它已得到卫生部临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检。4．7 影响到检测报告发出的情况，应在应急处理记录表作记录。

十五、试剂的质检标准操作程序 1．目的：保证每批用于临床实验的试剂的质量良好，符合要求。2．适用范围：各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂。3．负责人： 操作人： 4．程序：

4．1 收到试剂后，目测试剂是否处在冻存状态。

4．2 核对试剂品种和数量并检查包装：外包装（厂名厂址、、批准文号、批号和有效期等）；内包装（试剂瓶完整性、试剂配备品种完整性、使用说明书有否等）。4．3 及时将试剂转入－20℃冰箱保存。将上述检测核对情况在记录本上登记。

4．4 最迟在前批次试剂存量尚可维持常规实验一周时，按如下要求对新批号试剂进行效验实验。

4．5 效验实验：

4．5．1 要求设置：空白对照、阴性对照、阳性对照、室内质控各一，阳性标准品梯度（104、105、106、108）。

4．5．2 出现如下情况中任何一种的，判断为试剂不合格，不能用于临床检测： a）空白对照出现扩增。如扩增曲线CT 值大于25，需重复实验确证试剂污染。

b）阳性对照和阳性标准品均未检出，或阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。

4．5．3 阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液可能存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。更换提取液后该批试剂方可使用。

4．5．4 空白对照无扩增，阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。单独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。

4．5．5 阳性对照检出，阳性标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT 值偏大5 个循环以上。提示阳性标准品存在问题。更换阳性标准品后该批试剂方可投入使用。

4．5．6 空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出，阳性标准品导出的标准曲线之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相关性（﹤－0.99）均在使用范围内，表明该批试剂良好，可以投入临床使用。4．6 将实验结果归入记录。

十六、离心机操作维护程序

1．目的：保证离心机的正常使用。

2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。3．负责人： 操作人： 4.性能参数:见说明书。5．程序：

5．1 离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使仪器处于水平位置以免离心时造成仪器振荡。

5．2 打开电源开关，将预先平衡好的样品对称放置于转头的样品架上，关闭机盖。5．3 旋动定时旋钮设定离心时间，缓慢旋转转速调节旋钮使仪器转速达到预定要求。5．4 离心完毕后，将转速调节旋钮调回零位，关闭电源开关。

5．5 待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，再次关闭机盖结束离心。5．6 离心室的清洁：为了避免样本等残留物的污染，应经常对离心机外壳和离心室进行清洁处理。对离心室清洁，应先打开离心机盖，拨掉电源线，用专用设备将离心机转子旋下，再用中性去污剂（70%的异丙醇/水混合物或乙醇去污染）清洁离心室；离心室内的橡胶密封圈经去污剂处理后，用水冲洗，再用甘油润滑。

5．7 转子的清洁：转子会被样本残留物污染，也可能会被某些化学试剂腐蚀，因此应对转子每月进行清洁维护。每月用中性的清洁剂清洁转子一次，并在仪器维护记录本上作好记录，以延长转子的寿命。6.仪器维护

(1)为确保安全和离心效果,仪器必须放置在坚固水平的台面上,塑料盖门上不得放置任何物品,样品必须对称放置,并在开机前确保已拧紧螺母。

(2)应经常检查转头及试验用的离心管是否有裂纹,老化等现象,如有须及时更换.(3)试验完毕后,需将仪器擦拭干净,以防腐蚀.(4)如样品比重超过1.2g/cm3,最高转速n 按下式计算:n=nmax*√--1.2/样吕比重.(5)当电机碳刷长度小于6mm 时,必须及时更换.(6)在离心机未停稳时不得开盖.(7)仪器必须有可靠接地.(8)实验结束后,请关闭后面的电源开关,拨掉电源插头时,请不要忘了打开后面的电源开关.(9)该仪器在日常使用中请注意符合“5.6,5.7”要求。(10)严格按照仪器的开关机程序关机。7.期间核查

(1)本仪器不需要特别的周期间隔。

(2)校准物均为与ICSH 之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

十七、冰箱操作维护规程

1．目的：对冰箱进行适当的维护，以确保冰箱的正常使用。2．适用范围：本实验室使用的各种品牌、型号的冰箱。3．负责人： 操作人： 4.性能参数:见说明书。5．程序：

4．1 开、关机：冰箱按说明书要求放好后，插上电源线，冷藏室温度开关置于4℃，冷冻室温度开关置于-20℃，2 小时后用温度计确认。系统进入正常运行状态后即可使用。4．2 外冰箱应放置于水平地面并留有一定的散热空间。外接电源电压必须匹配，并要求有良好的接地线。

4．3 冰箱内禁止存放与本实验室无关的物品。

4．4 放入冰箱内的所有试剂、样品、质控品等必须密封保存。

4．5 保持冰箱出水口通畅；非自动除霜冰箱应在每月底除霜；月底清洁冰箱，清洁时切断电源，用软布蘸水擦拭冰箱内外，必要时可用中性洗涤剂。4．6 每日观察冰箱内温度并记录于冰箱的质控图上。

4．7 若温度超出规定范围，调节温控使其回到正常范围，并进行记录。

4．8 若温控调节无效，报请设备科维修，修理后须验收合格并签字后方能正常使用。6.仪器维护

(1)使用注意。该仪器在日常使用中请注意符合“4.注意事项”要求

(2)废液瓶满要及时倒掉废液，切勿强行扯动红黄两根管来打开瓶盖，检查废液瓶是否漏气，防止低真空出现。

(3)当出现堵孔时，按自动冲洗键冲洗管道。(4)严格按照仪器的关机程序关机。7.期间核查

(1 冰箱不需要特别的周期间隔。

(2)校准物均为与ICSH 之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

十八、生物安全柜操作维护规程

1．目的：正确使用生物安全柜。

2．适用范围：本SOP 适用于本实验室使用的生物安全柜。3．负责人： 操作人： 4.性能参数:见说明书。5．程序：

5．1 新安装或长期未使用的生物安全柜，使用前必须用超净真空吸尘器或不产生纤维的物品认真进行清洁工作。

5．2 接通电源，使用前应提前15～30 分钟同时开启紫外灯和风机组工作。

5．3 当需要调节风机风速时，用生物安全柜操作面板上的风速调节钮进行调节。风机、照明均由指示灯指示其工作状态。

5．4 工作台面上禁止存放不必要的物品，以保持工作区的洁净气流不受干扰。

5．5 禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免作明显扰动气流的动作；禁止在预过滤进风口部位放置物品，以免挡住进风口造成进风量减少，降低净化能力。

5．6 使用结束后，用消毒液清理工作台面后打开紫外灯，15～30 分钟后关闭紫外灯，关闭生物安全柜电源。每次使用生物安全柜后，均需对其进行清洁。

5．7 根据环境洁净程度，定期将预过滤器中的滤料拆下清洗，一般间隔时间为3～6 个月。5．8 定期（一般每半年1 次）计测工作区风速，如发现不符合技术参数要求，则可调大风机供电电压。当风机组电压调到最大时，工作区风速仍达不到0.3m/s，则必须更换高效空气过滤器（由厂家或院仪器维修人员进行）。

4．9 有相应的维护记录，长期不使用的生物安全柜拨下电源插头。6.仪器维护

(1)使用注意。该仪器在日常使用中请注意符合“4.注意事项”要求(2)废液瓶满要及时倒掉废液，切勿强行扯动红黄两根管来打开瓶盖，检查废液瓶是否漏气，防止低真空出现。

(3)当出现堵孔时，按自动冲洗键冲洗管道。(4)严格按照仪器的关机程序关机。7.期间核查

(1)PE-5700 基因扩增仪的定标不需要特别的周期间隔，本实验室PE-5700 基因扩增仪执行卫生部临床检验中心的指定校准。

(2)校准物均为与ICSH 之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

十九、移液器操作维护规程

1．目的：确保移液的精确性，正确使用移液器。2．适用范围：本实验室使用的可调式移液器。3．负责人： 操作人： 4．程序： 4．1 移液器的使用

4．1．1 转动旋钮设定移液量，设定的移液量不可超出该移液器规定的范围。4．1．2 装上配套的Tip。4．1．3 前进移液法

a）将按钮压至第一停点位置；

b）将移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深处，然后慢慢松开按钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴撤出液面，擦掉管嘴外侧的所有液滴。

c）轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。约1 秒钟后，继续将操作按钮向下压至第二停点位置。待管嘴液体放干净后，将管嘴贴在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中，撤出管嘴。

d）松开按钮使之回到起点位置。需要时，可更换管嘴继续移液操作。4．1．4 倒退移液法：适用于高粘度液体及/或易起泡沫液体的移液。a）将操作按钮向下压至第二停点位置。

b）将移液管管嘴浸入试剂瓶液面下2~3mm 深处，然后慢慢松开钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴撤出液面，擦掉管嘴外侧的所有液滴。c）轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。

d）遗留在管嘴时的液体或者随管嘴一起扔掉，或者放回原来的容器中。4．1．5 重复操作法：重复操作移液法可以快速、简便地重复转移同体积的同种液体。a）将操作按钮向下压至第二停点位置。

b）将移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深处，然后慢慢松开按钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴贴在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中。

c）轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。待放完所需体积液体后，把按钮停在第一停点位置，不包括在移液量之内的少量液体仍留在管嘴内，管嘴外的液滴则需包括在移液量之内。

d）将管嘴浸入试剂液面下不远处，然后慢慢松开按钮使管嘴重新吸入液体。(3)e）重复步序c）和d）继续移液操作，就可重复转移相同体积液体。4．2 移液器的维护

每天对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭。每周1 次对移液器咀进行75%酒精浸泡15 分钟左右，若使用过程中发生污染应随时浸泡处理。4．3 移液器的校准

为确保移液器加样的精确性和准确性，正确使用移液器，需定期（一年）对移液器进行校准 4．3．1 校准环境和用具要求室温：20～25℃，测定中波动范围不大于±0.5℃。

电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。称量时，为保证天平内的湿度（相对湿度60～90%），天平内应放置一装有10mL 蒸馏水的小烧杯。

小烧杯：5～10mL 体积。测定液体：温度为20～25℃的去气双蒸水。选定校准体积： a）拟校准体积；

b）移液器标定体积的中间体积。

c）最小可调体积（不小于拟定体积的10%）。如为固定体积移液器，则只有一种校准体积。4．3．2 校准步骤

a）将移液器调至拟校准体积，选择合适的吸头； b）调节好天平；

c）来回吸吹蒸馏水3 次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头；

d）垂直握住移液器，将吸头浸入液面2～3mm，缓慢（1～3 秒）一致地吸取蒸馏水 e）将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体；

f）将移液器以30℃角放入称量烧杯中，缓慢一致地将移液器压至第一档，等待1～3 秒，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出； g）记录称量值； h）擦干吸头外面； i）按上步骤称量10 次； j）取10 次测量值的均值作为最后移液器吸取的蒸馏水重量，按表1 所列蒸馏水Z 因子计算体积；

k）按校准结果调节移液器。4．3．3 比较校准法

利用经计量局校准并颁发校准报告之同型号移液器，在移液器量程范围的高低两个档各选择一个校准点

(4)用电子天平称量结果与已校准移液器称量结果进行比较，完成校准。

参考文件：

1.卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增管理办法》的通知 2.卫生部检验中心《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》 3.《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

篇6：检测pcr技术

来源：中国论文下载中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武

【摘要】 检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQPCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果≥4时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996，而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997；而100 000拷贝/L表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。

【关键词】 实时荧光定量PCR；检测限；统计推断

Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR

Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation;Statistical conclusion

检测限是检测方法的重要性能指标，只有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限，该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。能检测到的最低分析物浓度为检测系统的检测限。当前，检测限术语混乱，如：灵敏度(sensitivity)、分析灵敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每个词语的实际含义中包含有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等。我们采用统计学方法，以期得到一致的实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)检测限，现介绍如下。

文献中FQPCR检测限的描述

检测乙型肝炎病毒DNA的文献中检测限使用了“最低检出量”［2，3］、灵敏度［5～7］等术语，它等于已知的高拷贝HBV DNA血清10倍系列稀释后能检测到扩增曲线的最大稀释倍数管浓度。表述有：阴性HBV DNA≤106拷贝/升［4］；荧光定量PCR法检测灵敏度102拷贝/ml［5］、104拷贝/ml［6］、8.6×102拷贝/ml［7］；HCⅡ法检测灵敏度1.4×105拷贝/ml［7］；103 Eq/ml理论值时到达检测极限［3］；PCRFP检测HBV DNA的最低检测出量1×101拷贝［2］；bDNA在105 Eq/ml时到达检测极限［3］。以上检测限术语各不相同，且同一方法检测HBV DNA在上述各实验室发出同样的“HBV DNA低于检测下限”的报告时其实际HBV DNA拷贝数相差可达100倍。

FQPCR检测过程简介

以测定血清乙型肝炎病毒DNA为例：将40 μl血清样本加40 μl DNA提取液处理后，将其中2 μl（相当于1 μl血清）加入主反应液（含DNA引物、酶、DNA构件分子dNTP等）管中，在自动热循环上进行温度循环，自动热循环仪记录每一反应管在每一次温度循环的荧光强度，记30次温度循环后结束。在PCR循环过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数称为Ct值（Cyclethreshold),它与反应管中DNA起始拷贝数的对数值（lgN)呈非常显著的直线相关关系。自动热循环仪对标准样品自动生成一条Ct值对于起始拷贝数值（lgN)的工作曲线，并通过该工作曲线来确定待测未知样品反应管的起始拷贝数（N）。当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号时，仪器默认Ct值为30，不计算起始拷贝。确定FQPCR检测限的统计学原理

如果被检物的含量和检测方法的空白响应量的波动服从正态分布规律，则检测限可用多次检测空白的方法来确定。可信限为95%时检测限＝x空白+2.s空白；可信限为99.7%时检测限=x空白+3.s空白。这是目前多数检测限的确定方法。对核酸检测方法的检测限的理解可能与此有差别，但是原理应是一致的［1］，FQPCR检测限也应是推论总体与空白有统计学差异的最小抽样结果。

FQPCR检测限的统计推断

假设病原体在血液等体液中的分布是随机的，则单位体积中(如1.0 μl)病原颗粒数的分布服从Poisson分布。以Poisson分布的概率函数公式计算一次抽样检测出现的结果推论总体概率。从理论上来说，使用PCR测定技术测定病原体核酸序列的量可低至1个拷贝［2］。例如：血清标本中加入等量的DNA提取液，于离心管中煮沸，4 ℃放置，离心，吸取上清液2 μl作模板 进行扩增检测(2 μl上清液相当于抽样1 μl血清)［2］，其中至少有1个拷贝的HBV DNA才能有典型扩增反应，这时检测结果是1拷贝/μl。由Poisson分布的概率函数公式可计算出1次抽样检测结果出现0时，推断总体为1～9的概率见表1。

表1 总体为1～9时抽样为0的概率及总体（略）

在FQPCR检测HBV DNA中，当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号(即当Ct≥30)，反应管检测结果为0时，推论总体拷贝数为1～9的概率之和>0.581 92，总体为其他的概率之和<0.5(此时报告0拷贝的可信限度低于50%)。总体为1时一次抽样结果分别为1～9时的概率见表1。当一次抽样结果≥4时，推论总体为1的概率≤0.015 33，所以对于病原体的检测，一次抽样反应管检测结果≥4拷贝时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而上述检测血清中病原体时一次抽样反应管的检测限是4拷贝/μl。当总体为1、2、3时一次抽样结果为0的概率分别是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室间质量评价样本靶值选择1拷贝/μl、2拷贝/μl、3拷贝/μl时，无论实验室实际检测质量如何高，都将有36.79%、13.53%、4.98%的实验室检测结果为0而被判为不符合［按靶值的对数值GM±0.5 log(10)［9］作为可接受的定量范围］。2005年卫生部室间质量评价中靶值为1.51拷贝数/μl的样本符合率仅35.2%；Mancini C 等［9］报道一些实验室对检测下限附近的样本(3.00 log IU/ml)准确定量有困难；Raggi CC等［10］也报道28.6%的实验室(12/42)对最低浓度的样本不能定量。这些都是因为检测下限附近的样本一次抽样结果为0的概率太大所致，对此我们将另文详细讨论。造成上述文献中检测限差异较大的可能原因如下：用于10倍系列稀释的已知高拷贝HBV DNA血清本身拷贝数的差异；对检测限的理解差异，由一次抽样没能检测到典型扩增的稀释血清管推论总体浓度为0的可信度太低(<50%)；抽样单位的任意放大：在上述HBV DNA检测中，抽样单位是1 μl血清［如血清前处理过程中有抽提(浓缩)过程，取2 μl上清液相当于实际含12.5 μl血清，则抽样单位也只是12.5 μl］，而报告结果的单位是ml甚至L。当总体为1拷贝/μl时表示一次抽样结果为0的概率达0.368，结果在0拷贝/μl～4拷贝/μl的概率为0.996；而总体为1 000拷贝/ml时表示一次抽样结果为0的概率为0，结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997(Poisson分布总体>50时近似正态分布，范围是X±uα*√X，可信限为99.7%时uα=3);总体为100 000拷贝/L时表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR检测为例，其他病源体核酸的FQPCR检测也与其相同，检测限是抽样反应管的检测限4拷贝/反应管；如反应管中加入模板量相当于12.5 μl血清则检测限相当于0.32拷贝/ μl。此推断仅是针对FQPCR技术本身的检测限度，未就临床上有意义的最小病源体核酸的拷贝数进行讨论。【参考文献】