耐药位点突变

耐药位点突变（精选四篇）

耐药位点突变 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2010年2月-2014年2月收治的慢性乙型肝炎患者350例, 所有患者均已确诊, 符合《慢性乙型肝炎防治指南》[3], 其中男190例, 女160例, 年龄30~65岁, 平均年龄 (40.5±1.8) 岁, 病程1~16年, 平均病程 (6.2±1.5) 年。该研究已获取我院伦理委员会批准, 所有患者在入组前均已签署知情同意书, 该次研究按照患者在治疗过程中是否运用核苷酸类似物, 如阿德福韦、拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦等分为用药组和未用药组, 用药组患者310例, 未用药组40例。

1.2 方法

1.2.1 仪器

该次研究检测试剂盒产自亚能生物有限公司, DNA的提取采用离心柱法, 检测过程中的仪器主要包括聚合酶链反应仪、恒温杂交仪及低温离心机等。

1.2.2 方法

(1) 提取乙型肝炎病毒DNA, 提取过程可包括裂解、变性、结合、洗涤Ⅰ、洗涤Ⅱ、干燥、洗脱和保存。 (2) 扩增PCR, 将PCR反应管离心后, 置入待测样品, 另取反应管加入质控品, 并按照说明书上行PCR扩增。 (3) 杂交, 取塑料离心管, 放入膜条, 加A液, 并将产物放入A液, 沸水浴煮沸10 min后置入杂交管, 另外取离心管, 置入B液, 并进行预热。 (4) 洗膜并孵育后, 参照说明书进行显色。

1.3 统计学方法

该研究采取SPSS 17.0统计学软件进行数据的分析, 采取t检验及χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙型肝炎病毒基因分型

350例患者标本均成功扩增阳性条带, CC显色正常, 且质控品也显色良好, 未见污染, 基因分型分为:B型261例, C型80例, D型9例。

2.2 乙型肝炎病毒基因耐药性位点突变

采用核苷酸类似物的310例患者中265例均为完全野生型, 其余45例耐药突变点主要以204, 204/180位点为主, 具体突变情况如下: (1) 单位点突变, 204位点突变19例 (42.2%) , 180位点突变2例 (4.4%) , 其他位点突变1例 (2.2%) ; (2) 两位点突变, 204/180位点突变14例 (31.3%) , 236/181位点突变2例 (4.4%) , 207/204位点突变1例 (2.2%) ; (3) 三位点突变, 181/180/236位点突变1例 (2.2%) , 204/180/181位点突变1例 (2.2%) 。未用核苷酸类似物的40例患者未见耐药点突变现象。

2.3 乙型肝炎病毒耐药位点突变和临床因素的相关性分析

耐药突变和患者年龄、性别、HBV DNA载量、ALT指标、HBe Ag等无明显相关性 (P>0.05) , 与患者应用核苷酸类似物有关, 且时间越长突变概率越大 (P<0.05) , 见附表。

3 讨论

综上所述, 该研究为分析探讨基因分型同耐药位点突变在乙型肝炎的相关性特选取慢性乙型肝炎患者350例, 采取聚合酶链反应-反向点杂交方法检测患者耐药位点和基因分型, 收集患者性别、年龄、血清乙型肝炎病毒 (HBV) DNA载量、ALT指标、核苷酸类似物用药时间及HBe Ag指标等临床资料进行统计学分析, 结果表明350例患者标本均成功扩增阳性条带, 肝炎病毒基因分型如下:B型261例, C型80例, D型9例;应用核苷酸类似物的310例患者中265例均为完全野生型, 余45例耐药突变点主要以204, 204/180位点为主, 未用核苷酸类似物的40例患者未见耐药点突变现象。耐药突变和患者年龄、性别、HBV DNA载量、ALT指标、HBe Ag等无明显相关性 (P>0.05) , 与患者应用核苷酸类似物有关, 且时间越长, 突变概率越大 (P<0.05) 。

摘要：目的 分析探讨基因分型同耐药位点突变在乙型肝炎的相关性。方法 选取我院2010年2月-2014年2月收治的慢性乙型肝炎患者350例, 采取聚合酶链反应-反向点杂交方法检测患者耐药位点和基因分型, 收集患者性别、年龄、血清乙型肝炎病毒 (HBV) DNA载量、ALT指标、核苷酸类似物用药时间以及HBe Ag指标等临床资料进行统计学分析。结果 350例患者标本均成功扩增阳性条带, 肝炎病毒基因分型如下:B型261例, C型80例, D型9例;应用核苷酸类似物的310例患者中265例均为完全野生型, 其余45例耐药突变点主要以204, 204/180位点为主, 未用核苷酸类似物的40例患者未见耐药点突变现象。耐药突变和患者年龄、性别、HBV DNA载量、ALT指标、HBe Ag等无明显相关性 (P>0.05) , 与患者应用核苷酸类似物有关, 且时间越长, 突变概率越大 (P<0.05) 。结论 HBV基因分型主要以B型为主, PCR-反向点杂交方法可有效的对突变位点和基因分型进行检测, 突变位点与核苷酸类似物有关, 对临床上患者用药具有重要的指导意义。

关键词：乙型肝炎,基因分型,耐药位点突变,相关性探讨

参考文献

[1]叶非, 李晓鸥, 过建春, 等.32例慢性乙型肝炎患者HBV P区的多位点耐药突变分析[J].中华实验和临床病毒学杂志, 2011, 25 (3) :208-210.

[2]郑志远.乙型肝炎基因分型同耐药位点突变的关系研究[J].国际检验医学杂志, 2015, 36 (13) :1905-1907.

耐药位点突变 篇2

关键词：耳聋基因突变,基因检测,基因芯片

据统计结果显示[1], 我国聋哑人占全国残疾人总数的1/3, 全国一共有两千多万聋哑人, 是目前我国一个较为特殊的群体[1]。耳聋是临床上比较常见的遗传病, 也是影响人类生活及其健康比较常见的疾病。因为自身的疾病, 在现实中聋哑人极少能和健康人结婚生活, 但是在聋哑人这个群体当中, 因为相同的文化背景和共同的语言, 逐渐的形成了“聋与聋”的婚配形式, 这样的话也能增加遗传的几率, 令我国聋人的出生率直线上升[2]。那么应该怎样降低或者是预防这些聋儿的出生率, 成为目前社会应该重视的问题, 为了探讨和分析运用基因芯片法检测耳聋患者人群中的突变基因, 并分析器耳聋预防与阻断中的临床应用价值, 现选取2012年3月—2013年2月来该院检查治疗的58例聋哑人为研究对象, 报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究选取来医院检查治疗的聋哑人共58例, 其中聋人夫妇患者共有8对, 来自于耳聋学校的学生患者共有42例。其中, 女30例, 男28例。

1.2 检测方法

1.2.1 检测仪器与试剂

采用E-Cycler TM96PCR检测仪和Bio Mixer TMⅡ芯片杂交仪以及Slide Washer TM8芯片洗干仪器, 全血基因组DNA提取试剂盒由上海华舜生物工程公司制造。

1.2.2 DNA的提取

采用内含EDTA抗凝剂的真空采血管来对于受检者的外周静脉血进行2 m L的采集, 通过小剂量的全血基因组DNA提取的试剂盒来提取其DNA, 然后通过BECKMAN-DU800紫外分光光度计来开展定量与纯度的检测。

1.2.3 基因芯片的检测方法

对于PCR扩增方法依照被检测的样品数目的2倍准备200μL离心管, 然后在离心管上标记下样品编号, 该两套管应当对应。按照PCR反应试剂盒说明来配置其反应体系, 主要包括PCR扩增引物混合物A112.5μL和基因组DNA3.0μl以及PCR扩增试剂混合物A24.5μL, 合计为20.0μL。杂交方法是把PCR产物加热到95℃变性5 min, 然后立即浸入到冰水混合物中再冰浴3 min。自两个不同的扩展体系管内各抽取2.5μL的PCR产物, 并加入至10μL的杂交缓冲液管内。把混合液加至芯片的点样区域, 之后加盖玻片, 然后再封闭杂交仓, 并放入到温度为50℃的杂交仪内孵育1 h。在取出芯片后, 放进洗干机内进行洗涤并快速甩干。最后一步是扫描, 运用晶芯扫描仪与之对应的遗传性耳聋基因检测芯片的判别系统实施信号的读取和判断确认。

2 结果

经过对耳聋患者通过基因芯片数据检测, 结果显示共有25例患者存在致聋基因突变, 占比例为43.10%。属于野生型共31例, 占到53.44%。属于GJB2基因突变的共11例 (18.97%) , 其中包括235del C位点纯合突变型共2例 (3.45%) , 属于235del C位点杂合突变型的共5例, 属于235del C和176del16位点复合杂合突变型的共2例 (3.45%) , 属于299del AT位点杂合突变型的共5例 (8.6%) ;属于SLC26A4基因突变的共21例 (36.21%) , 其中包括2168A>G位点杂合突变型的共2例 (3.45%) 和IVS7-2A>G位点纯合突变型的共5例 (8.62%) 以及IVS7-2A大于G位点杂合突变型的共14例 (24.13%) 。

3 讨论

聋病史是当前社会造成人类残疾与影响人类健康的常见疾病。统计结果显示[3], 倘若有一千个新生儿, 那么在这其间就有1~3个是聋儿, 而有一半以上的聋儿是遗传因素导致的。我国在2006年12月公布了对残疾人的调查结果, 结果显示, 听力有障碍的大概有2004万人, 占所有残疾人比重的首位。导致耳聋的原因多种多样, 研究结果显示[4]:有60%的聋儿是因为遗传的缘故, 而剩余的40%耳聋的人则是受生活环境的影响。截至到目前, 发现导致耳聋的原因很多, 但是经过流行病学的分析研究[5], 发现例如SLC264以及GJB2等少数基因在耳聋人群中占有的比例比较高。所以相对而言, 急于需要一种准确性较高而且既简单又快速的基因检测方式。

基因芯片技术的根本原理为核算杂交, 也就是说, 采用合成后点样或者是原位合成等方法把一些特定的DNA探针固化在支持物的表面, 与我国比较传统的基因检测方式, 对设备要求不高, 而且简单方便, 通量高, 也能确保准确性, 是我国目前医学临床上检测DNA的金标准[6]。

关于对这类人群开展咨询工作时, 应以以下几点为主。

①有效地控制聋儿的出生率, 减少聋病的发生概率。

②在我们检测的人群中, 有一对育龄夫妻双方均携带SLC26A4单杂合突变基因, 那么这对夫妻生育聋儿的可能性高达25%, 所以, 在生育之前, 需要对孕妇进行产前检查和诊断, 进而来预防和降低聋儿的出生概率[7]。因为聋人的情况在现实中都比较特殊, 所在他们在生育之前需要做基因检测, 最好是认识到自己耳聋的病因, 彻底的认识这种病症, 最好是不要和遗传性耳聋的人进行婚配。

③从遗传学的角度出发, 找出导致耳聋的病因。

④最好是不要和遗传性耳聋的人进行婚配。比如说聋人夫妻中四条等位基因都发生了GJB2突变, 那么毫无意外的他们后代将遗传到两条GJB2等位基因, 那么遗传耳聋的概率基本上为100%[8]。所以说应该在婚育到医院进行诊断, 最大程度上降低我国聋儿出生的概率。

综上所述, 随着对中国人遗传性耳聋认识的深入了解以及科学的进步, 阻断并预防遗传性耳聋已经不是难以攻破的难题, 而一些在妇幼保健所工作的人员更应该利用诊断耳聋基因的环境以及优势, 避免聋儿出生或者是减少聋病的发生概率。

参考文献

[1]袁永一, 戴朴, 黄德亮, 等.内蒙古赤峰市聋校聋儿SLC26A4基因分析[J].中国耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2007, 5 (14) :251.

[2]韩冰, 戴朴, 王国建.相同表型不同基因型耳聋夫妇家庭的遗传咨询与指导[J].中华耳鼻喉头颈外科杂志, 2007 (42) :499.

[3]金鹏, 于姝媛, 祝威, 等.应用基因芯片技术对一近亲婚配耳聋家系致聋机制的分析[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2011, 52 (4) :368.

[4]张伟, 龚树生, 黄丽辉, 等.聋病分子遗传学快速诊断技术在临床上的应用[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2011, 23 (13) :144-145.

[5]谢兰, 郭永, 黄国亮, 等.疾病个性化诊断相关的转化医学尝试[J].转化医学研究 (电子版) , 2011, 56 (1) :309.

[6]HutchinT, Coy NN, Conlon H.et al.Assessment of the genet-ic cause so frece ssive child hood syndromic deafness in the UK-implications for genetic testing[J].ClGenet, 2005, 68 (6) :506.

[7]张华, 刘宇清, 王幼勤, 等.遗传性耳聋基因芯片检测及其临床意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009, 13 (22) :175.

耐药位点突变 篇3

MLCK分子作为平滑肌收缩调节的关键蛋白质,除具有磷酸化肌球蛋白20KD轻链的激酶作用外,还具有N末端的肌动蛋白结合活性和C末端与肌球蛋白结合的非激酶活性[3]。MLCK的非激酶作用可能在平滑肌收缩的调节中产生一定的影响。我们利用大肠杆菌表达重组全长MLCK并对其进行人工定点突变开展MLCK结构与功能学的研究,为进一步阐明MLCK的非激酶调节作用以及激酶作用与非激酶作用之间的联系提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

试剂和仪器:限制性内切酶购自New England BioLabs(Beverly,MA,USA);混合蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail)购自Sigma公司;标准白蛋白(Albumin standard)购自piercent公司;过硫酸胺(AP)、双丙烯酰胺(Bis)、丙烯酰胺(AA)、十二烷基硫酸钠(SDS)购自Sigma公司;。Bio-Rad蛋白检测液(Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate)购自美国Bio-Rad公司;CP100型超速离心机、CR21E型高速离心机(日本日立公司)。

1.2 方法

(一)MLCK的ATP结合位点定点突变表达载体的构建

牛胃平滑肌MLCK全长编码区的pCold I表达载体(pCold/BsMLCK)由日本群马大学小滨一弘教授馈赠;MLCK的ATP结合位点定点突变表达载体(pCold/BsMLCK/△ATP)是以pCold/BsMLCK为模板,定点突变Gly732,Gly734,Gly737为Ala。突变引物为:5?-GCATCTGCGAAATTTG-CACAGGTCTTTCGAC-3?;5?-TGTGCAAATTTCGCAGATGC-TAGTCTCTCTTCG-3?。

(二)牛胃平滑肌重组全长MLCK/△ATP的表达

转化MLCK/△ATP重组质粒到BL21(DE3)/CodonPlus RP感受态中,37℃培养。当菌液的O.D600nm值达到0.4~0.6,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,15℃继续培养。另设无IPTG的对照组。离心收获细菌,保存于-80℃。

(三)重组平滑肌MLCK/△ATP的分离及纯化(以下蛋白纯化除特殊注明外均在0-4℃条件下进行)

将菌体重悬于20ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1mM Mg-acetate、1mM imidazole、1mM DTT、0.1mM PMSF、10%glycerol、2mM CaCl2、1%NP-40、1mg/ml lysozyme)中,冰上孵育1小时。超声破碎细菌,取上清,采用CaM-Sepharose 4B进行纯化。用10倍柱体积平衡缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1mM Mg-acetate、1mM imidazole、1mM DTT、2mM CaCl2)平衡层析柱。待上清全部上样后,再用10倍柱体积平衡缓冲液清洗柱子。缓慢加入20ml预冷的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、2mM EGTA、1mM dithiothreitol(DTT)),收集洗脱液。SDS-PAGE检测收集的样品。使用Amicon Ultra-4 Centrifugal filter(Milipore)浓缩并收集蛋白液。应用Superose 6 HR分子筛进一步纯化蛋白。12%SDS-PAGE检测纯化结果。

2 结果

2.1 重组MLCK/△ATP的表达

MLCK/△ATP重组质粒在BL21(DE3)/CodonPlus RP中进行表达。经超声破碎菌体,离心后获取上清及沉淀。采用12%SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色后得到表达条带(Figure 1)。图中可见未加IPTG的上清及沉淀中MLCK/△ATP表达条带不明显,加入IPTG诱导剂的上清及沉淀中有明显的MLCK/△ATP表达条带。其中,1-5单克隆均在155kD处有大量可溶形式的表达蛋白存在,表达的条带如箭头所示。

Marker:Molecular Weight Marker Lane1-6:the supernatant and precipitate with IPTGinduced Lane7:the supernatant and precipitate without IPTGinduced(the arrow indicates the full length of MLCK/△ATP)

2.2 重组全长MLCK/△ATP的纯化

(1)采用CaM-Sepharose 4B亲和层析分离纯化表达的MLCK/△ATP,收集的洗脱液,经SDS-PAGE检测其纯度(Figure 2);(2)收集上述蛋白洗脱液,用Superose 6 HR凝胶过滤进一步分离纯化,获得较纯的单一表达条带(Figure 3)。

M:Molecular Weight Marker Lane1-9:the elution fractions of MLCK/△ATP(The arrow shows purified MLCK/△ATP)

Lane1-8:the elution fractions of full-length MLCK/△ATP(The arrow shows purified full-length MLCK/△ATP)

3 讨论

平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kianse,MLCK)作为调节平滑肌收缩的关键蛋白质,可以通过与二价钙离子/钙调蛋白的结合,使肌球蛋白20kD轻链磷酸化,进而激活肌球蛋白的ATP酶活性引起平滑肌收缩。作为平滑肌收缩调节的关键蛋白质之一,MLCK除具有磷酸化肌球蛋白20kD轻链的激酶作用外,还具有N末端的肌球蛋白结合,C末端的肌动蛋白结合活性以及在无钙离子,不使肌球蛋白轻链磷酸化的状态下提高非磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性等非激酶作用[4,5,6,7]。我们认为MLCK的这些非激酶作用在平滑肌收缩与舒张过程中发挥着一定的调节作用。

利用大肠杆菌大量表达重组MLCK分子将促进人们对MLCK分子多功能的解明。而MLCK分子功能的阐明也会对平滑肌收缩机制作出更明确的解释,为心脑血管疾病的病因研究及新药开发作出贡献。我们利用分子生物学技术对MLCK的功能区进行定点突变,构建了MLCK分子ATP结合位点突变体。通过对ATP结合位点突变体的比较分析将有助于MLCK非激酶活性的研究。我们对重组全长MLCK激酶域的ATP结合位点进行定点突变,在最大程度保持MLCK整体结构完整的基础上获得了失去激酶活性的MLCK突变体。

MLCK磷酸化平滑肌肌球蛋白轻链启动平滑肌收缩的机制虽然已经被广泛公认,但在平滑肌收缩中并不是所有现象都可以用上述机制给与合理解释。提示在平滑肌收缩调节中除上述的传统机制外还存在着其他调节机制,MLCK分子可能在这些调节过程发挥一定的作用。有报道表明组织中提取的天然野生型MLCK对肌球蛋白有非激酶调节作用,即激活非磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性,抑制磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性[8]。但这些调节作用无法排除MLCK激酶作用的影响。

在大肠杆菌中表达成功重组全长MLCK为深入研究MLCK的非激酶作用以及激酶与非激酶作用之间的联系提供了可能。

参考文献

[1]Oishi K,Takano-Ohmuro H,Minakawa-Matsuo N,et al.Oxytocin contracts rat uterine smooth muscle in Ca2+-free medium without any phosphorylation of myosin light chain[J].Biochem Biophys Res Com-mun.1991,176(1):122-128.

[2]Sato K,Hori M,Ozaki H,et al.Myosin phosphorylation-indepen-dent contraction induced by phorbol ester in vascular smooth muscle[J].J Pharmacol ExpTher.1992,261(2):497-505.

[3]崔颖,李晓丽,梁明丽等.平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP酶活性的调节[J].中国生物化学与分子生物学报.2007,23(5):375-381.

[4]Gao Y.Myosin light chain kinase stimulates smooth muscle myosin ATPase activity by binding to the myosin heads without phosphorylating the myosin light chain[J].Biochem Biophys Res Commun.2003,305(1):16-21.

[5]Lihong Ye,Kazuhiro Kohama.The Structure and Function of the Actin-binding Domain of Myosin Light Chain Kinase of Smooth Muscle[J].The Journal of Biological Chemistry.1997,272(51):32182-32189.

[6]Nakamura A,Xie C,Zhang Y,et al.Role of non-kinase activity of myosin light-chain kinase in regulating smooth muscle contraction[J].2008,369,135-143.

[7]梁明丽,崔颖,吕广艳,等.肌球蛋白轻链激酶非激酶活性调节磷酸化肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动[J].生物化学与生物物理进展,2008,35(1):91-96.

耐药位点突变 篇4

1 对象与方法

1.1 实验对象

COPD组:2009年10月-2010年7月我院呼吸内科门诊及住院的COPD患者84例,均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》中的相关诊断标准[2],即吸入支气管扩张剂后第1秒钟用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%。入选标准:本市常住居民,无长时间接触特殊化学物品及物理射线等;排除标准:支气管哮喘、支气管扩张症等其他呼吸性疾病。其中男71例,女13例,详细记录病程长短及年龄。对照组:同期健康体检者96例,男78例,女18例,年龄35～75岁,无COPD、支气管哮喘等疾病。2组性别、年龄、吸烟指数比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的提取及鉴定:

采静脉血2ml,抗凝,2000r/min离心20min,吸取白细胞层,参照改良碘化钠法提取基因组DNA,取5μl加有载样缓冲液的DNA产物,加样至含有溴化乙锭的4%琼脂糖凝胶中进行电泳检测(按DNA提取试剂盒提取)。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR)及产物鉴定:

引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应总体系为15μl,含提取基因组DNA 0.5μl,10×Buffer缓冲液 1.5μl,Taq DNA聚合酶0.5U,2.5mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合物0.3μl,氯化镁(MgCl2)溶液1.2μl,上、下游引物(5′AAGCAGGAGAGTGGACAAGAG 3′,5′AACCATAACTGCCACTGTGCT 3′)各0.2μl,蒸馏水(dH2O)11μl。取6μl加有载样缓冲液的PCR扩增产物,加样至含有溴化乙锭的4%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。上、下游引物扩增长度均为164bp,PCR反应条件:95℃预变性5min,95℃变性30s,66℃退火30s,72℃延伸60s,共20个循环。

1.2.3 限制性片段长度多态性(RFLP)反应及产物鉴定:

PCR产物加入限制性内切酶体系,置37℃恒温水浴箱中消化3h,取15μl有载样缓冲液的酶切产物,加样至含有溴化乙锭的4%脂糖凝胶中进行电泳检测。

1.2.4 序列测定:

选取初步确定的基因型样本用PCR扩增,扩增后PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行双向PCR产物测序反应,将测序结果采用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的BLAST软件与数据库中已登陆的序列进行同源性分析,以验证PCR-RFLP分析ADAM33基因相关位点多态性的正确与否。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计数资料以率(%)表示,组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ADAM33基因S2位点PCR扩增产物及酶切电泳

PCR扩增产物凝胶电泳分析为1条DNA条带,长度为164bp。PCR扩增产物经限制性内切酶后可得到3种DNA条带:(1)突变纯合子基因型:酶切后为1个片段,凝胶分析显示为1个条带(基因型:C/C,条带为164bp);(2)杂合子基因型:酶切后为3个片段,凝胶分析显示3个条带(基因型:C/G,条带分别为164、100、64bp);(3)野生纯合子基因型:酶切后为2个片段,凝胶分析显示为2个条带(基因型:G/G,条带分别为100、64bp)。

2.2 2组ADAM33基因S2位点基因型频率比较

COPD组C/C、C/G基因型频率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2组G/G基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 基因型频率与COPD病程长短的关系

C/C、C/G、G/G基因型频率与COPD病程长短比较无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 基因型频率与COPD患者年龄的关系

C/C、C/G、G/G基因型频率与COPD患者年龄大小比较无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3 讨 论

ADAM33基因是近年来新发现的与多种呼吸性疾病有关的基因之一,为解整合素—金属蛋白酶(ADAM)的家族成员[3]。人类ADAM33基因广泛表达,在肺、大脑、心脏、肾脏、睾丸等组织中呈高表达。Sadeghnejad等[4,4]研究表明,ADAM33基因中的5个SNPs(S1、Q-1、V4、V-1、S2)与COPD发病有关。同年,我国学者Wang等[4,4]发现,东北汉族人中ADAM33基因中的4个SNPs(Q-1、T1、T2、S2)与COPD存在关联。

本研究结果显示,COPD组ADAM33 SNPs S2 C/C、C/G基因型频率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),表明SNPs S2位点突变与COPD发病有关,与相关文献[4,4]结果一致。

综上所述,ADAM33基因S2位点突变与COPD发病有关,但通过对其突变纯合子和杂合子与患者病程、年龄进行分析,均未发现相关性,说明ADAM33基因S2位点突变与患者病程、年龄无关。但患者病程长短及年龄大小却能反映疾病发生的早晚,即先天性还是后天性,从而推测ADAM33基因S2位点突变为先天性基因突变。但本实验样本量偏小,且为回顾性研究,需要加大样本量,或者做前瞻性研究加以证实。

参考文献

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