大肠埃希氏杆菌

大肠埃希氏杆菌（精选七篇）

大肠埃希氏杆菌 篇1

1 临床资料

1.1 入选标准

入选前1周内结肠镜检查确定病变局限于直肠,且病变范围距离肛门≤10 cm。符合轻、中度溃疡性直肠炎的门诊或住院患者。诊断符合中华医学会消化病学分会对炎性反应性肠病诊断治疗规范的建议,病情轻、中度符合Edwards和Fru-elove综合分类标准,年龄18～60岁,男女不限。

1.2 排除标准

①妊娠期或哺乳期妇女;②有严重心、肝、肺、肾、内分泌疾病,造血功能障碍、恶性肿瘤的患者;③对治疗药物过敏或高敏体质者;④正在或在3个月内参加其他临床试验者;⑤近月内应用长效皮质激素、近半年内应用其他免疫抑制剂及磺胺类药物者;⑥因精神状态不佳,不能很好合作者;⑦粘膜活检组织学诊断是肿瘤或其他疾病者。

1.3

2007年1月至2008年7月共观察门诊就诊的患者符合上述诊断标准共150例,其中男111例,女49例;以抽签法分为灭活埃希的松软膏组(治疗组),SASP栓对照组(对照组1)和醋酸氢化可的松软膏组(对照组2),三组患者性别及病程比较见表1。三组患者均全部完成临床观察。治疗前三组患者停用一切影响溃疡性结肠炎治疗药物至少1周。治疗期间三组患者均避免进食海鲜,牛奶,酒,辛辣刺激等可能诱发加重病情的食物。

1.4 方法

试验设计按照随机对照的试验要求,用抽签法将符合纳入标准的受试者分组。试验过程中不得加抗炎药等影响疗效评价的药物。药品选择及用法用量:试验组,用灭活埃希的松软膏,25 g/支,德国卡德博士药厂生产,商品名:玻特利油膏;对照组1,SASP栓剂(山西三九同达药业有限公司生产,0.5 g/颗),2次/d,1颗/次纳入肛内;为解灭活埃希的松软膏中含有的少量氢化可的松是否对治疗有影响设置对照组2,使用广州何济公制药厂生产的1%醋酸氢化可的松软膏。为准确用药量,软膏均用注射器抽出后接上剪短为6 cm的静脉注射胶管注入肛内。玻特利油膏每次用药4 ml,2次/d;因玻特利油膏内含0.25%氢化可的松,故对照组2使用1%醋酸氢化可的松软膏1 ml,2次/d;三组疗程均为4周。

1.5 疗效观察指标及疗效判断标准

症状指标:治疗前和治疗第4周末随访观察,记录治疗前和治疗第4周末患者情况①排便次数;②粘液便或脓血便性状;③肛门坠胀感。排便次数评分标准:0分=大便少于2次/d;1分=排便3～4次/d;2分=排便5～6次/d;3分=排便多于7次/d。脓血便评分标准:0分=无;1分=偶见(粪便中不经常见到,偶尔能见到);2分=经常少量(在每次粪便中均能见到少量);3分=大量(每次粪便中见到且量较大)。肛门坠胀感评分标准:0分=无;1分=偶尔感到有轻度肛门坠胀;2分=经常感到有轻度肛门坠胀;3分=明显的肛门下坠感,影响工作和生活。

1.6 肠镜和肛门镜检查

治疗前先进行全结肠镜检查明确病变程度和病变范围距肛门口≤10 cm,并做粘膜活检以除外其他疾病。治疗前及治疗结束行肛门镜检查,记录肛门镜下所见的充血、水肿、粘膜糜烂等征象,以及病变范围、溃疡面积。肛门镜评分标准:0分=正常肠粘膜或轻微充血;1分=明显充血未见溃疡;2分=充血和散在的点状溃疡; 3分=充血、密布的点状溃疡;4分=充血、水肿和成片的溃疡、或伴有炎症息肉形成。

1.7 疗效的综合评估

试验结束时,对疗效进行综合评估。根据三组患者治疗前、治疗4周末的症状积分,进行症状改善评分。根据三组患者治疗前和治疗4周末肛门镜检查变化情况及其程度进行肛镜下黏膜改善程度记分。疗效等级评定:根据治疗后总分数/治疗前总分数的百分比判定临床疗效。临床控制:小于≤25%;显效:25%～50%;好转:50%～75%;无效:>75%。有效率(%)=(临床控制例数+显效例数)/病例总数×100%。

1.8 不良反应指标及评估标准

每次就诊或随访时观察和记录患者的不适表现,并询问其发生时间、严重度、频度、持续时间、采用措施与结局。记录试验中出现的全部不良事件,发生的反应与药物之间的关系分为:肯定有关、可能有关、可能无关、肯定无关及无法判定5个等级。前两者结论为不良反应,需纳入不良反应病例中统计。不良反应发生率=不良反应例数/总例数×100%。

1.9 统计学方法

统计学数据以百分比差表示,计数资料比较采用χ2检验。

2 结果

第4周试验结束时灭活埃希的松软膏组症状改善及镜下改善有效率为60%和66%,优于柳氮磺吡啶(SASP)栓组的48%和50%,明显优于1%醋酸氢化可的松软膏组(P<0.05) 。见表2、3。

可能是疗程较短的原因,三组患者均未发现不良反应。

注:与对照组1、2比较,P<0.05

3 讨论

溃疡性直肠炎目前尚缺乏满意的治疗方法。虽然发病机制不明,但与免疫功能紊乱密切相关,也与大肠埃希氏杆菌关联密切。以色列研究人员Rachmilewitz报道,在实验性和特发性结肠炎小鼠模型中,使用免疫刺激性细菌DNA可减轻结肠炎性反应。另外,这种DNA可在体外抑制Crohn病或溃疡性结肠炎患者活组织检查标本促炎介质的释放[3]。竹田多惠[4]研究发现在UC患儿血清中检出大肠埃希菌025LPS抗体。KRUIS等进行了双盲、双模拟试验表明大肠埃希菌Nissle 1917株在维持UC患者缓解的有效性和安全性方面等同于美沙拉嗪[5]。

灭活埃希的松软膏的活性成份为灭活大肠埃希氏杆菌细菌培养液(BCS)和0.25%氢化可的松,临床用于痔及其严重并发症治疗,笔者发现有患者使用后溃疡性直肠炎病情得到缓解而做进一步临床对比观察。生产厂家提供的基本药理示:BCS经直肠给药后(大鼠和豚鼠模型),通过粘膜迅速吸收。激活特异性和非特异性免疫应答。动物模型和体外实验表明,BCS可激发T-淋巴细胞的增殖和免疫球蛋白(IgA、IgG)的产生,提高机体相关组织的感染的预防和抵御能力。在体外,冷冻干燥的BCS在体外抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺,有抗炎的作用。在体外模型中,各种细胞因子的引入说明这些细胞因子有可能参与组织修复,促进伤口愈合。动物和人的试验模型表明,BCS对炎性皮肤和伤口愈合有免疫反应。用含BCS的治疗之后,水肿渗出可迅速消失。BCS和氢化可的松发挥互补的作用。BCS激发的免疫药理作用并不被氢化可的松破坏。由BCS促进的伤口愈合也不会被氢化可的松破坏。氢化可的松的急性抗炎作用由BCS导致机体抵御能力加强而得到补充。由于氢化可的松的比例仅为0.25%,笔者认为灭活埃希的松软膏起主要治疗作用的还是灭活大肠埃希氏杆菌细菌培养液,从同剂量的氢化可的松对照组的疗效远远不如灭活埃希的松软膏组可证明灭活埃希的松软膏治疗溃疡性直肠炎的良好效果并非是氢化可的松起作用。

虽然笔者的临床研究还有欠缺之处,例如未采用双盲法观察、未做治疗前后的组织学对比,观察时间仅4周,对远期疗效和长期使用的不良反应尚未明确等,但灭活大肠埃希氏杆菌细菌培养液治疗溃疡性直肠炎的有效性安全性是肯定的,值得笔者做更多的临床尝试以收集更多可靠资料。

参考文献

[1]郑方算.远端溃疡性结肠炎的药物治疗.国外医药、合成药、生化药、制剂分册,1999,20(3):154.

[2]杨玉龙.奥沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎疗效观察.临床荟萃,2000,15(17):790.

[3]崔徵,杨彦忠.炎性肠病新疗法即将进入临床试验.国外医学.预防、诊断、治疗用生物制品分册,2003,26(3):130.

鹈鹕大肠埃希氏菌的分离鉴定 篇2

为查明发病原因, 我们无菌采集病死鹈鹕的内脏 (心、肝脏、脾脏、肾脏、脑、胆汁) 进行病原分离, 并对分离株进行菌株鉴定与毒力试验, 确诊该病是由致病性大肠埃希氏菌引起。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

哥伦比亚羊血琼脂、伊红美兰琼脂、三糖铁、营养肉汤、MHA等北京陆桥技术有限公司提供并按常规法配制。

1.1.2 GNI+革兰氏阴性鉴定卡

批号为S109M, 由法国梅里埃公司提供。

1.1.3 药敏纸片

杭州天和微生物试剂有限公司提供。

1.1.4 药敏试验质控标准菌株

大肠杆菌 (ATCC25922) , 购自中国兽药监察所。

1.1.5 实验动物健康小白鼠

购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养与鉴定

将无菌采集的病料接种于哥伦比亚羊血琼脂平板, 36℃培养24h后, 挑取可疑菌落涂片镜检并纯培养。将纯培养菌分别接种于哥伦比亚血琼脂平板、伊红美兰、三糖铁、生化反应管和微量发酵管等, 37℃培养24h, 观察培养和生化反应等特性。

1.2.2 VITEK鉴定

分别挑取细菌纯培养物3~4个菌落按照操作规程在GNI+革兰氏阴性鉴定卡上加样、培养, 在VITEK-32全自动细菌鉴定仪上读取细菌鉴定结果。

1.2.3 毒力试验

设4组健康小白鼠, 每组2只。3组为实验组, 腹腔注射分离菌的肉汤培养物0.2mL/只;1组为对照组, 腹腔注射肉汤0.2mL/只。分别隔离饲养, 观察临床表现和死亡情况。

1.2.4 药敏试验

将细菌纯培养物接种于MHA平板, 用纸片法进行体外药敏试验, 36℃培养24h, 观察结果。实验方法及判读标准参照NCCLS 2010标准。

1.2.5 NDV、AIV荧光RT-PCR检测

采集病死鹈鹕脑、气管、心脏、肝脏、脾脏、肾、肺等组织样品, 研磨, 加入适量PBS制成悬液, 7500r/min离心5min, 取上清, 分别使用TaqMan探针NDV、AIV荧光RT-PCR检测试剂盒 (深圳匹基生物有限公司, 批号均为20100702) 进行检测。

2 结果

2.1 培养特性

3套病料接种于哥伦比亚羊血琼脂平板, 初代培养均获得比较纯一的细菌, 涂片镜检, 均为G-球杆菌。3株分离菌在Columbia羊血琼脂平板上形成湿润、边缘整齐、圆形、隆起、灰白色中等大小菌落, β溶血;肉汤中培养为均匀浑浊、管底有多量沉淀、振摇呈絮状升起, 管壁有菌环;伊红美兰上为黑色有金属光泽菌落;三糖铁琼脂上为斜面和底层变黄、产气、无H2S产生。

2.2 分离菌株生化特性鉴定

3株分离菌在VITEK-32全自动细菌鉴定仪上细菌鉴定结果分别为7004774633、7004764633、6004774633, 均鉴定为大肠埃希氏菌 (Escherichiacoli) 鉴定准确率均大于≥97%, 详见表1。

2.3 毒力试验

3组试验鼠18h观察有的精神沉郁, 有的呈深度昏迷, 有的死亡, 24h内实验鼠全部死亡, 对照组小鼠正常, 见表2。剖检死亡鼠, 肝出血, 脾肿胀, 肠臌气, 从死亡鼠的肝脏、心脏和脾脏中均分离到接种菌。

2.4 药敏试验

三株分离菌的药敏试验结果基本一致。丁胺卡那霉素和头孢哌酮敏感;除一株分离菌株对恩诺沙星敏感外, 其余12种药均耐药, 详见表3。

2.5 NDV、AIV荧光R T-PCR检测

3套鹈鹕内脏病毒核酸检测结果均为NDV、AIV阴性。

3 小结和讨论

3.1 根据分离菌的形态、染色、培养和生化特性、GNI+检测结果, 鉴定三株分离菌株均为大肠埃希氏菌。毒力试验表明三株大肠埃希氏菌均具有较强的致病性。因而可以推断, 本次鹈鹕发病主要由致病性大肠埃希氏菌感染引起, 分离菌株所含毒力因子有待进一步鉴定。

3.2随着抗菌药物在临床上的普遍应用, 加上使用不规范或使用方法不当, 使得耐药性菌株不断出现, 如不进行药敏试验来指导临床用药, 极易影响药物的效果, 延误治疗时机, 造成损失。本次试验的3株分离菌株也是较强的耐药菌株, 对14种抗生素中的12种已产生了较强的耐药性。根据药敏试验, 对于25日龄左右的鹈鹕肌注丁胺卡那霉素和头孢哌酮, 连续3d, 同时在饲料中添加优质多维, 加强鹈鹕生活区域环境的消毒卫生工作, 鹈鹕没有出现死亡。一月后回访, 已有2批鹈鹕在25日龄左右没有发病, 全部存活, 病情基本得到控制。

大肠埃希氏杆菌 篇3

1 材料与方法

1.1 样品来源与种类

样品采自辽化地区各集贸市场个体户。种类有:干豆腐、酱萝卜条、狗宝、菽子叶、辣椒叶、龙须菜、酱茄子、土豆丝等十几个品种。食品监督员以无菌操作随机抽取100份, 每份150g。

1.2 志贺氏菌属、致泻大肠埃希氏菌诊断血清

由北京卫生部药品研究所提供;培养基及生化系列鉴定管由辽宁省食品监督检验所提供 (诊断血清、培养基等均在有效期内使用) 。

1.3 检验方法

(1) 细菌总数、大肠菌群、致病菌检验均GB4789.31-94食品卫生检验方法微生物学部分进行。 (2) 增菌与分离培养:分别称取检样25g, 加225m L, 营养肉汤增菌液中, 混均取50m L加到SC和GN中各加25m L。营养肉汤、GN置37℃6h, SN37℃20h培养, 取出转种SS和麦康凯平板37℃20h培养, 选取可以菌落3~5个接种到TSI (三糖铁) 、蛋白胨水 (供靛基质试验用) 、p H7.2尿素、K C N、赖氨酸、H2S中3 7℃2 0 h, 同时做革兰氏染色和氧化酶试验, 凡上述实验符合肠杆菌科沙门氏、志贺氏、大肠埃希氏菌属的生化反应特性的即为初筛阳性。

1.4 血清学试验

对初筛阳性的菌株分别进行志贺氏菌属、沙门氏菌属、EIEC、EPEI等型诊断血清凝集实验。

1.5 系列生化实验

初筛及血清实验阳性菌株进行肠杆菌科细菌系列鉴定生化实验。EIEC生化反应结果见表1。

1.6 豚鼠角膜试验

将EIEC阳性菌株制成浓菌悬液, 滴于约450g豚鼠结膜内, 另一眼为对照。

2 结果

从酱茄子、萝卜条、土豆丝中分别, 从狗宝、辣椒叶、酱萝卜条中检出EIEC3株, 分别为O112ac:K66、O136:K78、O164:K1, 未检出志贺氏菌、沙门氏菌, 细菌总数合格12份, 大肠菌群合格11份, 3株EIEC豚鼠角膜试验均为阳性, 自结膜囊取样分离细菌鉴定与原接种菌一致, 对照眼正常。

3 讨论

本次调查, 凉拌菜细菌总数合格率为1 2%, 大肠菌群合格率1 1%, 致病菌污染率为3%, 可见此菌对凉拌菜的污染程度较大。据资料报道, 临床上腹泻病人中EIEC感染占有一定的比例, 并且能引起腹泻病的暴发流行。

据此, 我们建议卫生监督部门应加强对凉拌菜的生产、加工、销售各环节的管理, 加强对经营者卫生知识的培训, 确保消费者身体健康, 防止肠道传染病的发生。

参考文献

[1]GB4789.1-31-1994, 食品卫生检验方法微生物部分[S].北京:中国标准出版社, 1994.

大肠埃希氏杆菌 篇4

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2010年1月—2011年度12月该院感染临床标本中分离出286株大肠埃希氏菌,剔除同一患者相同部位的重复菌株。质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922,铜绿假单胞菌ATCC27853,肺炎克雷伯菌700603购自广西省临床检验中心。

1.2 材料

各种药敏纸片和M-H琼脂。

1.3 细菌鉴定

严格按照《全国临床检验操作规程》进行,采用常规方法鉴定[2]。

1.4 药敏试验

按CLSI推荐的纸片扩散法(K-B)进行,判定标准及结果解释参照CLSI2010-2011年规则,数据分析采用WHONET5.3～5.4软件。

2 结果

2.1 大肠埃希氏菌在临床科室的分布

内2科106株(37.1%)、外1科74株(25.9%)、传染病科62株(21.7%)、外2科25株(8.7%)、儿科13(4.5%)、妇产科6株(2.1%)。

2.2 标本大肠埃希氏菌的构成比

在各种标本中,尿液检出大肠埃希氏菌最多,为98株,占总数的34.3%;其次是脓液63株(22.0%);痰液51株(17.8%);引流液33株(11.5%);伤口分泌物18株(6.3%);阴道分泌物6株(2.1%);血液10株(2.86%);其它7株(2.4%)。

2.3 大肠埃希氏菌对18种临床常用抗菌药物的耐药率

临床常用的18种抗菌药物中,286株大肠埃希氏菌对碳青霉烯类(亚胺培南、美罗培南)100%敏感;对阿米卡星、头孢哌酮舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、呋南妥因、左氧氟沙星的耐药率在10%～50%之间,其它药物的耐药率均在50%以上。见表1。

3 讨论

在2010—2011年中,大肠埃希氏菌在该院较集中的科室是内2科、外1科、传染病科;尿液检出大肠埃希氏菌最多,为98株,占34.3﹪;与阎晓勤[3]报道一致。

大肠埃希氏菌常引起尿路、呼吸道、血液、伤口感染[4]。由于临床广谱抗菌药物特别是第三代头孢菌素的大量使用,大肠埃希氏菌的耐药日趋严重,给临床抗感染治疗带来很大的跳战[5]。该院临床科室分离的大肠埃希氏菌产生耐药性的因素,可能是由于临床医师使用抗菌药物不够合理,大肠埃希氏菌ESBLs是导致其对抗生素耐药的主要原因,这类酶可水解内酰胺药物的酰胺键从而使抗生素失去杀菌活性[6]。严格限制抗菌药物过度治疗和盲目预防用药,加强细菌培养及药物敏感试验,提高检测水平,以指导临床用药。

参考文献

[1]杨金平,陶宏坤.大肠埃希氏菌耐药性调查分析[J].中华医院感染学杂志,2009,19(17):2332-2333.

[2]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社,2006:831-833.

[3]阎晓勤.1054株大肠埃希氏菌的临床分布及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2010,20(24):4016-4017.

[4]张辉,彭义刚,郭龙,等.医院感染大肠埃希氏菌的药敏试验分析[J].中华医院感染学杂志,2008,18(4):584-4585.

[5]李波,陈林娜,王春香,等.大肠埃希氏菌对环丙沙星耐药率及其主要影响因素分析[J].中华医院感染学杂志,2007,17(2):204-205.

大肠埃希氏杆菌 篇5

1对象与方法

1.1 对象

2010年9月, 吉林市丰满区发生了一起学生集体食源性中毒事件, 因食用小鸡炖粉条导致30余人先后发病。患病学生有发热、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状。

1.2 方法

在丰满区某英语实验小学采集食品和餐具13件, 生活饮用水、井水、自来水、天然饮用水和饮水机出口水14件, 粪便5件, 共计32件。按照《食品卫生微生物检验标准手册》和GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》方法进行检验[1,2,3,4]。

2结果

2.1 样品

本次检验共采集样品32件, 其中在小鸡炖粉条的菜中和其中5名学生粪便中检出致病菌。所检出的同种菌株为同一血清型, 肠侵袭性大肠杆菌O136:K78。

2.2 检测

该菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌, 菌落中等大、圆而凸起、边缘整齐、有光泽。

2.3 样品生化鉴定

于鉴别平板上挑取菌落3～5个, 接种三糖铁琼脂, 36 ℃ 24 h。生化反应判定, 即触酶+、氧化酶‐、葡萄糖产气+、KCN‐、硝酸盐还原+、乳糖+、表芽糖+、甘露醇+、蕈糖+、枸橼酸盐‐、MR+、VP‐、H2S‐、靛基质+、赖氨酸脱羧酶+、尿素‐、苯丙氨酸‐、动力‐。

2.4 血清学鉴定

6件样品经过宁波天润生物药业有限公司生产的肠道侵袭性大肠埃希氏菌诊断学清鉴定OK多价血清2++++, OK单价血清O136∶K78++++, 盐水对照-。根据该菌培养特性、生化反应和血清学鉴定, 完全符合侵袭性大肠埃希氏菌O136∶K78的标准。

3讨论

肠侵袭性大肠杆菌主要侵犯较大儿童和成人, 所致疾病与细菌性痢疾相似, 是近年来国内外重视的肠道致病菌。但在吉林市食源性疾病导致的中毒中还属首次检出。本菌有大型质粒, 其上有病原性因子编码, 有侵袭性, 可检出几种外膜蛋白。因与痢疾杆菌的外膜蛋白相同或近缘, 推测为粪-口途径感染。细菌进入人体内, 于大肠黏膜上皮细胞中增殖, 形成溃疡, 经约2 d的潜伏期出现症状, 类似痢疾, 即腹痛、发烧、血便或脓血便以及里急后重等。随着人员流动的增加, 交通发展, 饮水饮食卫生状况尚不令人满意。这些因素使我国感染性腹泻的发病率较高, 侵袭性大肠埃希氏菌等病原体感染造成的腹泻在一些地区呈上升趋势。由于感染性腹泻的病原体种类繁多, 发病形式各异, 传统的病原体检测方法不能对腹泻病人作出快速准确的诊断, 难以满足对疾病的诊断、治疗和预防控制的要求。因此在处理疫情工作中, 除了关注霍乱、痢疾、O157:H7、轮状病毒等常见的致人腹泻的病原体以外, 更要注意由侵袭性大肠埃希氏菌所引起的感染性腹泻。这是流行病学调查和实验室解决感染性腹泻快速准确诊断的关键。国外曾有过该病暴发的报道, 应提醒人们对该病菌的预防。食堂中食物的生产、加工、存储要严格按照卫生法规操作, 避免食品被病原微生物污染。对食堂从业人员加强卫生法规和卫生常识的教育, 对于食品器皿、工具及时清洗和消毒, 从根本上杜绝食源性疾病在学生食堂的再次发生, 确保人民的身体健康。

关键词：侵袭性大肠埃希氏菌,检出,食源性疾病

参考文献

[1]罗雪云, 刘宏道.食品卫生微生物检验标准手册〔M〕.北京:中国标准出版社, 1995:15-35.

[2]GB/T 4789-2003, 食品卫生微生物检验方法〔S〕.

[3]GB 5749-2006, 生活饮用水卫生标准方法〔S〕.

大肠埃希氏杆菌 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

(1)菌株132株大肠埃希氏菌来源于黑龙江省食品风险监测食源性致病因子监测工作获得的分离株。(2)培养基与试剂EC增菌肉汤、TSI、IMVIC、营养琼脂斜面(广东环凯),大肠埃希氏菌显色平板(法国科玛嘉),大肠埃希氏菌血清(丹麦SSI),VITEK革兰阴性菌鉴定卡(法国梅里埃),DNA提取试剂盒、五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒(北京卓诚惠生),QIAxcel Advanced全自动毛细管电泳试剂盒、Size Marker、Alignment Marker(QIAGEN),所需试剂均在有效期内使用。(3)仪器设备VITEK生化鉴定系统、多重食源性致病菌核酸检测系统(Patho MP-STM)。

1.2 方法

(1)大肠埃希氏菌培养鉴定:参照《2015年国家食源性致病因子监测工作手册》进行分离培养鉴定。(2)血清学鉴定:选取新鲜培养的大肠埃希氏菌菌落,按照丹麦SSI大肠埃希氏菌血清说明书进行血清凝集试验。(3)核酸提取:按照DNA提取试剂盒(北京卓诚惠生公司)说明书进行操作:挑取平板菌落配制成0.5~4麦氏浊度的菌悬液,13000rpm离心3min后弃去上清;加入50μL核酸提取液,与菌体沉淀充分混匀后瞬时离心,沸水浴10min后13000rpm离心10min,移取上清液作为后续PCR反应的模板。(4)核酸检测鉴定:用北京卓诚惠生公司生物科技股份有限公司生产的五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒,按照说明书进行致泻性大肠的毒力基因鉴定:将上述方法提取的大肠埃希氏菌DNA各2μL,按照试剂盒说明构建25μL多重PCR反应体系。包括2×PCR Buffer 12.5μL,10×Multiplex Assay 2.5μL,25×PCR Enzyme 1μL,双蒸水7μL。PCR反应条件为:预变性95℃4分钟;变性95℃30秒,62℃退火30秒,72℃延伸90秒,循环3O次;72℃延伸5分钟。每批试剂盒均以5种致泻性大肠埃希氏菌标准株进行质量控制,以试剂盒内阳性对照品作为阳性对照和分子量Marker,以双蒸水作为阴性对照。(5)多重PCR产物分析:用试剂盒内阳性对照的PCR产物作为特异性分子Marker,在QIAxcel Advanced全自动毛细管电泳系统进行自动化片段分析。所有大肠埃希氏菌(包括致泻和非致泻性大肠埃希氏菌)均有一条uid A的扩增条带(1480 bp)。在uid A条带的基础上,若有毒力基因条带的扩增,则为致泻性大肠埃希氏菌。根据扩增条带大小,进而确定毒力基因种类,结合毒力组合方式判定最终致病型别。见表1。

2 结果及分析

2.1 多重PCR结果

5种致泻大肠的标准株都能够通过本研究中所用的多重PCR试剂盒进行准确的致病分型鉴定,方法稳定可靠。见图1。

图1部分样品的多重PCR电泳鉴定结果:A:EAEC样品鉴定结果(agg R+,pic+,uid A+);B:ETEC样品鉴定结果(elt+,uid A+);C:EPEC样品鉴定结果(esc V+,uid A+)

2.2 致病性分型

2014-2015年黑龙江省各地疾控中心共检出大肠埃希氏菌132份。其中52份未能明确鉴定分型。在成功分型的80份样品中,检出率最高的是EPEC和EAEC,分别检出31份和30份,此外还检出ETEC 12份,EHEC4份,以及EIEC3份。见图2。

对30份EPEC样品深入分析发现,绝大多数(22/32)来源肉类及肉类制品,以及带有肉类的快餐盒饭,而来自素菜类的样本相对较少(10/32)。血清学分布以O86K61+为主(16/60),也有O126K71和O20K60等多种其他血清型。在31份EAEC样品中,来源也以肉类和肉类制品为主(27/31),最常见的血清型为O78K80。其中4份EHEC样本分析发现,有三份都来自鹤岗市的食品流通和快餐服务等地点,被污染样品既有牛肉、鸡肉等肉类样品,也有素菜样品。血清学分型鉴定均为O157(+);H7(-)。3份EIEC样品也来自不同地区,样品类型为鸡肉和猪肉。血清学分析均为O28K73。12份ETEC样品来源以肉类为主,也有少量来自快餐店的素菜中。血清型以O25K11最多(5份),其次是O114(+),K(-)(3份),以及O126K71和O78K80各2份。见表2。

3 讨论

大肠埃希氏菌是自然界和人体内最常见的细菌,绝大多数大肠埃希氏菌是无害的,但是带有某些毒力基因的菌株,可以造成腹泻等严重的消化道疾病[5]。致泻性大肠埃希氏菌通常会引起地方性和流行性疾病,如:严重的腹泻、食物中毒,甚至世界范围的腹泻暴发[6]。

研究结果表明,大肠埃希氏菌毒力基因分布与血清型分布并不一致。血清型的鉴定并不能准确的衡量大肠埃希氏菌对食品污染的威胁。由此可见,食品检验项目中的大肠埃希氏菌检验与其他消化道细菌不同。在食源性大肠埃希氏菌鉴定中,除了基本的菌种鉴定和血清型分型以外,毒力基因鉴定以及在此基础上的致病性分型,有更重要的现实意义。

大肠埃希氏菌的毒力因子多达十几种,并且很容易通过噬菌体和质粒在不同亚型之间传播。要对多种毒力因子进行全面的鉴定,才能准确的报告大肠埃希氏菌的致病性。食品检验工作通常样本量比较大,需要方便简单快速的检测手段。因此传统的单重PCR或者荧光定量PCR无法满足大量样本同时检测的要求。高通量,一次可检多个靶标的分子生物学诊断技术,如:基因芯片等,则操作复杂成本高,结果分析较难,对人员操作要求较高,依赖大型仪器,因此也不适用于日常的食品微生物检验需求。近年来,多重PCR技术和多重荧光定量PCR技术的快速发展,可以在单个PCR反应体系中同时完成多个目标基因的检测,在完成菌种鉴定的同时,还可以对多个毒力基因进行检测。兼顾了PCR方法的高灵敏度和食品微生物检验快速高效的需求,本研究使用北京卓诚惠生生物科技股份有限公司开发的多重食源性致病菌核酸检测系统开展食品安全监测就是一个非常好的实例。相信未来通过简单高效高通量的分子生物学手段鉴定食源性细菌及其毒力基因,将成为食品微生物检验不可或缺的手段之一。

摘要：目的 对2014-2015年期间黑龙江省食品风险监测分离的大肠埃希氏菌进行致病型别分析。方法 应用多重食源性致病菌核酸检测系统(Patho MPSTM),将多重PCR体系扩增与全自动毛细管电泳检测模块相结合进行检测。结果大肠埃希氏菌毒力基因分布与血清型分布不一致,2014-2015年间黑龙江省分离的致泻性大肠埃希氏菌致病型别以EPEC和EAEC为主。结论 除了基本的菌种鉴定和血清型分型,毒力基因鉴定以及在此基础上的致病性分型,有更重要的现实意义。

关键词：致泻性大肠埃希氏菌,多重食源性致病菌核酸检测系统,致病性分型

参考文献

[1]严纪文,朱海明,宋曼丹,等.广州市市售食品中致泻性大肠埃希氏菌污染状况调查分析[J].华南预防医学,2002,28(4):37-39.

[2]赵红庆,范锡铜,王玉飞,等.多重PCR检测致腹泻大肠埃希氏菌方法的建立[J].中国卫生检验杂志,2009,19(10):2223-2226.

[3]叶菊莲,占利,程苏云,等.婴幼儿腹泻致泻大肠埃希氏菌PCR毒力基因检测[J].中国卫生检验杂志,2009,19(9):2055-2057.

[4]赵爱兰,熊衍文,白雪梅,等.鉴定五种致泻性大肠埃希氏菌和志贺菌的多重PCR方法[J].疾病监测,2011,26(1):65-67.

[5]林杰,陈爱平,杨劲松,等.检测致泻大肠杆菌的多重PCR方法的建立与应用[J].预防医学论坛,2012,18(12):881-884.

大肠埃希氏杆菌 篇7

试验用西藏农牧学院高原动物疾病研究室制备的牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗(批号为200501)免疫牦牛,在疫苗接种前和再次接种疫苗后3,6,9,12个月,分别于试验牦牛和对照牦牛耳静脉采血分离血清,测定抗体效价,观察免疫牦牛血清中抗体效价持续时间和规律,为制订合理的免疫程序提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗

牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗(含菌数为200 亿个/mL,批号为00501),由西藏农牧学院高原动物疾病研究室制备。

1.1.2 试验动物

健康易感牦牛12头,其中3～6月龄和3岁以上的牦牛各6头,由西藏林芝地区种畜场提供。

1.1.3 阳性血清

大肠埃希杆菌阳性血清,由中国兽医药品监察所细菌制品检测室提供。

1.1.4 抗原

牦牛大肠埃希杆菌高压抗原,由西藏农牧学院高原动物疾病研究室制备。

1.1.5 被检牦牛血清

来自西藏林芝地区种畜场12头牦牛,分别于免疫前和免疫后3,6,9,12个月从牦牛耳静脉采血并分离血清。

1.1.6 阴性血清

从未接种疫苗的牦牛耳静脉采血并分离血清。

1.1.7 器材

V型96孔微量凝集板、移液器、吸头、微量振荡器、0.5%石炭酸、生理盐水等。

1.2 方法

1.2.1 接种疫苗

将12头试验牦牛随机分成3组,接种西藏农牧学院高原动物疾病研究室研制的批号为200501的牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗。 第1组在每头牦牛颈部皮下免疫接种1 mL,不进行第2次免疫;第2组在每头牦牛颈部皮下初次免疫接种1 mL,14天时再次免疫接种疫苗2 mL;第3组为对照组,不接种疫苗。

1.2.2 抗体效价的测定

疫苗接种前、1次接种后3,6,9个月和2次接种疫苗后3,6,9,12个月分别于试验牦牛和对照牦牛耳静脉采血,分离血清,采用微量凝集试验[5]测定疫苗在牦牛体内的抗体效价,抗体效价单位为lg。

1.2.3 安全保护试验

疫苗接种12个月后,分别对3个组的每头牦牛肌肉注射牦牛大肠埃希杆菌液800亿个/mL,观察15 d,观察所有牦牛的精神、食欲、粪便情况,检测体温、心音、呼吸是否正常,有无局部和全身反应,有无发病现象[6]。

2 结果与分析

2.1 不同年龄牦牛1次免疫接种牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗后3,6,9个月血清抗体效价的测定结果

抗体效价从接种到6个月呈上升趋势,6个月以后呈下降趋势,而且下降速度较快,说明牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗对牦牛的免疫保护性从6个月开始下降,见表1和图1。

2.2不同年龄牦牛2次免疫接种牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗后3,6,9,12个月血清抗体效价的测定结果

抗体效价从接种到3个月呈上升趋势,从3个月到6个月保持平稳,6个以后呈下降趋势,但到12个月时抗体效价仍能保持为2.408 lg。牦牛体内抗体水平下降速度较慢。 说明接种该疫苗12个月后对牦牛的保护性仍然很好,见表2和图2。

2.3 对照组的抗体效价

经检测对照组抗体效价始终为零。

2.4 安全保护试验结果

1次免疫组有部分牦牛发病,发病牛精神沉郁、食欲下降、便稀、体温升高、心音和呼吸加快;2次免疫组牦牛均未发病,精神、食欲、粪便、体温、心音、呼吸与接种前相同;对照组全部发病,精神沉郁、食欲下降、拉带血稀粪、体温升高、心音和呼吸加快并有1头小牛死亡,从死牦牛内脏中分离到了攻毒菌。 结果见表3。

3 结论

(1)牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗(含菌数为200 亿个/mL,批号为200501)1次免疫后的检测结果说明,牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗对牦牛的免疫保护性为6个月,6个月以后开始下降;2次免疫后的检测结果说明,接种该疫苗12个月后对牦牛的保护性仍然很好。

(2)牦牛安全保护试验结果为1次免疫组有部分牦牛发病;2次免疫组牦牛均未发病;对照组全部发病并有1头小牛死亡,并从死牦牛内脏中分离到了攻毒菌。说明疫苗2次接种对牦牛的保护性可以达到1年以上,而1次免疫对牦牛的保护性不到1年。

(3) 从抗体效价产生和升高的速度来看,2次免疫比1次免疫产生的速度快,疫苗接种3个月时达到最高峰,且维持高峰一段时间后才开始缓慢下降,说明在牦牛体内有效抗体效价维持时间长,对牦牛的保护性时间长;而1次免疫抗体产生速度相对较慢,疫苗接种6个月时效价才达到高峰,并且下降速度很快,说明在牦牛体内有效抗体效价维持时间短,对牦牛的保护性时间短。

(4) 建议对牦牛进行免疫时可采用2次免疫的方法,抗体效价可以维持1年,免疫持续期比较长。若采用1次免疫的方法进行免疫,建议半年免疫1次,才能有效维持抗体效价。

(5)要注意疫苗注射到牦牛和产生抗体之间有一段免疫空档期,在抗体没有达到一定效价时对牦牛的保护性不可靠,因此要根据该病的流行病学确定最佳免疫时间。

摘要：为了研究牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗不同免疫次数对牦牛免疫保护的情况,试验随机将牦牛分成3组,接种牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗,1mL/头(含菌数200亿个/mL)。第1组为1次免疫组,第2组为2次免疫组,第3组为对照组(不接种组),疫苗接种后3,6,9,12个月分别对试验牦牛采血测抗体效价,并在接种疫苗12个月后对试验牦牛进行攻毒试验。结果表明:1次免疫抗体效价从接种到6个月呈上升趋势,6个月以后呈下降趋势,而且下降速度较快;2次免疫抗体效价从接种到3个月呈上升趋势,3个月到6个月保持平稳,6个月以后呈下降趋势,但到12个月时抗体效价仍能保持为2.408lg,抗体水平下降速度较慢。攻毒试验结果为1次免疫组有部分牦牛发病,2次免疫组牦牛均未发病,对照组全部发病。说明牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗对牦牛2次免疫比1次免疫效果好,对牦牛保护性可靠。

关键词：牦牛大肠埃希杆菌病灭活疫苗,免疫保护,抗体消长规律

参考文献

[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].3版.北京:中国农业出版社,1996.

[2]房海.大肠埃希氏菌[M].石家庄:河北科学技术出版社,1997:13.

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[5]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].2版.北京:中国农业出版社,2002.