通路组织

通路组织（精选七篇）

通路组织 篇1

关键词：磷脂酰肌醇-3激酶,蛋白激酶B,磷酸酶基因

肝癌是指原发于肝脏的恶性肿瘤, 是临床上最常见的恶性肿瘤之一, 根据最新统计, 全世界每年新发肝癌患者约六十万, 居恶性肿瘤的第5位。近几十年来肝癌的治疗效果有所提高, 但由于肝癌起病隐匿, 肝内转移较早和复发率较高, 且肝癌细胞对常用的抗肿瘤药物和放疗等治疗措施不敏感, 导致肝癌的预后仍很差。因此, 进一步寻找和开发新的治疗策略是非常必要和急迫的。

1材料与方法

取肝癌组织和肝纤维化组织各10例, western-blot法检测PTEN、AKT蛋白的表达。提取肝癌组织和肝纤维化组织总RNA, RT-PCR方法检测PTEN、AKT、TLR4 mRNA的表达。

2统计学方法

应用SPSS 13. 0统计软件进行数据处理。计量数据采用± s表示。进行正态性检验和方差齐性检验, 若符合正态性、 方差齐性检验的数据, 组间比较采用t检验。若不符合正态性、方差齐性检验的数据可采用非参数秩和检验, P < 0. 05为差异有统计学意义。

3结果

结果显示肝癌组织中的PTEN、AKT、TLR4mRNA和PTEN、AKT、P-AKT蛋白水平比肝硬化组织中上述指标明显升高, 差异均有统计学意义 ( P < 0. 05) 。结果见表1、表2。

注: 与肝癌组织比较, *P < 0. 05

注: 与肝癌组织比较, *P < 0. 05

4讨论

肝细胞癌 ( HCC) 是原发性肝癌最常见的形式, 是世界第五大最常见的癌症, 和癌症相关死亡的第3大原因, 尤其是在亚洲和撒哈拉以南的非洲患病率高, 死亡的人数为每年大约60万, 5年生存率低于9% 。肝细胞癌常见的治疗方法有手术切除、肝移植、经皮消融等。然而, 能手术解除的患者较少, 再加上有些患者不适合手术或介入程序, 因此只能选择化疗, 但到目前为止, 化疗的效果并不理想。肝移植亦是肝癌有效的治疗方法, 但由于供体的缺乏和相对较高的成本, 很多患者难以承受繁重的经济负担, 因此到目前为止, 肝癌的病死率仍居高不下。大多数抗癌药物常见的缺点包括生物利用度低, 选择性差, 可同时作用于肿瘤细胞和正常细胞, 并导致免疫抑制, 易出现并发症甚至导致死亡。肝癌靶向治疗可提高疗效, 减少副作用。PI3K信号通路在人类的多种肿瘤中表现为活性增强, 通过多种方法和途径抑制该信号通路, 可抑制肿瘤细胞的生长, 并促进肿瘤细胞的凋亡。炎性反应与肿瘤的发生有密切的关系, 抑制PI3K信号通路可减少多种炎性因子的释放, 从而减少和抑制肿瘤的生长。然而研究发现PI3K信号通路在肿瘤的免疫调节中同样起着重要的作用。在多种肿瘤中NF-KB表达的活性增强, NF-KB是PI3K重要的调节分子, 通过NF-KB可调节多种细胞凋亡因子和炎性因子, 来达到抗肿瘤的目的。近年来发现NF-KB可通过免疫途径调节肿瘤的发生和发展, 如在肺癌中的研究发现通过抑制TLR4降低了NF-KB信号通路活性。PTEN[1]是一个质膜脂质磷酸酶, 作为一种肿瘤抑制基因[2], 能调控几个关键的细胞功能, 包括细胞增殖、凋亡和迁移[3]。PTEN蛋白去磷酸化磷脂酰肌醇三磷酸 ( PIP-3 PIP2) , 抑制癌基因AKT的激活, 然后负调节PI3K信号通路。PI3K通路对调节细胞生长和增殖而言是重要的[4]。人类癌症的小鼠模型的研究表明, PTEN基因改变, 包括突变、功能丧失、下调的表达缺失, 可能会导致一些疾病如胰腺肿瘤、肝肿瘤、膀胱肿瘤、肾上腺嗜铬细胞瘤、白血病和淋巴瘤[5]。PTEN是最初发现在1997年的肿瘤抑制基因, 具有负性调控PI3K信号转导通路[6]的作用, 是调控细胞生长、增殖、代谢迁移和侵袭的一个关键因素[7,8], PTEN基因导入癌细胞可抑制细胞的生长、侵袭和转移, 因此, PTEN基因在控制肿瘤的进展中起到重要的作用。最近的研究报告, PTEN蛋白定位在细胞质和细胞核中, 并发挥着不同的作用[9,10]。在细胞质中, PTEN基因可通过负调控PI3K信号通路调节细胞生长。Hu和Kevadiya等[11,12]报道, PTEN水平减少的肝癌患者与PTEN表达水平正常的肝癌患者相比, 总生存时间较短, 表明PTEN可作为判断低分化肝癌预后的分子标志物, PTEN的减少与肝癌患者预后不良相关。Toll样受体 ( TLRs) 识别入侵的病原体的具体结构区域和启动先天免疫和适应性免疫应答, TLR在免疫细胞中的表达在许多癌细胞中已被检测到。脂多糖 ( LPS) 是TLR4的配体, 能刺激免疫细胞, 通过TLR4引起炎性细胞因子和其他递质的产生, 反过来又调节宿主的免疫防御系统, 消除病原体。据报道炎性细胞因子的炎性反应刺激能抵消免疫监视和促进肿瘤生长诱导。但其他各种报告表明不同的TLRs可能表现出不同的效果, 由于在病原体的免疫环境的差异性, 导致抑制性的增加或废除。

通路组织 篇2

1资料与方法

1.1一般资料 收集我院肝胆胰外科2011年1月—2013年12月手术切除的经病理诊断明确胰腺导管细胞癌的标本、相应的癌旁组织标本 (向患者详细交代研究情况, 争取患者同意且签订知情同意书后方可采集标本) , 各60例, 包裹锡箔纸后于-80℃保存备用, 同时记录患者一般资料及癌组织病理分型相关信息。以上60例胰腺癌患者为自愿参加本次试验, 均签署了相关协议, 并得到了相关部门的批准。60例胰腺癌患者中, 男48例, 女12例, 年龄范围为42岁~69岁, 平均年龄 (58.63±8.74) 岁;病程为1 d~4 d, 平均 (2.11±0.86) d;39例患者为低分化, 21名患者为高中分化。排除标准:患有其他恶性肿瘤性疾病。

1.2方法 对60例胰腺癌患者经由实时定量聚合酶链式反应 (PCR) 以及Western blot方法检测胰腺癌组织及癌旁组织中Hh信号通路相关分子的表达。首先, 将保存的患者胰腺组织取出, 并将其与TRIzol试剂放于匀浆管中;其次, 将其置于冰盒上进行2次匀浆, 每次6 s。依据TRIzol说明书进行核糖核酸 (RNA) 的提取, 进行吸光度的监测, 吸光度的监测使用紫外分光光度计进行检测, RNA样品分别放置于260 nm和280 nm处进行检验。检验样品值和总样品RNA的浓度值, 样品值范围若是1.8~2.0为纯度良好。按照M-MLV的说明书进行总RNA的逆转录, 其存储方式为置于零下20摄氏度保存。Ptchl引物序列, 下游:5’-CCTCAGCCTTATTCAGCATTTC-3’, 上游:5’-CTCCTTTGCGGTGGAVAA-3’, 扩增片段为109 bp;Shh引物序列, 下游5’-TTGGGGATAAACTGCTTGTAGG-3’, 上游:5’-GTCTCCTCGCTGCTGGTATG-3’, 扩增片段为150 bp;Glil引物序列, 下游:5’-AACTTCTGGCTCTTCCTGTAGC-3’, 上游:5’-ATCCTTACCTCCCAACCTCTCT-3’, 扩增片段为84 bp;Smo引物序列, 下游:5’-CAAAACAAATCCCACTCACAGA-3’, 上游:5’-CTCCTACTTCCACCTGCTCAC-3’, 扩增片段为104 bp。Western blot方法检测法使用细胞裂解液提取总蛋白, 提取步骤严格按照裂解液说明书进行, 用考马斯亮蓝法, 分光光度计595 nm波长下测吸光光度值, 与标准曲线对比, 得出蛋白浓度后, 分装于EP管中, -80℃保存。每个样品按总蛋白9μg加样, 电泳, 转膜过夜, 封闭2 h。分别加入Hh通路相关分子对应的一抗, 结合二抗显色。利用凝胶成像仪分析结果。

2 结果

经过实验分析后发现, 在胰腺癌组织中Ptchl基因 (Ptchllm RNA) 的相对表达量为0.601±0.051, 其癌旁组织的相对表达量为0.352±0.052;在胰腺癌组织中因猬分子基因 (Shh m RNA) 的相对表达量为0.652±0.035, 其癌旁组织的相对表达量为0.312±0.012;在胰腺癌组织中Gli1基因 (Glil m RNA) 的相对表达量为0.521±0.053, 其癌旁组织的相对表达量为0.242±0.056;在胰腺癌组织中平和基因 (Smo m RNA) 的相对表达量为0.4833±0.012, 其癌旁组织的相对表达量为0.224±0.046。当Hh蛋白与Patch-1结合时, Patch-1对Smo的抑制作用被解除, Smo将Hh信号向胞内传递, 最终导致下游的GLI全长修饰为转录激活因子, 进入胞核内激活靶基因Bcl-2、HHIP-1、MYCN、CCND-1、CCND-2、FOXF-1、FOXL-1及JAG-2的表达, 从而调控细胞的增殖、分化及凋亡, 决定细胞的命运。Patch-2基因虽然也能与Hh蛋白和Smo相互作用, 但其具体功能尚不清楚。

3 讨论

胰腺癌属于一种发展迅速的恶性肿瘤, 在西方国家中己将胰腺癌肿瘤列为致人死亡的恶性肿瘤之一[3]。在临床治疗当中即便对肿瘤进行切除后, 依然会有许多患者出现复发并且死亡的现象。因此, 对于Hedgehog信号通路相关分子在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达具有重要意义。从上述研究内容可知, 胰腺癌细胞中Hh的信号通路活化, 而癌旁边组织的Hh信号通路相关分子不表达, 即便表达也较弱。在胰腺癌组织中, Hh信号通路相关分子与分化程度有着明显的差异, 但是其与患者的肿瘤大小、淋巴结转移等因素无关。

综上所述, Hh信号通路的相关分子在组织中的表达活化, 其在癌组织中表达较弱甚至无表达, 且基因的表达量也与分化程度有着一定的关系。同时, Hh信号通路的相关分子的异常激活在干细胞特性的维持和胰腺癌CSCs的增殖分化中也起着重要作用[4]。由此可见, 在胰腺癌的发展过程当中Hedgehog信号通路相关分子起着重要作用, 对于Hedgehog信号通路相关分子在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达研究, 可以为胰腺癌的早期诊断以及治疗等方面提供重要的理论依据。

参考文献

[1]黄喆, 郭克建, 何三光, 等.人胰腺癌组织中mi R-223与Hedgehog通路中SUFU、GLI1表达相关性分析[J].现代生物医学进展, 2013, 13 (21) :4049-4050.

[2]付京东, 薛栋, 常刚, 等.胰腺癌中CIP2A与p-Akt、N-cadherin、MMP-9的表达及其临床意义[J].中国现代普通外科进展, 2014, 17 (10) :779-780.

[3]郑晓文, 陈一强, 孔晋亮, 等.Hedgehog信号通路成分SHH和Gli-1及血管内皮生长因子在人肺癌中的表达[J].中国全科医学, 2014, 17 (18) :2099.

通路组织 篇3

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TGF-β多克隆抗体购自Santa Cruz公司,磷酸化Smad2/3多克隆抗体购自New Englang Biolabs公司,α-SMA购自Oncogene公司,LSABR+System、HRP(DAB)和En Vision TM+System、HRP(DAB)试剂盒为DAKO公司产品。

1.2 实验动物

糖尿病小鼠肾病模型制作方法[7]:2个月龄雄性C57BL/6小鼠36只,体重25~35 g,购自中山大学北校区实验动物中心。所有小鼠随机分成模型组(30只)[腹腔注射STZ 50 mg/(kg·d),连续5 d]和对照组(6只)(腹腔注射相同体积的枸橼酸缓冲液),观察16周。以血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病诊断标准。实验组于实验第0、4、8、12、16周处死小鼠检查,肾组织以10%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 肾组织病变程度分析

所有标本按常规方法固定,包埋,切片厚2μm,HE和Masson染色,光镜观察肾小球、肾小管-间质病理变化。

1.3.2 TGF-β和磷酸化Smad2/3免疫组织化学

采用LASB法检测肾组织中TGF-β和磷酸化Smad2/3的表达。取4μm石蜡切片,常规处理后,滴加预阻断液室温30 min;分别滴加兔抗大鼠TGF-β多克隆抗体(1∶200)和兔抗大鼠磷酸化Smad2/3多克隆抗体,4℃孵育过夜;滴加生物素化抗兔抗体(原液),37℃孵育45 min,滴加辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素(原液),37℃孵育45 min,最后加DAB-H2O2显色,显微镜下控制显色反应,苏木素复染,中性树胶封片,实验同时采用PBS代替一抗作为阴性对照。TGF-β以肾实质及间质细胞浆内棕褐色颗粒为阳性,磷酸化Smad2/3以肾实质及间质细胞核内棕褐色颗粒为阳性。

1.3.3 肾组织α-SMA免疫组织化学染色

采用Envision法检测肾组织α-SMA的表达。取4μm石蜡切片,常规处理后,滴加山羊血清封闭液室温30 min;滴加小鼠抗大鼠α-SMA(1∶50)单克隆抗体,4℃孵育过夜;滴加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠Envision多聚物(原液),37℃孵育45 min,最后加DAB-H2O2显色,显微镜下控制显色反应,苏木素复染,中性树胶封片,实验同时采用PBS代替一抗作为阴性对照。以肾间质棕褐色颗粒为阳性。

1.4 实验结果的定量

TGF-β和α-SMA半定量分析:应用IBSA 2.5图像分析系统显微镜200倍下随机选取20个视野,按阳性信号所占百分比进行半定量评分后取均值;Smad2/3半定量分析:400倍镜下分别随机选取20个视野,计算每平方毫米肾组织阳性细胞个数后取均值。

1.5 统计学分析

数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 11.5统计软件进行分析,均数比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病小鼠肾组织TGF-β的表达变化

免疫组织化学染色显示,正常肾组织TGF-β主要位于皮髓交界的肾小管,肾小球基本无表达(图1a)。糖尿病形成后4周,TGF-β的表达明显增加,遍布肾小球和皮、髓质各肾小管,且表达随着肾纤维化的加重明显升高,第12周达高峰(图1b),第16周表达有所减少,但仍高于对照组(图2)。

2.2 糖尿病小鼠肾组织磷酸化Smad2/3的表达和定位

免疫组织化学染色显示,对照组小鼠肾小球和肾小管细胞核内可见少量p-Smad2/3表达(图3a)。随着糖尿病的进展,p-Smad2/3在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞胞核及局灶浸润细胞核内的表达明显增加,于糖尿病形成后4周显著增加,并持续增加到第12周(图3b),第16周表达有所减少,但仍高于对照组(图4)。

2.3 糖尿病小鼠肾组织α-SMA的表达变化

免疫组织化学染色显示,对照组小鼠α-SMA仅表达于血管平滑肌,肾小球系膜区和肾小管-间质细胞偶有少量表达(图5a)。随着糖尿病的进展,α-SMA除了在血管平滑肌表达外,肾小球系膜区、肾小管间质、萎缩的肾小管周围、肾小管上皮细胞内及局灶细胞浸润处均有α-SMA的表达。于糖尿病形成后4周显著增高,并持续增加到第12周(图5b),第16周表达有所减少,但仍高于对照组(图6)。

2.4 糖尿病小鼠肾组织TGF-β、p-Smad2/3及α-SMA表达之间的关系

糖尿病小鼠肾组织TGF-β、p-Smad2/3及α-SMA表达均明显增加,表达时相一致,肾组织TGF-β的表达与p-Smad2/3显著相关(r1=0.807,P<0.01);p-Smad2/3与α-SMA亦显著相关(r2=0.804,P<0.01)。

3 讨论

肾小球和肾小管-间质损害是糖尿病肾病的重要表现,与肾功能的下降密切相关。肌成纤维细胞的出现是肾纤维化发生的一个重要标志,肌成纤维细胞兼具平滑肌细胞和成纤维细胞的生化和结构特性,是纤维化疾病中细胞外基质产生的主要来源,肌成纤维细胞的数量与糖尿病肾功能下降程度呈正相关[8],这些细胞的起源不完全清楚。研究表明,近端小管上皮向细胞肌成纤维细胞的转分化是肌成纤维细胞形成的机制之一[9]。研究显示,TGF-β在近端肾小管上皮发生转分化的过程中起重要作用[3]。Smad信号蛋白是近年来发现的TGF-β家族下游信号转导蛋白,TGF-β介导的纤维化都涉及Smad信号通路。Li等[10]研究发现,正常大鼠肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞在高糖刺激24 h后,TGF-β表达明显上调,Smad信号通路被激活,表现为Smad2和Smad3发生磷酸化并移位至细胞核内,第3天Ⅰ型胶原的合成增加,表明TGF-β/Smads信号通路参与了高糖诱导的细胞外基质的产生。

通路组织 篇4

神经营养因子可激活PI3K/Akt信号转导通路, 但其作为大分子, 很难通过血脑屏障, 探究一种既能穿透血脑屏障又能将PI3K/Akt信号转导通路高效激活的药物迫在眉睫。姜黄素是近年来发现的一种脂溶性酚类色素, 其从姜黄、莪术等姜科姜黄属植物的根茎中提取出来, 具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗细胞凋亡等药理作用, 可防止神经元损伤, 对神经性病变具有保护作用, 可改善外周神经病、脑损伤等多种疾病症状[2], 但姜黄素对PI3K/Akt信号通路的影响未见报道。本研究通过观察姜黄素对脑缺血模型大鼠脑组织中的PI3K、AKT、Bcl-2、BAX等一系列蛋白的表达影响, 观察其对大鼠脑组织含水量和血脑屏障通透性的影响, 探究姜黄素脑保护作用及其可能的相关机制。

1 材料与动物

1.1 动物

SD大鼠 (清洁级) , 月龄11~12个月, 数量72只, 净重220~250g, 大鼠称重编号后采用随机数字表法分组:假手术组、模型组、姜黄素A、B组, 每组各18只。

1.2 试剂及仪器

采用DMSO将姜黄素纯品配制成终浓度为50mg/L的母液, 过滤除菌后于-20℃避光存储, 每次使用前将培养液稀释至所需浓度 (终浓度<1/1 000) 。PI3K、AKT兔抗大鼠多克隆免疫组化试剂盒;兔抗人Bcl-2、BAX多抗, SABC、DAB、细胞凋亡检测试剂盒;Multiskan MK3酶标仪;MA1110型分析天平 (精度0.000 1g) 。有机试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 造模与干预

采用35mg/kg水合氯醛麻醉大鼠后, 参照NI J[3]方法造模, 模型组、姜黄素A、B组脑缺血大鼠模型制备采用将两侧颈动脉结扎的方法, 假手术组大鼠仅裸露颈总动脉、神经。于造模后第28天起, 姜黄素A组 (200mg/kg·d-1) 和B组 (300mg/kg·d-1) 大鼠连续灌胃给予药物35天;假手术组及模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水, 频率同给药组。

2.2 PI3K、AKT蛋白表达检测

在最后给药的12h后, 随机从每组中选出6只大鼠, 采用乙醚麻醉后进行断头处理, 摘取视交叉至漏斗部之间的脑组织, 以10%CH3CHO浸泡, 置于4℃冰箱固定48h, 石蜡包埋, 冠状切片厚度5μm, 常规脱蜡、酒精浸水, 以枸橼酸盐缓冲液微波法进行抗原修复, 水洗后分别滴加兔抗大鼠PI3K (1∶150) 、AKT (1∶100) 多抗, 于4℃下静置12h, 孵育液30min, DAB显色之后苏木精复染, 常规脱水、透明、封片。阳性细胞吸光度检测:MiVnt图形采集分析系统, 取平均值, 采用PBS作阴性对照。

2.3 凋亡调控蛋白检测

按照SABC步骤染片, 将给药48h的脑组织切片脱蜡至水, 严格按照试剂盒说明书操作进行, 于高倍镜下观察胞浆着色, 呈棕黄色的为阳性细胞。

2.4 脑组织含水量检测

各组随机选取6只大鼠断头、取脑, 去除嗅球部分, 称湿重后于90℃干燥箱干燥24h, 再称重。按公式:含水量 (%) = (湿重-干重) /湿重×100%, 计算脑组织含水量。

2.5 血脑屏障通透性检测

采用2%伊文思蓝于每组遗留的6只大鼠尾部静脉注射, 3h后以水合氯醛麻醉, 采用200mL生理盐水于大鼠左心室注射冲洗血管内血液, 取脑称量, 脑组织放置于甲酰胺内, 于60℃下水浴一整天, 匀浆后离心 (转速:1 000r/min、时间:6min) , 于635nm波长处检测上清液的OD值, 计算伊文思蓝含量。

2.6 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件系统, 方差分析采用one-way ANOVA方法, 先进行方差齐性检验, 若齐则采用LSD检验, 若不齐则采用Games-Howell检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠PI3K蛋白、AKT蛋白阳性表达时吸光度变化

PI3K蛋白、AKT蛋白若形成棕黄色物质沉积说明已发生阳性表达。结果表明, 模型组大鼠PI3K表达量较假手术组明显升高 (46.934±4.539) %, AKT升高 (55.29±2.06) %, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;与模型组比较, 姜黄素A、B组大鼠PI3K表达分别增加了 (67.85±6.43) %、 (72.36±7.12) %, AKT分别增加了 (65.39±4.64) %、 (72.38±5.16) %, 差异均具有统计学意义 (P<0.01) 。见表1。

(±s, n=6)

注:与假手术组比较, *P<0.05;与模型组比较, △P<0.01。

3.2 各组大鼠脑组织含水量改变

模型组大鼠脑组织水含量较假手术组增加了 (19.93±4.69) %, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;姜黄素A、B组大鼠脑组织水含量较模型组分别下降了 (13.99±1.98) %和 (12.99±1.97) %, 差异均具有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。

(±s, n=6)

注:与较模型组比较, △P<0.05;与假手术组比较, *P<0.01。

3.3 血脑屏障通透性改变

模型组大鼠伊文思蓝含量较假手术组增加 (596.39±129.79) %, 差异具有统计学意义 (P<0.01) ;与模型组比较, 姜黄素A组、B组大鼠依文思蓝含量分别降低了 (42.97±7.92) %和 (39.85±7.93) %, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

3.4 各组大鼠Bcl-2、BAX蛋白表达变化

在梗死灶周围的皮质或纹状体内可见Bcl-2阳性细胞, 假手术组大鼠仅可呈现少量Bcl-2、BAX反应。在缺血周边区, 模型组及给药组大鼠Bcl-2蛋白表达量均较假手术组升高 (P<0.01) , 姜黄素给药组大鼠Bcl-2表达量明显高于模型组 (P<0.01) , 模型组及姜黄素给药组大鼠BAX蛋白表达量较假手术组明显增加 (P<0.01) , 姜黄素给药A、B组BAX表达量均高于缺血组 (P<0.05) , 差异均具有统计学意义。见表3。

(±s, n=6)

注:与模型组比较, (1) P<0.05, (2) P<0.01。

3讨论

脑缺血引起的神经元死亡主要以细胞凋亡为表现形式, 细胞凋亡具有渐进性, 及时有效抑制或减少缺血半暗带细胞凋亡是发挥脑保护作用的重要手段。

PI3K (磷脂酰肌醇3激酶) /AKT (丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶) 信号转导通路作为细胞生存的信号通路之一, 其在细胞增殖、分化、抑制神经细胞凋亡方面起到了重要作用[4]。脑缺血再灌注后, 机体本身可以释放出一些能够激活酪氨酸激酶活性受体的物质, 如神经细胞生长因子、整合素等, 受体经过磷酸化后可特异性与PI3K的调节亚基结合, 从而激活PI3K。兼备脂类激酶活性与蛋白激酶活性的PI3K激活后可使细胞膜上的肌醇发生磷酸化, 生成第二信使PI3K, AKT作为PI3K下游的效应分子可与之结合, 在既能够使AKT从细胞质向细胞膜转位的同时, 又能够改变其构象, 如此一来便可使AKT的Thr308位点以及Ser473位点发生磷酸化, 使其由抑制状态变为激活状态。作为调节位点的Thr308和Ser473的磷酸化作用的发生是一前一后、互相独立的[5], AKT活性的最终实现需要依赖Ser473的磷酸化, AKT磷酸化激活后即成为p-AKT, 其可衡量该通路的活化程度, 通过参与多条信号转导途径来起到促进细胞增殖和阻止细胞凋亡发生的作用。AKT活化后控制凋亡的方式是通过直接将凋亡相关蛋白磷酸化或间接改变、编码凋亡相关蛋白的基因表达水平实现的, 活化后的AKT通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白Bad、Caspase-3、NF-KB等, 通过调控多种生长因子诱发细胞生长、促进细胞存活的生物学效应[6,7,8]。

AKT磷酸化后能促使Ser136位点的Bad发生磷酸化, 形成一个可与伴侣蛋白14-3-3结合的位点进而形成复合物。当复合物形成时, Bcl-2或BCL-xl形成的异源二聚体中的Bad便会脱落下来, 从而增加胞质中的Bcl-2或BCL-xl等的游离状态, 以此发挥抗凋亡作用[9]。人们在对小鼠进行AKT基因剔除后发现, AKT的磷酸化水平有所降低, 导致胞质中Bcl-2表达下调, BAX表达上调, 使脑损害程度[10]进一步加重。AKT通过Bad磷酸化而将其激活, 从而发挥抑制Bad加重脑损伤的作用;同时, 又通过促进Bcl-2和BCL-xl解离而发挥抗凋亡作用。采用特异性PI3K抑制剂处理后, 可在一定程度上降低AKT对Bad的磷酸化效果。同时, AKT也能将Ser184位点的BAX磷酸化, 阻止BAX形成二聚体, 抑制其促凋亡功能。

本实验结果表明, 模型组大鼠PI3K及AKT磷酸化表达水平较假手术组显著增加, 但细胞凋亡显著增多, 血脑屏障通透性和含水量均显著升高, Bcl-2表达量降低, BAX表达量升高, 脑保护功能降低。给予姜黄素后不但可减轻血脑屏障通透性和水肿程度, 还可有效抑制细胞凋亡, 增强PI3K及AKT蛋白活性, 升高Bcl-2并降低BAX水平。因此, 姜黄素发挥脑保护作用的主要机制可能是其在穿透血脑屏障后激活了PI3K/AKT信号转导通路, 进一步介导Bcl-2、BAX发生相应变化, 即增加Bcl-2蛋白表达, 降低BAX蛋白表达, 调节二者之间的比例, 然而PI3K/AKT信号通路激活后可介导多种凋亡因子发生相应变化。本文仅研究了凋亡因子Bcl-2、BAX的变化, 对于其他凋亡因子尚未进行研究, 姜黄素激活PI3K/AKT信号通路后是否也能介导其他凋亡因子发生改变尚不明确, 故其具体机制亟待进行更深入的研究。随着对神经细胞凋亡更加深入的研究以及与其相关信号转导通路机制的阐明, 可为脑缺血的临床治疗提供更加明确的方向和靶点。

参考文献

[1]谢飞, 魏珂, 闵苏, 等.神经生长因子对H9c2心肌细胞缺氧/复氧后凋亡的保护作用及其机制[J].中国药理学通报, 2014 (4) :506-510.

[2]李勇, 王蓬文.姜黄素神经保护作用研究概况[J].中国中药杂志, 2009, 34 (24) :3173-3175.

[3]NI J, OHTA H, MATSUMOTOK.Progressive cognitive Impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occlusion of bilateral carotid arteries in rats[J].Brain Res, 1994, 63 (1) :231-234.

[4]张蔺珊, 李娟娟, 吴春云.脑缺血的损伤机制及相关信号通路的研究进展[J].神经解剖学杂志, 2014, 30 (6) :729-732.

[5]郁迪, 莫绪明.PI3K/Akt和MAPK信号通路在缺血性脑损伤中的保护作用[J].医学综述, 2015 (2) :210-213.

[6]黄雄峰, 汪建民.葛根素的神经保护作用机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志, 2015, 21 (4) :224-230.

[7]王小雄, 司瑞, 邵虹, 等.红景天苷抑制缺血/再灌注诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡[J].中国心血管杂志, 2015, 20 (1) :57-61.

[8]秦宝宁, 滕文静, 刘瑞娟, 等.大黄虫丸对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖凋亡及PI3K/AKT信号传导通路的影响[J].时珍国医国药, 2015, 26 (3) :522-525.

[9]马娜, 郭瑞珍, 阮媛, 等.PI3K-AKT-Bcl-2抗凋亡途径与瘢痕癌癌细胞凋亡相关性探讨[J].中华肿瘤防治杂志, 2014, 21 (8) :599-604.

通路组织 篇5

1 Toll样受体( TLR4)

目前研究认为TLR4 是革兰氏阴性杆菌脂多糖( LPS) 的跨膜受体,主要分布于肥大细胞、单核吞噬细胞、CD类细胞等免疫细胞,主要负责感受入侵的病原体,通过LPS刺激可即明显增加TLR4 mRNA表达[1]。TLR4 还在诸如心肌细胞及微血管内皮细胞上有所表达。研究发现TLR4 参与固有免疫时过早或过晚活化和激化的炎症途径参与了心血管疾病的发生。高血压的发生发展与通过TLR4 介导的炎性反应存在一定相关性,而干预TLR4 的表达能在改善血压及其并发症的发生发展过程中起一定的作用。陈思等[2]研究发现,高血压病人外周血TLR 4 表达率为( 8 . 6 3 ±1. 16) % ,显著高于对照组( 5. 27 ±1. 25) % ,认为TLR4介导的炎性反应与高血压的发生、发展存在着密切的联系。相反,血压的变化也影响TLR4 的表达。严格治疗原发性高血压后的病人,血压处于一定正常的范围,即收缩压< 130 mm Hg ( 1 mm Hg = 0. 133k Pa ) 时,该组病人与常规治疗组( 收缩压< 1 4 0mm Hg) 相比,前者外周血中的单核细胞表面TLR4 得到了显著下调[3]。研究发现在两肾一夹大鼠高血压模型左室重构心肌中TLR4mRNA和蛋白表达均明显增高[4]。同时,TLR4 表达升高与血压升高之间存在密切关系。而抑制TLR4 的表达同时可以测得血压下降结果,改善自发性高血压大鼠( spontaneous hypeen sive rat,SHR) 肠系膜阻力血管的收缩性[5]。TLR4 本身并不能直接升高血压,而是在辅助因子MD2、CD14 的参与下与革兰阴性细菌内毒素的LPS结合并激活下游信号转导分子,最终激活NF-κB[6]。所以目前可以肯定的是,TLR4 与高血压之间存在相关性,而主流认为TRL4 通过激活炎性因子达到血管内慢性炎性反应达到升高血压的结果。

2 中药干预TLR4

中药干预TLR4 的机制存在多样化,可通过减少细胞表面TLR4 的表达、抑制TLR4 的信号通路及抑制TLR4mRNA的表达达到作用。 左可可等[7]将60 例高血压病中医证属肝火亢盛夹痰证病人,随机分为治疗组和对照组,各30 例,均给予非洛地平或联合贝那普利治疗,治疗组加用桑蒺合剂,观察周期28 d,检测治疗前后血压、中医证候积分、外周血单核细胞表面TLR4 表达证明: 桑蒺合剂可改善肝火亢盛夹痰证病人的临床症状,减少外周血单核细胞表面TLR4 表达。武剑[8]用柴胡多糖治疗LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞后发现柴胡多糖对LPS诱导的TLR4 信号通路有调节和抑制作用,主要体现在可显著降低LPS诱导的TLR4、CD14 表达及NF-κB磷酸化水平增高,提示柴胡多糖很可能通过影响并抑制TLR4 信号通路而发挥其抗炎免疫作用。周婷等[9]实验发现,黄芪甲苷和大黄素能抑制 γ-干扰素( IFN-γ) 诱导的TLR4 mRNA表达。

3 髓样分化因子88( My D88)

My D88 是Toll4 受体信号通路中发挥着关键性调节作用的蛋白[10],它在TLR4 /NF-κB信号转导通路中必不可少。当TLR4 被激活后会进行信号通路传递,共包括2 条,即My D88 依赖性( My D88-dependent) 信号转导途径和My D88 非依赖性( My D88-independ-ent) 信号转导途径[11]。公知的My D88 结构是由N端的死亡区约90 个氨基酸、与Toll样受体同源结构域结合的羧基末端以及C端的类似于白介素( IL-1) 受体胞质区的Toll区3 部分组成。许多研究表明Myd88 在高血压炎症反应中存在重要的地位。苏赛等[12]发现衔接蛋白My D88 的表达水平在妊娠期高血压病人母血表达中明显增加,并与下游炎性因子IL-1 和肿瘤坏死因子-α( TNF-α) 仅呈正相关,提示血清中My D88 的异常表达与妊娠期高血压的发生存在一定相关性。在SHR大鼠身上抑制My D88 后可检测到血管外膜单核细胞炎症因子P38MAPK,NF-κB和MCP-1 的表达明显降低,即使应用血管紧张素Ⅱ作用后有轻微的升高但不明显[13]。可以猜测在高血压发病机制中Myd88 影响NF-κB和MCP-1 的表达具有相对独立性。另一方面,于新辉等[14]发现降压药物坎地沙坦可以有效抑制LPS诱导VSMCs IL-1β 和TNF-α 的释放,减少TLR4、My D88mRNA和蛋白的表达。降压药物血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对于炎症因子的抑制作用,有可能不单纯通过拮抗血管紧张素Ⅱ受体来实现的。

4 中药干预My D88

目前关于中药抑制My D88 的研究也通过抑制蛋白的表达,影响其依赖途径及干预My D88mRNA来实现。李卿姬等[15]通过补阳还五汤含药血清干预脂多糖诱导的体外培养人脐静脉内皮细胞后发现,补阳还五汤显著抑制My D88 的高表达,姜华等[16]通过益气活血复方抑制My D88,达到了相同的效果。解表的桂枝汤、参苏饮均可影响My D88 依赖途径,而黄连解毒汤和清开灵含药血清均可影响My D88 mRNA和蛋白的高表达[17]。

5 转录因子-κB

中药对于炎症因子My D88 的抑制可从多途径实现,但目前关于抑制My D88 特效的方法还有待研究。中药在此方面还有待进一步研究与开发。NF-κB属于广泛存在于各种组织中的一种转录因子,因其可以与多种因子发生特异性结合而在免疫反应、促进细胞的增长以及感染中起到重要的作用。NF-κB在静息状态下以无活性的方式存在于细胞质中,当外界信号( 如LPS等) 刺激时TRL4后,My D88 引起IL-1R相关激酶( IRAK) 自身磷酸化[18],导致I-κB的活化并降解,降解的I-κB激活NF-κB,启动转录相关基因的程序,至此,细胞因子得到释放。然而,释放的细胞因子进一步活化NF- κB,达到正反馈的效果,放大了炎症反应。由于此转录因子存在于细胞内,研究者大多通过特定组织来进行研究,王萌影等[19]通过对各用药组肾脏高血压大鼠血压降低情况及心肌细胞NF-κB表达结果的分析,用免疫组化法检测大鼠心肌细胞NF-κB的表达后发现,模型组大鼠心肌细胞NF-κB的表达明显高于空白组,具有统计学意义。证实在高血压左室肥厚的病程中,细胞内有NF-κB的高表达。刘晓玲[20]发现长期高脂高热量饮食能够诱导大鼠出现腹型肥胖及胰岛素抵抗,脂肪细胞明显肥大,脂肪组织中促炎转录因子NF-κB和PPARγ 表达增加,而降压药物血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂( AngiotensinⅡreceptor blocker,ARB) 缬沙坦可降低脂肪组织促炎症因子NF-κB的表达。

6 中药干预NF-κB

中药对于NF-κB的控制也通过抑制NF-κB的激活和表达来实现的。刘晓亚等[21]通过熄风解毒化痰饮抑制TLR4 /NF-κB信号通路及相关炎症因子的表达,改善高血压血管重塑过程。王萌影等[19]证实中药复方心舒康能够抑制心肌细胞NF-κB的激活和过度表达,提示心舒康通过对NF-κB激活机制中各途径的影响而达到抑制其过度表达的目的,在抗高血压靶器官损伤及心肌保护方面起到一定作用。陈偶英等[22]给予口服以平肝养阴、活血通络为治法的复方钩藤降压片NF-κB半定量检测。结果比较,复方钩藤降压片组、替米沙坦组均低于SHR空白组,由此猜测中成药复方钩藤降压片与替米沙坦可能通过调控p38MAPK、TLR4 信号通路,进而降低IL-1β、TNF-α 促炎细胞因子水平,升高IL-10 抗炎细胞因子水平,抑制NF-κB表达。

NF-κB相对于本研究其他因子的研究相对困难一些,但目前研究可得出降压药物可以对NF-κB产生一定的影响结论,且中药在抗炎症逆转录因子方面尚有许多价值。

7 细胞炎症趋化因子-1

已知高血压可导致血管内皮细胞的损伤,并且能够破坏微小血管的结构和功能。许多研究已经证实MCP-1 是CC类细胞炎症趋化因子中的一员,其释放取决于血管内皮细胞受到的损伤。结合相关的试验与临床研究表明高血压与MCP-1 存在相关性。 高血压早期NF-κB激活后,可刺激MCP-1 的激活。 Li等[23]通过动物实验表明MCP-1 受体在巨噬细胞积聚中具有独立的影响作用,徐梦丹等[24]证实了自发性高血压大鼠中各靶器官组织MCP-1 /CCR2 的表达显著升高。临床实验也发现,MCP-1、IL-8 在H型高血压中表达明显升高[25],刘佳等[26]实验证明,高血压组病人血清MMP-9 、MCP-1 、HOMA-IR及CCA-IMT两两双变量直线相关分析显示均两两正相关,且具有统计学意义( P < 0. 01 ) 。相应的,多数降压药物抑制MCP-1 / CCR2 在靶器官及外周血的表达,研究人员对自发性高血压大鼠中用氯沙坦和替米沙坦能够发挥对靶器官的保护作用,同时抑制MCP-1 /CCR2 在靶器官及外周血的表达,并且说明氯沙坦和替米沙坦对MCP-1,CCR2 的抑制作用是独立于其降压作用的[24]。欧雅莉等[27]通过观察降压药物贝尼地平对原发性高血压病人血清超敏C-反应蛋白和单核细胞趋化因子-1 的影响。也得到了相同的效果。刘福林等[28]通过CCB类降压药物也得到了类似的实验结论。已知降压药物达到降压标准一般时间为一周甚至更长,但上述几类降压药物在血压未下降完全的试验主体身上均得出了MCP-1 下降的结果。上述降压药物可能通过影响炎症因子MCP-1 减少了炎症反应,从而侧面帮助了血压的下降,或者说降压药物通过多作用的方式达到了降压的作用。

8 中药干预MCP-1

刘峻等[29]发现益气活血中药复方能够上调CVB3病毒性心肌炎模型大鼠心肌细胞small inducible cytokine A2 ( MCP-1 / CCL2 ) 基因的表达。朱博钰等[30]实验证明芪葵颗粒可以降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白、血尿素氮、血糖、血脂水平,降低肾脏MCP-1 表达,改善糖尿病肾病大鼠肾脏病变; 可以减少高糖培养下人肾系膜细胞MCP-1 的mRNA和蛋白质的表达。可见,对于MCP-1,中药也是通过影响其基因的表达和蛋白的表达来达到抑制其作用来降压的。

9 结语

打造企业文化氛围的通路 篇6

企业环境氛围是企业通过直观的外显的环境所反映出来的风格和情调。它通过企业的厂区、车间、办公室、实验室、会议室的环境布置、装饰效果、宣传栏、标语口号以及员工的服饰、生活设施、文化设施等表现出来。企业精神氛围精神因素是企业文化的重要内容, 是指企业从企业家到普通员工所表现出来的整体精神风貌、理想追求、价值取向, 包括员工对待日常工作的基本态度, 员工之间进行交流的方式, 企业对员工的满意度, 员工对企业的忠诚度等。企业精神氛围是企业文化氛围的重要组成因素。企业制度氛围是企业文化强制性的集中体现, 它是指企业各项政策、规章制度及贯彻执行方式, 它虽然体现了一定的强制性, 但在企业文化的管理过程中, 其强制程度随着员工价值理念的逐步强化而减弱。

优秀的企业会把文化当成员工的一种待遇, 如何留住人才是一个永恒的企业课题, 优秀人才总是跳槽而去, 平庸的员工总是赖着不走, 这是很多企业都必须面对一个矛盾。最为直接有效的激励方式就是薪酬分配, 美国哈佛大学的专家发现, 在缺乏激励的环境中, 员工的潜力只发挥出20%～30%, 甚至可能引起相反的效果;但在适宜的激励环境中, 同样的员工却能发挥出其潜力的80%～90%。

毋庸置疑, 企业每一位成员都想得到而又不可能都得到企业所拥有的最大化的分配资源, 将这些资源优先分配给成绩优异的员工, 是必然的选择。但并不是所有的员工都在追求最大的工资及福利的回报。虽然有些企业给骨干员工以极其丰厚的工资待遇, 但是他们并不满意, 反而愿意到别的工资、福利相对低的单位去, 这是因为后者有良好的文化氛围, 和谐的人际关系, 愉悦的工作环境, 良好的企业形象, 有思想有魅力的企业家。所以良好的企业文化氛围也是人才激励重要的一部分。

一个优秀的企业要有良好的战略、良好的组织结构、良好的流程、良好的企业文化氛围, 作为管理者还要有良好的风格。作为员工要有一流的素质和境界, 有良好的技能, 而这些的支撑核心, 就是企业文化。企业文化不解决赚钱的问题, 有文化的企业赚钱, 没文化的企业也赚钱。有的时候, 没文化的企业可能赚钱更多, 因为它造假、炒作、包装。但是企业文化能解决百年老店、长寿公司和可持续发展的问题。良好的企业文化对企业生存发展起到战略支撑的作用, 具有战略地位。

企业文化是一种氛围, 要形成一种正气, 形成一种积极向上的氛围, 形成一种崭新的精神面貌。企业有没有文化, 不用看宣传资料, 看员工的表情就知道, 看员工的表情能够看出他的心态。企业有没有精气神, 员工在不在状态, 这些都是企业文化的表现。企业文化就是要形成这样一种状态, 一种态势, 大家都能感受到这个企业和那个企业不一样, 这就是企业文化所形成的氛围。这种良好的氛围比制度的管理更为让员工从心里接受。

如何打造良好的企业文化氛围首先要创新文化, 在知识经济时代, 创新的作用得到空前强化, 并升华成一种社会主题?由于企业文化的独特性将越来越表现为企业差别化战略和企业的核心竞争力, 创新变成了企业的生命源泉, 成功者往往是那些突破传统游戏规则, 敢于大胆创新, 不畏风险的人, 敢改变游戏规则的人, 也就是在思维模式上能迅速改变的人。所以企业自上而下每天都必须充满着创新, 通过自身主体创新确定性来对付明天的不确定性。创新是知识经济发展的第一推动力, 创新文化涵盖了产品、管理、服务和市场等各个方面, 成为企业经营活动中的主导文化。

在确定了战略目标、明确了市场定位以后, 企业的经营活动就要围绕市场营销组合策略迅速展开。企业在营销产品时应考虑该产品能否满足客户的需求、是否安全便利, 同时要拓展有效的营销渠道, 提高营销效率。美国思科系统公司信奉的企业信条是:“在未来的商场中, 不再是大吃小, 而是快吃慢。”学习文化将会给企业带来利益和机会。作为“学习型组织”的企业文化将更加受到关注。知识经济条件下, 最成功的企业将是个“学习团体”, 学习越来越成为企业生命的源泉。现代企业只能作为一个不断学习的组织, 才能够“善于创造、寻求及转换知识, 同时能根据新的知识与领悟而调整行为”。“比你的竞争者学得快的能力, 也许是惟一能保持的企业竞争优势”, 这正在成为共识。知识的积累只有学习, 创新的起点在于学习, 环境的适应依赖学习, 应变的能力来自学习, 这就需要一种重视学习、善于学习的文化氛围, 因而企业不再是一个终身雇佣的组织, 而是一个“终身学习的组织”。服务文化是现代市场发展的一个重要趋势, 就是服务竞争在现代市场竞争中的地位和作用越来越突出。强化营销服务理念, 实现“服务增值”。国外企业文化研究中首先使用的“服务增值”的概念, 值得重视。因为同样质量的产品, 可以因服务好而“增值”, 也可以因服务差而“减值”。质量概念, 不仅包括产品质量, 也包括服务质量。企业形象从根本上说是表现为产品质量和服务质量。服务的永恒主题是企业同客户、用户、消费者的关系问题, 这里包括如何使抱怨用户转化成满意用户、忠诚用户进而成为传代用户, 包括如何开发忠诚的顾客群, 包括如何使营销服务成为情感式劳动, 真正让用户引导决策, 进而引导产品开发的问题。这些都是打造企业文化氛围的通路。

细胞凋亡通路研究进展 篇7

1 线粒体通路

又称内源性凋亡途径。线粒体控制细胞在有氧环境下的生活和死亡, 是细胞生成ATP的主要场所。近年来的研究表明, 线粒体也是细胞发生凋亡的主要调控场所并参与了大多数细胞凋亡的调控过程。内源性凋亡途径可由多种因素诱发, 如细胞脱离了原来的生长环境、失去了赖以生存的生长因子或激素的支持、或者由于DNA损伤等[2]。在线粒体内、外膜之间存在线粒体通透性转变孔 (MPTP) , 线粒体膜通透性转变的发生在细胞凋亡中起着举足轻重的作用。引起MPTP开放的因素分为细胞外源性损伤和细胞自身衰老两方面, 外源性损伤 (如Ca2+超载、氧化应激过度、p H值过高、线粒体膜电位下降、能量衰竭、药物诱导等) 可导致细胞坏死和凋亡, 而细胞自身老化主要导致细胞凋亡[3]。在生理情况下MPTP周期性开放, 使膜间隙的正离子或质子进入基质, 从而防止膜间隙正离子的过度蓄积。

在各种促细胞凋亡信号作用下, MPTP不可逆地过度开放, 线粒体跨膜电位崩解, 呼吸链解偶联, 线粒体基质渗透压升高, 内膜肿胀, 位于线粒体膜间隙的细胞色素C (Cytc) 等促凋亡活性蛋白释放至胞浆内, 在ATP/d ATP存在的情况下, Cytc与凋亡蛋白酶活化因子-1 (Apaf-1) 形成多聚复合体, 活化Caspase-9前体, 导致下游效应者Caspase-3活化, 切割底物使细胞凋亡。其中, 活性Caspase-3是级联反应中关键蛋白酶, 是多种凋亡途径的共同下游效应部分, 作用底物大多是细胞中功能蛋白质, 它们参与DNA修复、m RNA裂解、类固醇合成及细胞骨架重建等过程[4]。在该过程中, 线粒体膜电位下降是凋亡的早期表现, 一旦线粒体膜电位损耗, 细胞就会进入不可逆的凋亡过程。细胞凋亡是一个需要ATP提供能量的过程。研究表明, 线粒体的能量储备在其中起决定性的作用, 细胞内ATP水平耗竭在25%~70%时细胞将以凋亡的形式死亡, 而大于70%时将以坏死的形式死亡[5]。Bcl-2家族控制着线粒体外膜和内膜的通透性, 因此是线粒体凋亡途径的主要调控者, 它们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用[6]。Bcl-2家族分为3类:促凋亡蛋白 (如Bak和Bax) 、抗凋亡蛋白 (如Bcl-2和Bcl-x L) 以及Bim、Bid等BH3-only蛋白。BH3-only是一类促凋亡蛋白, 通过抑制Bcl-2抗凋亡成员的活性或激活Bax/Bak样促凋亡成员的活性来调节细胞凋亡。Bcl-2家族中, Bax是线粒体途径的主要介导者[7]。Bax经活化后, 从胞质转入线粒体, 线粒体膜通透性破坏, 致Cytc等释放而介导线粒体途径的细胞凋亡。

2 死亡受体通路

该途径为胞外信号所诱导的细胞凋亡途径, 因此也称外源性凋亡途径。哺乳动物细胞表面至少有8种死亡受体:Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、Dc R1和Dc R2, 它们都属于肿瘤坏死因子α受体家族成员。在这些死亡受体中最典型的是Fas和TNFRs。

2.1 死亡因子受体 (Fas) /死亡因子Fas配体 (Fas L) 死亡通路

Fas又称APO-1 (即CD95分子) , 属于Ⅰ型膜蛋白。Fas主要以膜受体形式存在, 在细胞凋亡中具有信号转导作用。Fas L属于细胞表面的一种Ⅱ型膜蛋白。Fas L可与Fas结合, 导致Fas胞内的死亡区形成三聚体的活化形式, 随后募集FADD (Fas相关死亡结构域蛋白) , Fas L-Fas-FADD形成了死亡诱导信号复合物 (DISC) , DISC形成后引起胞质内前半胱胺酸天冬酶8 (Procaspase-8) 分子激活.而后激活的Procaspase-8相互连接, 进一步自我激活启动下游的Caspase相关蛋白酶级联反应, 最终导致细胞凋亡[8]。另一方面激活的Caspase-8也可将位于胞浆的Bid切割成截断的Bid (t Bid) , t Bid有很强的促凋亡活性, 再次作用于线粒体释放Cytc, 通过Caspase-9/3发挥促凋亡作用[9]。该通路中, DISC的形成是级联反应的关键步骤[9]。

2.2 TNFR死亡通路

TNF通过TNFR-I和TNFR-Ⅱ介导其生物学活性。TNFR-I包含具有转导细胞死亡信号所必需的一段高度同源性的氨基酸序列 (即DD) , TNFR-Ⅱ缺乏DD, 但这两个受体都可介导凋亡[10]。TNFRs不具有酶解活性, 但可募集其他分子转导信号。当与TNF结合后, TNFR-I三聚体化, 然后募集一个衔接蛋白TRADD (TNFR-associated death domain) 。TRADD可以引起两条信号转导通路的激活: (1) 通过招募FADD诱导细胞凋亡, FADD通过募集和活化Caspases激活凋亡通路; (2) 通过肿瘤坏死因子受体相关蛋白2 (TRAF-2) 和诱导转录因子 (RIP) 活化。TRAF-2和RIP活化NF-κB诱导激酶 (NIK) , NIK使NF-κB抑制蛋白发生磷酸化, 并促进NF-κB的降解和释放, 后者转位至核, 激活一系列基因表达[11], 导致细胞凋亡发生。

3 内质网通路

细胞凋亡除上述两种经典途径外, 还存在内质网通路, 是近些年才发现的一种新的凋亡途径。内质网广泛存在于真核细胞中, 参与蛋白质合成、折叠和寡聚化, 钙的储存、脂类代谢、类固醇代谢的合成等, 是细胞内重要的细胞器。内质网作为信号传导的枢纽平台, 在细胞凋亡过程发挥着重要作用。内质网通路即内质网应激 (ERS) 引起的细胞凋亡, ERS是指很多病理生理刺激, 如氧化应激、缺血缺氧、钙稳态紊乱及病毒感染等, 能够引起内质网腔内未折叠与错误折叠蛋白蓄积以及Ca2+平衡紊乱。ERS是机体对各种病理生理刺激的一种自身保护性防御机制, 这种作用既能修复早期或受损较轻的细胞, 又能清除过度损伤的细胞, 为维持机体的生理平衡和内环境稳态起到重要作用[12]。适度的ERS可通过促进内质网处理未折叠及错误折叠蛋白等降低损伤;而持久或严重的ERS则可引起细胞凋亡[13]。根据诱发原因不同, ERS可分为3种类型:未折叠蛋白反应 (UPR) 、内质网超负荷反应 (EOR) 和固醇调节级联反应。UPR是介导ERS的最重要的信号机制, 其主要是由一个ER分子伴侣葡萄糖调节蛋白/免疫球蛋白重链结合蛋白 (GRP78/BIP) 和3个ER应激感受蛋白, 即RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶 (PERK) 、激活转录因子 (ATF6) 和需肌醇酶-1 (IRE-1) 所介导的保护性应激反应[14]。目前, 已知内质网应激诱导细胞凋亡的途径有3条: (1) CHOP/GADD153基因的激活转录; (2) JNK的激活通路; (3) 内质网特有的半胱氨酸蛋白酶Caspase-12的激活通路[15]。

3.1 CHOP通路

CHOP通路是调节内质网应激诱导凋亡的主要通路。CHOP/GADD153 (生长停滞及DNA损伤基因, growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153) 是内质网应激特异的一个转录因子, 在正常情况下, CHOP主要存在于细胞质中, 含量很低。而PERK、ATF6、IRE-1分别与分子伴侣GRP78/BIP结合, 处于无活性状态;在细胞处于应激状态下, IRE-1、PERK和ATF6的活化均对CHOP产生诱导, 促使CHOP的激活, 其表达显著增加, 过量表达的CHOP聚集在细胞核内, 促进细胞凋亡。目前的研究仅对CHOP的上游调节机制有了一定了解, 其下游的调节机制还不明确, 考虑可能与TRB3相关。TRB3是一个激酶类似蛋白, 属于Tribbles假性蛋白激酶家族一员, 它能够直接与丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶AKT结合, 抑制其活性。AKT是重要的抗凋亡信号分子, 因此CHOP可能是通过诱导TRB3的表达进而抑制AKT的活性, 促进细胞凋亡[16]。此外, CHOP诱导细胞凋亡还可能是通过调节Bcl-2蛋白家族的促凋亡和抗凋亡之间的平衡。CHOP可以上调促凋亡基因Bax/Bak, 可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达, 减弱其抗凋亡能力, 敏化内质网应激反应, 促进凋亡[17]。比如CHOP与c AMP反应元件结合蛋白 (CREB) 形成二聚体能抑制Bcl-2蛋白的表达, 促进线粒体对促凋亡因素的敏感性[18]。

3.2 JNK通路

JNK (c-Jun氨基末端激酶, c-Jun N-terminal kinase) 也被称为应激活化蛋白激酶, Xia等[19]在大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞的培养过程中发现, 去除神经生长因子可以使PC-12细胞发生凋亡, 而PC-12细胞中的JNK和p38通路都是激活的, 从而在神经元中首次发现了JNK的促凋亡作用。目前认为JNK通路机制主要有两个[7]: (1) 通过转录依赖的方式调节下游凋亡相关靶基因的转录和凋亡蛋白的表达而介导死亡受体途径及线粒体途径的细胞凋亡。JNK被刺激因素激活后, 可从细胞质转移到细胞核中, 通过磷酸化激活c-jun、c-Fos等转录因子, 而调节下游凋亡相关靶基因的表达。如JNK入核激活转录因子后有诱导Fas L、TNF等配体蛋白的表达, 而启动死亡受体途径的细胞凋亡。 (2) 通过非转录依赖的方式直接调节胞质内靶蛋白的活性而介导线粒体途径的细胞凋亡, 譬如可上调BH3-only蛋白如Bim、Bid、DP5的表达, 活化Bax等促凋亡蛋白介导线粒体途径的细胞凋亡, 此过程不依赖新基因的表达。

3.3 Caspases通路

Caspase-12 (胱天蛋白酶-12) 是Caspase亚家族成员, Caspases-12产生于内质网, 并仅在内质网应激时被活化, 是介导内质网应激凋亡的关键分子。在正常生理情况下, Caspase-12与其他的Caspase一样以无活性的酶原形式存在, 在内质网应激损伤状态下, Caspase-12酶原特异激活, 并协同其他内质网应激分子激活Caspase-9酶原, 再通过Caspase-3途径导致细胞凋亡[20]。

研究表明, 这3种凋亡途径也并非完全独立, 在某些情况下它们存在相互联系。譬如内质网通路和线粒体通路之间, 促凋亡Bcl-2家族成员Bak和Bax可迅速清空内质网Ca2+, 使线粒体对Ca2+内流和Cytc释放敏感, 从而调节Cytc释放的动力学并调节凋亡[21]。另外线粒体途径与死亡受体途径也不能完全分开, 两者除了可在Caspase-3处会合并通过Caspase-3激活下游底物而呈现凋亡细胞的共同特点外, 另一个汇合点是Bcl-2基因产物。最近研究结果显示:Bcl-2可通过干扰死亡受体途径而抑制细胞凋亡, 并提出了一型细胞和二型细胞的概念。Bcl-2对死亡受体凋亡通路不起作用的细胞称为一型细胞, 反之则称为二型细胞。二型细胞可通过死亡受体途径激活的Caspase-8而酶切Bcl-2家族中Bid, 从而进入细胞凋亡的线粒体途径[22,23]。

4 展望