细胞因子测定及应用

2023-06-11

第一篇：17细胞因子测定及应用

流式细胞仪分析技术及应用(课件)

流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

流式细胞仪分析技术及应用

第一节概述

第二节数据的显示与分析

第三节流式细胞仪技术要求

一、工作原理

一、参数

一、免疫检测样品制备

二、散射光的测定

二、数据显示方式

二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

三、荧光测量

三、设门分析技术

三、免疫胶乳颗粒的应用

四、细胞分选原理

四、流式细胞技术的质量控制

第四节流式细胞仪技术的要求

第五节、流式细胞仪的科研应用

第六节

流式细胞术在临床检测中的主要应用  流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

 流式细胞术发展史

1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究

1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞

1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器

1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂

目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司;BACKMAN COULTER公司

 流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

主要特点：1.单个细胞水平分析;2.多参数分析(同时多种荧光素标记)水平分析;3.灵敏度高;4.可分析大量细胞;5.速度快： 5000-10000个细胞/秒;6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况;7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。

第一节概述

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。分为三大类：(1)类为台式机(临床型)：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机(科研型)特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性细胞组成

细胞功能

一、工作原理大小

细胞表面/胞浆/核--特异性抗原

①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发粒度

细胞活性

效率;②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术， DNA, RNA含量

胞内细胞因子

保证检测的灵敏度和特异性;③用计算机系统对流动的单细蛋白质含量

激素结合位点

胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证钙离子, PH值, 膜电位酶活性

了检测速度与统计分析精确性。概括为三个系统结构：(1) 液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液(PBS或生理盐水)：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。

(2) 光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射

1 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。

主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：

1、长通滤片：(LP) ：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。

2、短通滤片(SP) ：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。

3、带通滤片(BP) ：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。

(3) 数据处理系统

流式细胞仪与显微镜的区别

区别

流式细胞仪

显微镜

光源

激光

自然光、灯光对象

细胞、生物粒子

细胞、组织等承载工具鞘液及流动室

载玻片检测信号光学信号

形态及染色放大方式 PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计

计算机，>5000 人工，200 结果

多参数，综合分析简单，单参数

二、散射光的测定

散射光信号不依赖任何样品的制备技术(如染色)，因此称为细胞的物理参数。(波长与激光相同。)主要分为: ①前向散射光(0°散射)FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

②侧向散射光(90°散射)SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。

目前采用FSC(表示细胞大小)SSC(表示细胞内颗粒的复杂程度)这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

三、荧光信号(FL)测量

当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：

①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号;

②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件(滤光片、双色分光镜等)，可以获取荧光信号。

通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1 、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。

常配置的激光器波长为488nm。

633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy

荧光信号的宽度(如FL2-W)常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号(FL2-A)与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”(gate)方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号(FL2-W)要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。

四、细胞分选原理(图示见上)

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。

1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。

2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。

3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液

2 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度

(二)FCM 分选指标

分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个/秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。

分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。

分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。

分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节数据的显示与分析

常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术

目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个(字或双字)。同时当只检测1 个参数时(如DNA)，可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

一、参数

FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。

二、数据显示方式

(一)单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度(FSC、SSC、FL

1、FL2)四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。

(二)双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL

1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体;X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。

(三)二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

(四)三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL

1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。

(五)流式细胞仪的多参数分析--------- 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。

三、设门分析技术

Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四节流式细胞仪技术的要求

一、免疫检测样品制备

细胞样品制备要求：

1、单细胞悬液;

2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml;

3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底;

4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色;

5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：

单细胞悬液的保存：

3 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

机械法(金属网引起细胞破碎)

深低温保存法(一年) 酶处理法(选择最适宜消化酶)

乙醇或甲醇保存法(2周) 化学试剂处理法(导致细胞成活率降低)

甲醛或多聚甲醛保存法(2月) 表面活性剂处理法注意事项：

1、新鲜组织标本应及时进行处理保存;

2、根据实验目的选择最隹的固定方法;

3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。

4、需注意不同组织，选择相应的方法;如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法;往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞;

5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。

二、常用的荧光染料与标记染色适用条件: ①有较高的量子产额和消光系数;②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-eεCL) F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收;④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差;⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度(激发波长)的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长(发射波长)的荧光。

1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：

FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器;APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。

2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质; 如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管(即PMT1);PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管(即PMT2);PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管(即PMT3 或PMT4),等等

常用的几类荧光染料

(二)免疫荧光标记

名称染料激发发射光溶解性对PH敏感特点荧光染料与细胞成分的四种结合方波长或荧光性式

结构亲和式

颜色

嵌入结合

共价键结合异硫氰酸荧FITC488绿易敏感易溶于水，与抗体结光素合不影响特异性52

5荧光标记抗体特异性结合得州红Texas 568红不易不敏感稳定，偶联后量子产免疫荧光标记方法

red额低615直标：干扰少,但需购买多种单抗

藻红蛋白PE488橙间标：步骤多,干扰多,不需标记多种575抗体

易不敏感具较多发光基团，消藻青蛋白PC488红组合标记

光系数和量子产额高

别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复PEcy5488红易不敏感减少交叉，成本高合染料670

三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术

是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。

4 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

四、流式细胞技术的质量控制

(一)单细胞悬液制备的质控

(二)免疫荧光染色的质控适当的制备方式(不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等)

温度试剂选择

pH 样品处理(蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等)

染料浓度实体组织来源标本用机械法

固定剂温度25~37℃，pH7.0~7.2

(三)仪器操作的质控

光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异(CV)。 PMT(光电倍增管)校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准: 保证计数的准确性。

(四)免疫检测的质控

同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第五节、流式细胞仪的科研应用

1、细胞表型分析

2、胞内蛋白的检测

3、细胞周期和DNA倍体分析

4、流式标准小球定量

5、分选

6、细胞内钙离子测量

第六节、流式细胞术的临床应用

1、细胞周期和DNA含量分析

2、细胞凋亡的检测和分析

3、血小板及血小板活化的FCM 分析

4、造血干细胞(CD34+细胞)的检测

5、白血病和淋巴瘤免疫分型

6、网织红细胞分析

7、残余白血病检测

8、淋巴细胞亚群分析

9、肿瘤耐药基因分析

10、AIDS病检测中的应用

11、自身免疫病相关HLA抗原分析

12、移植免疫中的应用

1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： ① DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比;

② 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比;

③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：

即G0/

1、S、G2M ;G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。

在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。 DNA分析的临床意义

DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰

DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用

DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待

形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标细胞凋亡------(1)、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3(caspases-3)

-------(2)晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析;DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰

第二篇：细胞因子及其在化妆品中的应用

近年来，生物基因工程技术的发展给美容化妆品行业带来了全新的发展机遇，化妆品己经从传统的化学美容、植物美容走向生物美容与基因美容发展。例如传统的皮肤护理仅局限于油膜覆盖与保持水分等物理方法，而现在美容护肤理念开始转向细胞水平的护理，化妆品(用生物技术制造与人体结构相仿，且含高亲和力的生物精华物质的化妆品)己应运而生。如今，国际上越来越多的医药及生物工程技术专家投身于该研究领域，许多国家也都瞄准生物化妆品这一巨大市场，开发生物美容产品。将以生物工程技术制得的EGF(表皮生长因子)、透明质酸、酶和核酸等应用于化妆品，这一新的研究动态，也使人们认识到生物化妆品将给化妆品品质带来根本性的变化。

生物化妆品是指应用生物工程技术及其制品制得的化妆品，其主要成分生物活性多肽，大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极微，物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。细胞生长因子经过稳定的结构修饰或特殊的保护处理后，以一定的有效浓度添加到化妆品中，可以有效地与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞营养代谢，预防由于各种原因导致的皮肤损伤。正常护肤品中添加活性细胞生长因子还可以有效地促进皮下胶原细胞的功能，加速皮肤胶原细胞的生长，使细胞加速分泌胶原，从而达到抗皱及延缓衰老的作用。目前的生物美容产品中，将EGF(表皮生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、aFGF(酸性成纤维细胞生长因子)等细胞生长因子应用于化妆品中是一种创新的尝试。

1表皮生长因子(EGF)

EGF的发现及生物特性

EGF是1962年由美国科学家Cohen博士和Montalcini教授在试验中发现的一种可以促使皮肤细胞生长速度加快的成分，这种物质自然存在于人体皮肤细胞内，其含量的多少直接影响着皮肤新细胞的生长分化速度，从而决定着皮肤的年轻程度，这种成分被科学家定名为“表皮生长因子”。它的主要生理活性是诱导细胞(尤其是表皮基底层细胞)增殖、分裂分化，促进其生长。EGF通过与细胞膜上受体的结合，激活受体，产生一系列的信号从而加速皮肤新生细胞替代衰老细胞的进程，使皮肤细胞年轻化。

EGF的美容学应用

EGF在体内能促进机体表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞的生长、分裂和新陈代谢，促进微血管的生长，改善细胞生长的微环境。因此它对受损皮肤、敏感皮肤、创伤皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用，特别是对目前美容院中流行的换肤术后局部受损皮肤的修复，还能预防术后并发症的发生。此外，由于EGF等细胞因子能促进皮肤各种细胞的新陈代谢，对营养物质的吸收，可以使皮肤组织的平均年龄降低，改善皮肤的色素状况，达到美白、祛斑的目的;EGF还可促进轻脯氨酸的合成，促使胶原及胶原酶合成，分泌胶原物质、透明质酸和糖蛋白，调节胶原纤维，具有滋润皮肤，增强皮肤弹性，减少皮肤皱纹和防止皮肤衰老的作用。除此之外，EGF还能刺激肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，还可调节胶原降解及更新，使胶原纤维以线性方式排列，防止结缔组织异常增生，故而有缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成的作用，对防止和护理痊疮也有很好的效果。

2酸性成纤维细胞生长因子(aFGF) aFGF生物学特性

aFGF又称成纤维细胞生长因子(FGF1)。其作为内皮细胞移动和增生的诱导因子，而称为血管生发因子。aFGF能促进成纤维细胞的生长，提高了皮肤合成胶原蛋白的能力，从本质上改善皮肤的状况。

aFGF的美容学应用

aFGF是一种作用极强的有丝分裂原，对来源于中胚层和神经外胚层的多种细胞具有促进分裂综述的作用，可用于创伤、烧伤、溃疡等的治疗。具体主要表现在以下几个方面: 1.高效修复:促进成纤维细胞、表皮细胞代谢、增殖和分化;激活老化细胞，加速皮肤细胞的新陈代谢，修复断裂的浅表皮成纤维细胞，对皮肤创面有突出的快速修复功能。应用于皮肤组织的各种损伤，去除暗疮、痊疮、去痣后的小缺损，换肤后的脱皮、发红，果酸等导致的皮肤灼伤，磨削后的表皮损伤修复等具有显著效果aFGF能够加快创伤愈合，修复损伤组织，减少疤痕收缩和皮肤的畸形增生。

2.消除皱纹:促进细胞间质的形成，促进胶原蛋白的合成和分泌，促进弹性纤维合成和分泌，促进细胞间基质的增加，使皮肤细嫩健美、饱满有弹性，从而消除皱纹。

3. aFGF的使用方法:aFGF冻干粉配合溶媒，作为一个单品使用;也可以作为生物功效剂上的特异性受体，并通过促分裂效应使这些细胞发生分裂增殖，进而启动与加速修复进程。

3碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) aFGF生物学特性

bFGF又称成纤维细胞生长因子2 (FGF2 )属于拥有促进细胞分裂作用的FGF家族的一员，其参与一系列的生理过程:包括胚胎发育、细胞增生、组织修复、肿瘤生长和浸润。bFGF刺激多种不同的细胞进行有丝分裂、增殖和迁移，在皮肤和创面修复中都起重要作用。

bFGF的美容学应用

1.护肤、修复作用。bFGF的微碱环境，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，使肌肤富有弹性，使皮肤处于滑嫩的状态。

2.抗皱、防衰老作用的生长发育，不断以新的细胞取代老化细胞，因此产生防皱、祛皱作用。

3.美白、祛斑作用。更新衰老细胞，从而降低皮肤细胞中黑色素和有色细胞的含量，减轻皮肤色素的沉着

4.防晒及晒后修复作用。能迅速修复受损细胞，减轻紫外线辐射对皮肤造成的伤害。

5.防粉刺、祛疤痕作用。刺激皮肤肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，还可调节胶原降解及更新，从而缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成的作用。

4角质细胞生长因子(KGF)

KGF的生物学特性

角质形成细胞生长因子(KGF)是1989年由Rubin首先从人胚胎肺成纤维细胞的生长培养液中分离出来的单链多肤，分子量为2628 kDaoKGF由194个氨基酸组成，包含分泌所需的信号肽和N端的糖基化位点。基因序列分析表明KGF从属于成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor FGF)家族，也称FGF7 o KGF与FGF 1, FGF2相比，同源序列大约位于KGF编码区梭基端的2/3处。在这个同源序列区，KGF与其它成纤维细胞生长因子家族成员约有30%-45%的同源性。

KGF通过促进细胞的增殖、迁移、分化、存活、DNA修复以及诱导对活性氧具有解毒功能的酶的表达来加强上皮功能，从而保护上皮免于毒性物质的损伤。其主要生物学作用有:促有丝分裂作用、促进细胞迁移作用、调控细胞分化作用、抗凋亡作用、细胞保护作用等。

KGF的美容学应用

抗紫外辐射:KGF是一种多功能生长因子，其生物学功能有促进上皮细胞增殖与分化，辐射防护，维持细胞骨架稳定，可以作为防晒霜中的一种有效成分。

促进毛发再生:KGF作为单品配以溶媒直接在头部皮肤和表皮皮肤使用，也可以作为生物功效剂原料添加到膏霜、生发水、护发水中使用。

消除皱纹:KGF具有促进细胞间质的形成，促进胶原蛋白的合成和分泌，和分泌，促进细胞间基质的增加，使皮肤细嫩健

美、饱满有弹性，从而消除皱纹。KGF配合溶媒，作为一个单品使用;也可以作为生物功效剂原料添加到膏霜中使用

5血管内皮生长因子(VEGF)

VEGF的生物学特性

VEGF是唯一对血管形成具有特异性的重要生长因子，其他生长因子如成纤维细胞生长因子、用于包括血管内皮细胞在内的多种细胞，是不具特异性的。其主要生物学功能是: 1.促进血管内皮细胞增殖、血管生成作为特异内皮细胞分裂素，能够刺激体外培养的

内皮细胞的增殖(有丝分裂)。在核酸和蛋白水平诱导纤维蛋白溶解酶原的降解，参与细胞外蛋白水解和基底膜的降解，利于血管内皮细胞的迁移和增生。

2.增加血管通透性VEGF作为最强的血管通透性因子，能加强微血管通透性、内皮细胞葡萄糖转运，抑制血管平滑肌增殖与迁移，引起血浆物质包括血管收缩因子、纤维蛋白原和凝血因子向由平滑肌细胞组成的亚内皮层渗漏。

3.对血液动力学的影响静脉滴注VEGF可增加心率及心输出量，降低血管外周阻力，对心肌收缩力无明显的影响。

4.其他作用VEGF尚可作用于不同来源的内皮细胞使其形状改变并刺激增殖，核细胞及成骨细胞的迁移

VEGF的美容学应用

皮肤表皮组织无血管结构，其营养物质的供应及代谢产物的排泄主要通过真皮微血管。研究发现，VEGF可有效提高局部血管通透性，从而丰富的血运为成纤维细胞的增殖及胶原的合成提供充足的营养物质和其他生长因子，进一步促进细胞的分裂、增殖，改善皮肤微循环，使蜡黄、无光泽、不健康的皮肤变得红润有光泽。同时还能有效清除一些代谢障碍的细胞，如胞浆中导致皮肤黑斑的过氧化脂质沉着，从而使细胞中各种有害的代谢产物不容易积累形成暗疮和黑斑、黄褐斑，在皮肤的美白红润方面有着独到作用。另外VEGF与其他细胞因子的协同作用可以有效促进新生毛细血管的生成，从而提高真皮微血管的数目，改善皮肤的新陈代谢，起到延缓衰老的作用。

21世纪，美容将进入生物时代，生物科学技术的发展，已经深入影响到我们生活的方方面面，生物工程技术已成为当今世界发展最快、最具活力的科学和工业领域之一。随着越来越多细胞因子生物学效应的揭示，传统的混合成分、化学成分必将逐渐被细分的生物“因子”所替代;细胞因子美容化妆品将成为当代研究的热门课题，彻底突破当前化学、物理美容的理念，从细胞层次引导进入基因与生物美容的新时代。

第三篇：《植物细胞工程的实际应用》教学案例

教学目标分析(结合课程标准说明本节课学习完成后所要达到的具体目标)：

1、知识目标

(1)掌握作物脱毒、人工种子的制备过程和意义 (2)了解单倍体育种和突变体的利用 (3)了解细胞产物的例子

2、能力目标

搜集有关细胞工程研究进展和应用方面的资料，进行整理、分析和交流。

3、情感目标

(1)认同细胞学基础理论研究与技术开发之间的关系 (2)关注细胞工程研究的发展和应用前景。

学习者特征分析(结合实际情况，从学生的学习习惯、心理特征、知识结构等方面进行描述)：

本节教材内容对学生来说，第一课时已经学习了植物细胞工程的基本技术知识，这节课学习起来有一定的基础。教师可以采用学案导学、让学生理解记忆为主结合讨论的方法。但是，本节内容都是前沿科技，学生难以亲身体会，教师可以用多媒体相关图片等资料，增强学生的感性认识。

教学方法设计(结合教学重点与难点和学生情况描述所选择的具体方法)：

本节教学重点是知道植物繁殖的新途径及细胞产物的工业化发展，这部分内容通过学生自学基本能够掌握;教学难点是作物新品种的培育，这部分内容与必修二的知识联系较紧密，需要教师引领学生回忆单倍体的概念、特点等相关知识，还可以通过多媒体展示单倍体育种与杂交育种的图解，比较各自的优缺点，使抽象的知识清晰、明了。

教学过程(按照教学步骤和相应的活动序列进行描述，要注意说明各教学活动中所需的具体资源及环境)：

【旧知复习、导入新课】

1、回忆植物组织培养技术的基本原理和过程

2、思考利用这项技术能做哪些工作。 [学生]思考回答问题。

[设计意图]对前面的已学知识进行复习巩固，为后面的知识做铺垫。【教学内容】

一、植物繁殖的新途径

[教师]课件展示以下问题，指导学生根据问题阅读课本，找到问题的答案。

1、微型繁殖技术的概念是什么?

2、微型繁殖的原理是什么?

3、微型繁殖的优点是什么?

4、作物脱毒的原因、材料、方法、结果、优点分别是什么?

5、人工种子的概念、结构?

6、培育人工种子的技术、原理?

7、人工种子有哪些优点?

[学生]阅读教材，解决问题并回答问题：

1、概念：应用植物组织培养技术，快速繁殖优良品种植物(也叫快速繁殖技术)。

2、原理：植物细胞的全能性

3、优点：①繁殖速度快;②保持优良品种的遗传特性(因为是无性繁殖)

4、原因：长期进行无性繁殖的作物，易积累感染病毒，导致产量降低，品质变差。

材料：分生区(如茎尖)的细胞

方法：植物组织培养

结果：获得脱毒苗

优点：提高作物的产量和品质

5、概念：以植物组培技术得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。

结构：人工种皮+胚状体(或不定芽、顶芽、腋芽)

6、技术：植物组织培养

原理：植物细胞的全能性

7、优点：①后代无性状分离，保留优良特性;

②不受气候,季节和地域限制;

③贮藏、运输方便。 [设计意图]教师指导学生自己对以上知识点进行概括和梳理，便于知识的理解和掌握，使知识条理化，便于复习和记忆。

二、作物新品种的培育 [师生活动] [教师]引导学生复习旧知识

传统方法——杂交育种依据的原理是什么?优点和缺点分别是什么? [学生]思考回答问题。原理：基因重组。

优点：优良的基因通过基因重组，把两亲本的优良性状组合在同一后代中。缺点：要不断进行(多年)纯化和选择，才能得到符合理想要求的新品种。 [教师]进一步追问：用什么方法可以弥补杂交育种的缺点呢? [学生]思考回答问题。单倍体育种

[教师]引导学生复习旧知识

1、单倍体定义?

2、单倍体是如何形成的?

3、单倍体植株的特点? [学生]思考回答问题。

1、体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体。

2、由配子不经过受精作用而直接发育成的个体。例：蜜蜂中的雄蜂。

3、植株弱小，而且高度不育。 [设计意图] 联系旧知识，使学生认识到新技术的必要性，引发学习兴趣。

[教师]课件展示以下问题，指导学生根据问题阅读课本，找到问题的答案。

1、单倍体育种的方法、技术、原理和优点分别是什么?

2、突变体是如何产生的?其依据的遗传学原理是? [学生]阅读教材，解决问题并回答问题：

1、方法：花药离体培养获得单倍体植株，再用秋水仙素处理使染色体数目加倍。技术：植物组织培养

原理：染色体变异

优点：明显缩短了育种年限

2、产生：植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断地分生状态，易受到培养条件和外界压力的影响而产生突变。

遗传学原理：基因突变

[设计意图]教师指导学生自己对以上知识点进行概括和梳理，便于知识的理解和掌握，使知识条理化，便于复习和记忆。

三、细胞产物的工业化发展 [师生活动] [教师]引导学生完成以下问题：

1、细胞产物种类有哪些?

2、细胞产物运用的技术是什么? [学生]阅读教材，解决问题并回答问题：

1、种类：蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。

2、技术：植物的组织培养—愈伤组织培养

[设计意图]培养学生阅读、观察和分析问题的能力。

【课堂小结】

[师生互动]引导学生一起总结本节知识，构建知识网络。 [设计意图]形成知识结构，使知识系统化、结构化。

【巩固练习】课件展示当堂练习，规定时间让学生完成。

[设计意图]对所学知识及时巩固。

板书设计

植物细胞工程的实际应用

一、植物繁殖的新途径

1、微型繁殖

2、作物脱毒

3、神奇的人工种子

二、作物新品种的培育

1、单倍体育种

2、突变体的利用

三、细胞产物的工业化发展

技术应用(说明在教学中使用了哪些相关的软硬件)：多媒体与黑板有机结合

资源应用(说明在教学中资源应用的思路、制作或搜集方法)：

1、通过百度文库整理制作预习学案，学生课前预习。

2、通过百度搜索、百度文库下载相关资料，并结合教参制作课件，以展示问题、图片、知识网络和当堂检测题。资料引用(说明所引用资料来源出处)：

百度搜索、百度文库、人教版高中生物《现代生物科技专题》教参

评价方法或工具(说明在教学过程中将用到哪些评价工具，如何评价以及目的是什么)：

1、个人评价: 对积极发言的同学给与鼓励性评价，如果学生能正确回答问题，教师应及时给与表扬，若回答欠准确或思路不对，教师也不能批评或指责学生，而应该作出提示，引导学生得出正确答案，以免打消学生的积极性。这样通过课堂观察，教师便能及时了解学生的情况，从而作出积极反馈，正确的给予鼓励和强化，错误的给予指导与矫正，使他们不断品尝成功的喜悦，多鼓励，尤其是对中下学生，以促成其良性循环。

2、小组评价：以学习小组为单位进行，评价标准如下：

优：组内成员人人积极思考，踊跃参与讨论，互相学习与纠错，共同顺利完成本节课的学习任务。

良：组内成员大部分积极参与，较好地完成了本节课的学习任务。

差：组内成员没有合作意识，没有讨论、交流与互评等活动。

通过小组评价，可以增强学生的合作意识，从而增进合作交流技巧，使学生群体的智慧和思维可以共享，相互解释所学知识、能够相互帮助理解和完成作业，取得最佳的学习效果。教学反思(对整堂课进行总结评价、分析)：

“问题启发式”教学的效果还是很好的，它符合新课程改革的要求，充分体现了学生的主体作用，调动了学生的思维和积极性，学生在积极思考的同时，能够相互讨论，积极发言，同学们在相互借鉴的同时也很好的提升了自己的知识水平，同时这种“问题启发式”教学对培养学生的能力是很有帮助的。

由于时间有限，只有少数的学生发表自己的观点，需要在后面的学习中利用其它形式检验学生的理解情况。

第四篇：细胞培养在分子生物学中的应用

随着社会的进步，科学的发展，生物技术已经得到了很大的改进，下面我就从心肌细胞培养，植物体细胞培养再生技术体系，马立克氏病病毒分子生物学诊断技术研究，三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究，细菌与放线菌的16S rDNA、真菌26S rDNA D1/D2区及ITS区的分子鉴定体系，载体构建技术体系及其基因靶点的定点诱变和靶序列缺失、改造技术体系6个方面来研究细胞培养在分子生物学中的应用，以阐述细胞培养的重要性。

1.心肌细胞培养

培养心肌细胞能提供单个细胞的同源集落，在记录腔内可视并容易控制。培养方便，定量、重复性好，均一性不受神经体液因素，在分子生物学技术研究成熟心肌细胞(如Ikur分子基础的研究中应用广泛;

心肌细胞位于心肌内膜内。一般认为，正常成年心脏的心肌细胞不再分裂。因此，心肌细胞最初多采用动物或人的胚胎心脏以及刚出生动物的心脏，如乳鼠以及其他刚出生动物的心脏或动物、人的胚胎心脏，这就是ECM。但ECM与ACM相比，在功能和结构上均有差异：ECM用途存在一定的局限性，ACM更适宜做电生理和细胞膜离子通道的研究单个因素干预实验方面更具有代表性

[3-5]

[1,2]

;ACM在进行

。

2.植物体细胞培养再生技术体系

棉花是重要的经济作物之一，棉花生产对于我国棉农收入和国民经济的发展具有重要的意义。随着基因工程和分子生物学的发展，转基因技术正广泛地应用于现代植物育种中。然而，建立高效而稳定的植物体细胞培养再生技术体系是植物遗传转化和植物基因工程的基础。此外，棉属野生种中具有陆地棉栽培种所缺少的许多优良性状，通过棉种间的体细胞杂交技术获取种间杂种转育野生棉的优良性状是一条行之有效的技术途径，而建立一套适合这些野生棉种的体细胞胚胎发生和植株再生体系是体细胞杂交创造种间杂种的基础和先决条件。本研究在前人工作的基础上，以四倍体野生棉种毛棉(G.tomentosum Nutt& Seem)为材料，四倍体陆地棉(G.hirsutum L.)珂字棉201为对照，研究野生棉种毛棉体细胞培养过程中的影响因素，以建立适合于四倍体野生棉的体细胞培养体系。

[6]3.马立克氏病病毒分子生物学诊断技术研究

通过与SDS-蛋白酶K法、高纯度PCR模板提取试剂盒(宝灵曼公司产品)、NP<,40>-蛋白酶K法比较,研究小组建立了用TLS(三乙醇胺月桂酸硫酸盐)代替传统的SDS-蛋白酶K提取DNA的方法,对细胞培养物、血液样品提取DNA,经琼脂糖凝胶电泳、PCR检测,结果表明,TLS法是一种快速、简便的提取高质量DNA的方法.利用地高辛标记马立克病病毒(MDV)GA株BamHI-L及其六个亚片段制备核酸探针,与MDV1型(京-

1、MD<,11/75c)、MDV2型(SB-1)、MDV3型(Fc-126)的核酸进行分子杂交,结果表明L片段是MDV1病毒特异的,与MDV

2、MDV3的核酸无同源性,这与Ono等(1992)的报道:在非严格杂交条件下,MDV2 BamHI-F片段与MDV BamHI-L片段有同源性的结论不同.根据BamHI-L片段的核酸序列设计了针对pstI亚片段的寡核苷酸引物,建立了用0.3U Taq酶的10μl反应体系的微量PCR方法,通过对病毒感染细胞培养物DNA和京-1株接种鸡血液DNA的扩增,结果表明,该引物介导的微量PCR是MDV1特异的,MDV2(SB-1)、MDV3(Fc-126)及正常细胞DNA都没有任何扩增产物.敏感性试验表明微量PCR能从0.1pg京-1株感染细胞DNA中检测到MDV DNA,早期感染样品检测结果表明,微量PCR能从京-1株接种鸡的血液中于第5天检出MDV DNA.PCR产物的RFLP结构表明:京-1株和MD<,11/75c>株的产物在 BgII、TaqI、xbaI酶切位点上没有变化.

4.三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究

三羟异黄酮对肝癌的抑制作用研究,通过细胞培养发现其可诱导肝癌细胞凋亡。通过体外细胞培养和分子生物学技术,检测人肝癌细胞SMMC-7721凋亡过程中相关蛋白基因的表达,可以探讨三羟异黄酮诱导肝癌细胞凋亡的分子机制. 方法:应用体外人肝癌细胞系SMMC-7721细胞培养技术,采用MTT法观察三羟异黄酮对肝癌细胞的增殖抑制作用,选择合适的实验剂量.HE染色观察凋亡细胞的形态学表现,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA Ladder.采用细胞免疫组化检测三羟异黄酮诱导人肝癌细胞凋亡过程中相关蛋白p

53、Caspase-

3、Survivin的表达,采用RT-PCR法检测Caspase-

3、Survivin在基因水平的表达。

[7]5.细菌与放线菌的16S rDNA、真菌26S rDNA D1/D2区及ITS区的分子鉴定体系

细菌(包含放线菌)基因组有5S、16S和23S三种rDNA.16S rDNA大小在1500bp左右，其所代表的信息量适中，是进行分类研究的理想靶位。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rDNA把序列，并进行后续的DNA测序，与Genbank中已知序列进行同源性比较后判定细菌种类，可将细菌划分到属或种。真菌基因组中编码核糖体RNA的基因为26S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。利用rDNA的保守序列设计引物，对未知真菌的26S rDNA D1/D2区域序列或ITS区进行PCR扩增，测序后与Genbank中已知序列进行同源性比较，可将真菌划分到属或种。我公司具备完整的细菌和真菌分子鉴定成熟方案和技术操作体系，已顺利完成近万株海洋细菌与放线菌、霉菌、酵母和来源于土壤的微生物、植株体内生菌的分子鉴定工作。

6.载体构建技术体系及其基因靶点的定点诱变和靶序列缺失、改造技术体系

载体是外源基因导入宿主菌的必需媒介。依据目的基因的来源，灵活选择不同的克隆方法，包括从基因组中分离目的基因，由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行克隆和PCR体外扩增目的片段进行克隆等。同时，根据需要对特定的基因靶点进行定点诱变和靶序列缺失、改造。

【参考文献】

[1] Feng JL，Wible B，Li GR，et a1.Antisense oligodeoxynucleotides directed against Kvl.5 mRNA specifically inhibit ultrarapid delayed rectifier current in cultured adult human atrial myocytes.Grc Res，1997，80：572—579.

[2] Davidoff AJ，Maki TM，Ellingsen O，et a1.Expression of calcium channels in adult cardiac myocytes is regulated by calcium.J Mol Cell Caroliol，1997，29：1791-1803. [3] Pinsky DJ，Aji W，Szaboks M，et a1.Nitric oxide triggers programmed cell death(apoptosis)of adult rat ventricular myocytes in culture.Am J physiol，1999，277(3 Pt 2)：H 1189一1199.

[4] Schluter KD，Goldberg Y，Taimor G，et a1.Role of phosphatidylinositol 3-Kinase activation in the

hypertrophic

grouth

adult

ventricular cardiomyocytes.Cardiovasc Res，1998，40：174-181.

[5] Clark WA，Decker ML，Behnke—Barclay M，et a1.Cell coutact as an independent factor modulating cardiac my-ocytes hypertrophy and surrival in Long-term primary culture.J Mol cell cardiol，1998，30：139—155.

[6] 张巧，四倍体野生棉种毛棉的体细胞胚胎发生和植株再生研究[J].浙江大学农业与生物技术学院，2009. [7] 魏思枕，三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究[J].河北医科大学，2005.

第五篇：实验二常压蒸馏及沸点的测定

原油常压蒸馏提取轻质油产品

一、实验原理

1、蒸馏：将液态物质加热至沸腾，使之变为蒸气，然后使蒸气冷却再凝结为液体，这一过程就称为蒸馏。

2、常压蒸馏：就是在正常大气压（一个大气压）下进行的蒸馏。

3、根据油品沸点的不同，在蒸馏装置中把原油分割成汽油、柴油及重质油（＜200℃为汽油馏分、200-350℃为柴油馏分、＞350℃为减压馏分）

二、实验的仪器与试剂：

1、仪器：铁架台、蒸馏烧瓶、温度计、小三角烧瓶、加热套、冷凝管、橡皮管。

2、试剂：原油、沸石（或素瓷片）。

四、实验步骤：

1、安装仪器

根据流程图安装好仪器，温度计的位置应使水银球的上沿和蒸馏烧瓶的支管下沿在同一水平位置。

2、加料：把250ml原油通过漏斗加入到蒸馏烧瓶中，加入沸石（或素瓷片），塞好带温度计的塞子。

3、加热：加热前先通入冷凝水，然后再用加热套加热，并注意观察蒸馏烧瓶中现象和温度计的读数的变化。当瓶内液体开始沸腾时，蒸气逐渐上升，温度计水银柱急剧上升。这时应适当调小温度，使温度略为下降，让水银球上的液滴和蒸气达到平衡，然后再稍调高进行蒸馏。调节火焰，控制流出的液滴以每秒钟1—2滴为宜。收集＜200℃的馏分，当温度计读数上升至200℃时，换一个已称量过的干燥的小三角烧瓶作接受器，收集200—350℃的馏分。当温度达到350℃时，停止加热。

4、拆除装置：蒸馏完毕，先停火，后停止通水。拆卸仪器，其程序和装配时相反，即按次序取下接受器、接液管、冷凝管和蒸馏瓶。

五、实验结果：

称量所收集馏分的重量或量其体积，计算回收率

六、思考题：

1、在进行蒸馏操作时应注意什么问题？（从安全和效果两方面来考虑）。

2、蒸馏时，为什么要放入沸石？

3、温度计的位置应怎样确定？偏高或偏低对沸点控制有何影响？

七、实验中应注意的问题

1、在安装装置时，要保证整个装置的严密性，但接液管与接受器之间不能

密封。

2、温度计水银球的上沿与蒸馏烧瓶支管口的下沿在同一水平线上。

3、蒸馏烧瓶内的液体体积应占整个蒸馏烧瓶容积的1/3到2/3之间，不能太多，也不能过少。