脓毒症 (sepsis) 是由感染所引发的全身炎症反应综合征, 是ICU入住患者的首位死因[1]。严重脓毒症时, 急性肺损伤 (Acute lung injury, ALI) /急性呼吸窘迫综合症 (Acute respiratory distress syndrome, ARDS) 在多器官功能衰竭中出现最早, 且发生率最高。目前认为ALI/ARDS本质是一种肺内过度性、失控性的炎症反应[2]。其病理生理基础是中性粒细胞大量渗出, 导致广泛的组织损伤。因此, 采取不同的干预措施, 针对促炎/抗炎反应失衡的方向和程度, 是防治ALI/ARDS的关键[3]。α-硫辛酸 (α-lipoic acid, ALA) 是一种硫氰化合物, 天然存在于人类日常饮食的食物、动物组织以及植物中。研究显示, ALA可抑制巨噬细胞/Kupffer细胞促炎症细胞因子、NO以及ROS的产生而发挥抗氧化和抗炎症活性[4]。为探讨α-硫辛酸 (α-lipoic acid, ALA) 对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用, 在2011年3月—2012年11月, 该研究对ALA对脓毒症诱导的ALI中发挥保护效应进行了观察, 现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 主要实验试剂
ALA购自Sigma-Aldrich (纯度98%) , 采用基于双抗体夹心法的TNF-α, IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒, 采用其检测下限为5 pg/m L。丙二醛 (MDA) 和髓过氧化物酶 (MPO) 检测采用比色法, 试剂盒为南京建成生物工程研究所。其他试剂均为国产分析纯产品。
1.2 脓毒症急性肺损伤大鼠模型的构建及分组
雄性SPF级SD大鼠 (体重200~250 g) 购自南华大学实验动物中心。动物随机分为5组:①对照组 (或假手术组) :SD大鼠用10%水合氯醛生理盐水麻醉 (400 mg/kg) , 去除毛发并进行皮肤消毒后, 沿前腹正中线作3 cm长的切口, 取出盲肠, 然后逐层关腹。②模型组:取出盲肠后, 用4.0丝线在距盲端1.5cm处结扎, 用18号针头在盲肠结扎处远端队穿刺2次, 挤出少量粪便, 随后将盲肠回纳入腹腔中, 逐层关腹。③~⑤ALA干预组:术后2 h分别予30 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg ALA腹腔注射, 12h后给予第二次注射。72 h后处死大鼠用于下一步研究。
1.3 肺组织湿干比测定
大鼠安乐死后, 取各组右肺下部, 获得湿重, 然后在烤箱内60℃放置48 h, 获取干重。计算肺湿/干比值。
1.4 动脉血气分析
获取处理后大鼠动脉血, 采用全自动血气分析机 (NOVA-K) 检测Pa O2/Fi O2。
1.5 MDA含量的测定
按试剂盒提供的步骤分别加入测试样品及试剂, 混匀后95℃水浴40 min, 4 000 r/min离心10 min, 测定上清中OD值 (波长532 nm) , 结果以nmol/m L表示。
1.6 髓过氧化物酶 (MPO) 活性测定
肺组织加入50 m M KH2PO4 (含5 m M十六烷基三甲基溴化铵, p H=6) 后超声破碎, 并经三个冻融循环后, 4℃、14 000 g离心10 min。20μL组织上清液与40μL分析缓冲液 (含0.167 mg/m L二盐酸邻联茴香胺和0.000 5%H2O2) 混合后, 3 min内于460 nm处动态测定MPO的活性。MPO的活性计算为460 nm处1 min内吸光度的改变 (ΔA) , 用ΔA/min g protein表示。
1.7 支气管肺泡灌洗液 (BALF) 的采集以及细胞因子测定
在大鼠右主支气管部位对右肺进行结扎, 气管插管后注入5m L无菌PBS并从左肺收集BALF。利用ELISA法测定BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。
1.8 统计方法
采用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量资料用 (±s) 表示, 组间比较采用one-way ANOVA分析后行Student-NewmenKuels q检验。
2 结果
2.1 各实验组大鼠血气分析
大鼠动脉血气分析Pa O2/Fi O2结果如图1所示。与正常对照组相比, 模型组Pa O2/Fi O2含量显著降低, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。不同浓度ALA干预后, Pa O2/Fi O2进一步增高。
1:对照组;2:模型组;3:30 mg/kg ALA干预组;4:50mg/kg ALA干预组;5:100 mg/kg ALA干预组注:*P<0.01 VS对照组;#P<0.05 VS模型组。
2.2 肺湿干比情况
模型组比高于正常对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。经ALA干预后, 肺湿干重比均低于模型组, 且100 mg/kg ALA处理后, 肺湿干重明显低于30 mg/kg和50 mg/kg组, 见图2所示。
注:*P<0.01 VS对照组;△P<0.05 VS模型组;▲P<0.05 VS 10mg/kg组。
1:对照组;2:模型组;3:30 mg/kg ALA干预组;4:50mg/kg ALA干预组;5:100 mg/kg ALA干预组注:*P<0.01 VS对照组;#P<0.05 VS 30 mg/kg和50 mg/kg组。
2.3 各组肺组织中MDA和MPO的变化
模型组MDA和MOP含量显著高于正常对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。不同浓度ALA干预后, 肺组织中MDA和MPO水平随着ALA浓度的增高而降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
2.4 各组BALF细胞因子含量测定
实验各组各时间点BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6水平见表2所示。与对照组相比, 模型组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显增高。不同浓度ALA干预后, TNF-α、IL-1β和IL-6含量进一步降低。
注:*P<0.05 VS对照组;△P<0.05 VS模型组;▲P<0.05 VS 10 mg/kg组。
3 讨论
脓毒症是ICU患者死亡的首位死因。在疾病的发生过程中, 肺是最先被累及的器官。其主要的病理生理学表现为肺的顺应性下降, 有效呼吸容积减少以及气/血比例失调。该研究采用经典的大鼠盲肠结扎穿刺法建立脓毒症肺损伤动物模型[5], 观察ALA对ALI大鼠气体交换、肺水含量、细胞因子含量以及肺组织中MDA和MPO活性的变化。结果显示, 大鼠盲肠结扎穿刺法建立的急性肺损伤模型中上述各项指标均与对照组相比差异有统计学意义, 这表明ALI模型成功。ALI发生时, 因为肺组织水肿导致的顺应性改变, 以及通气血流灌注比例异常, 临床上常表现为难治性低氧血症。在治疗过程中, 肺换气功能的改善是评价ALI病情的重要依据[6]。目前针对脓毒症所致的治疗是研究的热点。近年来, 由于中药具有毒性低, 药源充足, 在防治脓毒症所致ALI中日益受到重视。ALA是目前已知的活性最强的抗氧化剂, 它不但可清除体内自由基和活性氧, 螯合铜、汞、镉等金属离子, 同时也能与其他抗氧化剂相互作用, 形成独特的抗氧化再生循环网络。Pa O2/Fi O2是最常用的评价肺气体交换简便而有效的指标。由于Pa O2/Fi O2受吸氧浓度的干扰小, 因此能真实地反应体内的缺氧状态。该研究运用Pa O2/Fi O2来评估ALI的保护效应, 结果显示, 不同剂量ALA处理后, Pa O2/Fi O2得到了明显的改善, 表明ALA能有效提高肺组织的氧合状况, 从而改善肺的换气功能。肺湿/干比反应的是肺组织中水的含量, 常用于评价肺水肿的严重程度。本研究显示, 不同剂量的ALA可降低脓毒症诱导的肺水肿, 表明ALA可能在一定程度上改善肺微血管的通透性, 从而抑制肺内组织液的渗出。肺组织中中性粒细胞积聚是ALI发生的关键, 并直接影响到患者的预后。因此抑制中性粒细胞渗出可减轻ALI[7]。该研究采用MPO的活性间接评价中性粒细胞的渗出。结果发现MPO水平随着ALA浓度的增高而降低。同时在BALF中也发现中性粒细胞释放的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平也受到了一定的抑制。
综上所述, ALA可减轻脓毒症急性肺损伤大鼠肺部气体交换功能, 抑制炎症反应, 从而发挥对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用。
摘要：目的 探讨α-硫辛酸 (α-lipoic acid, ALA) 对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用。方法 SD大鼠根据不同实验目的随机分为对照组;模型组和ALA干预组。其中模型组采用盲肠结扎穿刺致脓毒症急性肺损伤大鼠模型。ALA干预组在模型组基础上分别给予浓度为10 mg/kg、30 mg/kg和200 mg/kg ALA腹腔注射。术后72h后获取血液及肺组织标本。检测动脉血气指标、肺湿干重比、支气管肺泡灌洗液中TNF-α, IL-1β和IL-6水平, 以及肺组织中丙二醛 (MDA) 水平及髓过氧化物酶 (MPO) 活性。结果 与正常对照组相比, 模型组PaO2/FiO2含量显著降低, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。不同浓度ALA干预后, PaO2/FiO2进一步增高。模型组肺湿干重比降低, 100 mg/kg ALA处理后, 肺湿干重明显低于30 mg/kg和50 mg/kg组;模型组MDA和MOP含量显著高于正常对照组, ALA干预后, 肺组织中MDA和MPO水平随着ALA浓度的增高而降低;此外, 模型组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显增高。ALA能进一步降低TNF-α、IL-1β和IL-6含量。结论 ALA可减轻脓毒症急性肺损伤大鼠肺部气体交换功能, 抑制炎症反应, 从而发挥对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用。
关键词：α-硫辛酸,脓毒症,急性肺损伤
参考文献
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