otdr测量步骤

2022-06-21

第一篇:otdr测量步骤

GPS测量步骤

第一步:开机→双击hi-rtk road→进入菜单界面。任何工程在测量或者是交桩之前都必须新建或者打开要交桩的工程,在调试参数!!!

第二步:点击项目新建或者打开已知项目名称。

第三步:点击参数椭球84和北京54坐标,其次投影就是高斯三角带114,椭球转换盒平面转换都是无,特殊情况须在平面转换里设置四参数,最后点击保存。

第四步:连接GPS,先连基站,如果基站过期就要点注册否者不能正常测量,接着设置基站,如果基站是架在已知点上就要在点库里找到该点,不是就要测量(点平滑)该点坐标,天线高须用钢尺测量,数据链就是外部数据链,其他就是电文格式调成3.0点确定即可。 第五步:断开基站的GPS,连接移动站的GPS,数据链就是内置电台,频道必须要和电台的频道一致,其他也是把电文格式调成3.0,点确定即可。

第六步:点击测量,F1功能帮助,平滑就是踩点,一般采集的点都是在碎部测量里,碎部测量是一个小菜单里面有7个子项目要连直线,点击线放样,在记录点库找到要连接的两点即可,后面3个子项目都是按类型添加未知坐标的点。

第七步:要想知道两个坐标之间的距离点击工具→间接测量→距离方位→在记录点找到该点,或者输入该点坐标即可。

注:以上就是GPS用电台测量的主要步骤须牢记!!!

第二篇:隧道工程测量的步骤

隧道工程测量的步骤———送给初入隧道施工测量之门的同僚

当你接到隧道施工工程,无论是被派遣或私人老板雇佣,第

一、要先做隧道进口和出口控制网,为保证进出口坐标系统一致,需要以导线形式或三角锁形式联测,当然GPS更好。如果有支洞,斜井,不管几个均需要将进口的控制点纳入整个控制网中,观测、平差计算。其目的是为了保证所有控制点坐标、高程一致,同精度,防止隧道贯通出现偏差。如果设计单位在这些部位提供的有平面、高程控制网点,你一定要进行复核测量,以免误用而造成不可挽回的经济损失。如果工程是国家正规工程,你应在施测前或过程中上报监理一份布设控制网的设计报告,在结束的时候报一份技术总结供审批。没有要求的或工程较小,这两项可合并一起,在建立控制网后写出报批。

第二、应根据控制网做好贯通误差估算,贯通误差限差要求请见相关规范。如果贯通误差大于规范要求,需要对控制网进行优化,以满足规范要求。

第三、当控制网建立后(包括控制网点复核测量合限),即可按照设计图纸提供的坐标,将隧道轴线包括支洞、斜井轴线方向控制点在实地稳固标定,位置应选在开挖区以外的适当位置,防止被破坏,但又不要离开挖区过远,使用不便。上述工作完成后,即可进行隧道进出口包括支洞,斜井进口的洞脸开挖放样。开口线的测定应依照图纸,并换算出与控制轴线点的相互关系,用全站仪采用逐近法直接测定。同时应测定洞脸开挖前的原始断面图或测绘不小于1/200的地形图,有地形图软件的话,在室内切出断面图,以供工程量计算之用(如果测地形图,需征得现场监理同意后方可或要求他旁站)。注意:应根据图纸核对洞脸实际里程是否正确。防止造成超欠挖。如果无免棱镜功能全站仪,在洞脸开完逐渐向下的过程中,应将开挖后的断面逐渐测下来,随时检查是否存在欠挖部位,也免得开挖完成后,测绘断面困难,

第四、当洞脸形成后,根据图纸,及施工组织设计和措施,将隧道的轮廓开挖线在洞脸上标出,其轮廓点间距不应大于50cm。为了不至于欠挖,轮廓点可大于半径5cm放样,一般宁超不欠,但不可过大免得形成过量超挖。

第五、当进洞之时,应根据隧道体型断面(单圆心还是多圆心)、隧道平面线型,用程序型计算器编制计算程序,以便放样定点计算。隧道的轮廓点的测定宜用带激光的全站仪直接在开挖掌子面测定坐标、高程,输入计算器计算后根据计算结果改正位置,以逐近法确定,一般不超过2次即可。

第六、洞内控制应随着隧道的掘进延伸而布置,其布置形式以导线为好。导线点宜布置在隧道的一侧,导线点间距应不大于200m。对于3公里以上的隧道等级不低于四等。放样控制点距开挖面距离不大于50m为宜。如果隧道比较短且平面线性为直线,可采用激光准直仪比较方便。对于激光准直仪的安装调试请参考相关资料,不在赘述。

第七、在进行隧道开挖轮廓点放样中,应随时检查凸出部位的欠挖,并标出范围,供处理,以免过后处理困难。

第八、根据设计或监理要求,及时测定隧道开挖断面图,断面一般5到10m一条,测量方法可用带激光的全站仪,置仪于适宜控制点上,直接进行断面测量。不需要在每个断面上置仪来进行测量。

第九、编程技巧:隧道周边轮廓点的放样,是通过全站仪测定坐标、高程数据的采集,然后输入计算器进行计算,来获得放样点在隧道的空间位置,从而判断是否满足图纸和自己的要求。放样点的坐标有两种形式采用,

1、利用图纸设计平面坐标即大地坐标和高程,

2、相对坐标和高程,即以隧道前进方向中线为X(里程),隧道中线两侧为Y,Y值为正在中线右侧,为负在中线左侧,洞口底部设计高程为零点。两种坐标获得的目的只有一个,那就是通过计算求得测点在隧道的空间位置量,即该点的里程、高程数值以及该点与圆心或中线的关系数值。第一种方法计算量较大需要在程序中通过计算换算成里程,没有第二种直观,但程序编制需要点功夫,并要求将设站置仪器点换算成隧道相对坐标进行。编程应根据自己的喜好或习惯来编制,

可借用他人资源来改编适合于自己的,建议不要照搬,拿过来就用,别人的不一定适合。

在编程过程中,一般对隧道周边轮廓点的空间位置计算是要参考设计的圆心高程与开挖边线的关系进行的,无论单圆心还是多圆心,同时还要考虑隧道是否设计有的纵向坡度,圆心的高程是随纵向坡度及里程延伸而变化的。如果隧道平面是曲线型,在程序编制中还要将曲线计算部分编制进去。一般隧道如果是过水作用不设置缓和曲线,是交通隧道特别是高速公路和铁路会遇到缓和曲线的,程序编制时应引起注意。

对于曲线隧道部分的编程,可以根据曲线半径的大小来设计,当半径较大的时候,可以采用折线的形式进行编制来简化程序,其折线长度的选择只有在玄狐差不影响开挖放样精度的时候采用。

第十、为什么需要求得测点(轮廓放样点)的里程或称X坐标,因为隧道在掘进的时候,掌子面不会是一个平面,会有凸凹,当隧道纵向有坡度的时候,凸凹的部位(指轮廓线周边)的里程不一样,其里程位置的开挖高程在断面位置是不一样的,目的就是解决这一问题。测得的高程目的就是通过计算对照相对这一测点里程的设计高程在该处断面的轮廓点位置是否吻合,来改正测点的轮廓点位置至正确。

当然,在隧道无纵向坡度的时候可简化计算过程与程序。

第三篇:全站仪测量闭合导线的具体步骤

1,测出每个夹角和距离

2,内业计算,算出闭合差,然后符合限差的话就反号按内角个数分配

3,算出改正后的方位角

4,坐标增量计算

5,得出每个点的坐标全站仪附和导线正倒镜测量,仪器的转动方向具体步骤:

导线转折角分为左角和右角:

左角:在导线前进方向左侧的水平角称为左角。 右角:在导线前进方向右侧的水平角称为右角。

观测方向少于3个方向时,符合导线采用方向观测法,即“后-前-前-后”,“正-正-倒-倒”:

上半测回:先观测后视点正镜(盘左)水平角,顺时针转动水平度盘照准前视点,观测前视点的正镜(盘左)水平角 下半测回:先观测前视点倒镜(盘右)水平角,逆时针转动水平度盘照准后视点,观测后视点的倒镜(盘右)水平角

第四篇:“六步骤”教学法在《工程测量技术》课程中的应用

【摘要】《工程测量技术》课程是工程测量专业的核心课程,在教学过程中采用“六步骤”实现教、学、做一体化的教学结构,有效激发了学生的学习热情,提高了学习效率。

【关键词】工程测量 六步骤 教学评价

【基金项目】兰州资源环境职业技术学院校级教改课题项目。

【中图分类号】G71 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089(2015)07-0234-01

《工程测量技术》课程是工程测量专业的核心课程,在工程测量技术专业的整个课程体系中占有重要的地位。该课程主要培养学生的基本测量只是的基本技能,为学习工程测量打下基础,GPS测量是工程测量的后续课程,主要培养学生利用先进的测量技术解决工程中的实际问题。在工程领域中,工程测量工是本专业学生首选的职业技能鉴定考试工种,工程测量工考试说涉及的知识、能力和技能都是本课程所授知识。因此,该课程又是工程测量技术专业的一门证书课程。通过本课程的学习,学生应具有工程建设一线的工程测量能力,同时具有获取工程测量职业技能鉴定证书的能力。

一、新编教材,整合教学内容

《工程测量技术》是一门实践性较强的课程,在整个课程的教学过程中分为课程任务设计、 单项技能训练、综合技能训练以及顶岗实践四个环节。在整个教学中以工程建设进度的不同工程类别的不同阶段的测量工作组织教学全过程。

工程建设进程分析工作任务,由工作任务构建教学项目,由教学项目和工作任务分析知识点、技能要求和人才素质培养要求。根据工程建设进度,通过岗位职业能力分析,整个课程共安排3教学项目,每个教学项目将依据单元教学设计进行授课,具体见课程设计中的单元教学设计。

二、课前准备,实施“分工负责制”

为保证《工程测量技术》课程教学的良好组织与实施,该课程教师队伍的整体优势和特点,实施“分工负责制”,形成了分工协作的机制:其中,理论知识教学设计及实施主要以专职教师为主;实践技能训练主要由企业兼职教师和“双师”资格教师讲授指导。

教研室组长一方面负责学习情境和教学内容的选取,并协调、指导专职教师进行情境教学工作;另一方面负责组织课题小组开展集体备课等教研室活动,对教学工作进行阶段性的总结并讨论制定下阶段的工作计划。通过专兼职教师的分工合作,确保《工程测量技术》课程教学工作的顺利实施及教学改革的不断深化。

三、课堂组织,采用“六步骤”教学

在教学过程中,通常采用任务驱动、项目导向等方法来组织课堂教学活动,实施基于工程测量工作过程的“六步骤”教学,集“教、学、做”一体的课堂教学结构,激发学生学习的积极性和主动性。使学生在做中学理论知识,学技能操作,学知识应用,在完成任务和项目的过程中提高技能和综合素质。

1.教。教的主体不再局限于学校的专职教师,引入企业专家作为教师队伍的又一分支,同时,学校着力培养“双师”型教师来优化教师队伍。教的内容既包括理论知识,也包括时间技能。不仅要奠定学生的理论基础,确保学生有后续学习的能力,而且要培养学生的操作技能和创新能力。因此,“怎么教”对教师提出了更高的要求,教师需要做大量的工作,结合工程测量典型工作任务和学生特点制定任务工单,在教学过程中突出学生的主体性,以学生为中心,教师只是学习过程中的组织者和协调者。

2.学。参考企业组建项目组的方法,采用组长负责制的分组协作方式开展学习;理论学习中,教师负责组织和引导,注重学习方法的传授及重难点的讲解,增强老师与学生、学生与学生之间的互动。在技能操作学习中,教师应针对学生存在的问题及不足及时进行指导和纠正,力求演示准确、操作到位。

3.做。学生通过小组协作完成较大的任务巩固知识和技能。在做的过程中不仅培养了发现问题、解决问题的能力,也提高了自身的综合素质,建立了团队合作意识,对于职业岗位有了基本的认知。

在实施“六步骤”教、学、做一体的课堂教学结构时。要求专、兼教师密切合作,专职教师在教授课程过程中不断总结经验,探索技能操作的训练技巧,共同提高专业技能,相互之间取长补短、共同提高,共同推进教学改革和创新。

“六步骤”教学方法改变了传统的“填鸭式”教学方法,使教师与学生的主体位置发生了变化。教师从演员变为导演,学生从观众变为演员。充分发挥学生的主体作用,打破教与学、学与做之间的界限。真正做到了老师与学生、学生与学生之间的互动,从而使学生的综合能力得到培养和锻炼,促进了学生职业能力的发展和职业素质的养成,有效地提高了教学质量。

四、教学评价,实行动态管理

教学评价由“学生评教”和“教师评学”两部分组成。“学生评教”实行民主不记名评教方式,每学期至少听取一次学生评教意见,对学生的建议、看法、措施等各方面的内容做出针对性地进行答复。不断改进本课程的教学工作,全面提高本课程全体教师的专业水平。“教师评学”,在该课程授课过程中将中级测量工考试纳入了校内考核,在原有理论基础上加强了职业技能考核;期末与平时考核相结合。实现理论考核与技能考核相结合、期末考核与平时考核相结合、校内考核与社会考核相结合。

参考文献:

[1]金炜,丁文卿,张宝娟. “六步式”教学法在《基础会计》课程中的应用. 教育园地,119-120.

[2]王江涛. 高职商科专业“工作过程导向”课程开发实证研究. 2014(3):57-62.

[3]曾苑,邓文博,董文. 基于工作过程的《人力资源管理》课程教学设计. 商业经济,2010(8):120-122.

[4]李勤道.基于工作过程和行动导向课程教学设计的认识与实践.山东电力高等专科学校学报:1-6.

[5]吴卫荣,丁慎平,王寿斌. 基于工作过程的项目化课程教学设计与实践. 职业技术教育,2012(23):26-28.

第五篇:IP实验步骤 基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4?裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清; (2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4?C缓慢摇晃孵育过夜; (3)免疫沉淀反应后,在4?C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3,4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟; (4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、 样品处理: 免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4?完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a( 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。 b( NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c( 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d( 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail (多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e( 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果: - 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80?保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。

三、 抗体-agarose beads复合物洗涤: 除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。

四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于

免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

针对上述情况,通常有二种解决办法: a( 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b( 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球

蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之

与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,

可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质是否在生理条件下有相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质,蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。

白与蛋白 寻找新的 经由免疫共沉淀然后通过质谱或者的相互 相互作用 WB鉴定新的相互作用蛋白 作用 蛋白

验证目的 经由免疫共沉淀然后通过使用待测 蛋白和 蛋白 待测蛋白 的抗体进行WB实验可以确定目的蛋 是否有 白

相互作用 和待测蛋白是否有相互作用 通过对经由免疫共沉淀而得到的DNA 片段进行PCR实验可以获得DNA片研究蛋白与DNA的动态作用 段的序列信息以及目的蛋白与DNA 之间的动态作用信息

通过使用针对组蛋白不同修饰位点的研究蛋白 抗体进行染色质免疫沉淀实验去检测

染色质 与DNA 研究组蛋白的各种共价修饰 组蛋白的不同修饰状态和目的基因启

免疫沉淀 的相互 与基因表达之间的关系 动子之间的动态相互作用,从而研究作用 组蛋白修饰与目的基因表达之间的关

基于CHIP的原理发展出来的RIP 研究蛋白与RNA的相互作用 (RNA-IP)技术可以用来研究目的蛋 白与RNA之间的相互作用信息

我该选择什么样的抗体做免疫沉淀,免疫共沉淀和RNA免疫沉淀以及染色质免疫沉淀, 在所有免疫沉淀相关实验中,抗原的起始浓度相对其它免疫相关实验(WB和IF等)要低得多,所以对抗体的亲和力相对其它实验(WB和IF等)提出了很高的要求,这就需要使用高亲和力的抗体去进行免疫沉淀相关实验。同时,由于免疫沉淀相关实验主要是在生理条件性进行,所以需要抗体识别蛋白的天然表面构象,因此选择的抗体其针对的抗原决定蔟需要暴露在蛋白表面。这些因素对制备能成功应用于IP实验的抗体提出了很高的要求: a( 用于免疫的蛋白抗原其构象需要尽量接近目的蛋白的天然构象或者用于免疫的多肽尽量暴露在目的蛋白的表面。获得接近天然构象的蛋白抗原的途径有很多,主要有天然提取,原核表达重组蛋白以及真核表达重组蛋白三种方式。这其中,就蛋白构象角度而言,天然提取是最佳途径,但这种方法受材料来源限制和纯化方法复杂等多因素影响,一般很少采用。原核表达因为成本低廉,操作方便最为受欢迎,但其受表达环境与大部分蛋白天然存在环境差别巨大,构象失真情况严重,抗原的构象质量有严重问题。大规模瞬时真核表达是近期新兴的表

达系统,具有表达环境接近天然,操作方便等诸多优点,是获取具有天然构象蛋白抗原的首选工具。

b( 亲和力要比普通的抗体应用要求高得多。多克隆抗体由于可以结合目的抗原的多个抗原决定簇,所以在亲和力方面是首选。但考虑到特异性,获得单克隆抗体群是更好的选择。具体优缺点总结如下表。

单克隆抗体群(由一个免疫原产生的多 多克隆抗体 单克隆抗体 个单克隆抗体混合物) 抗体抗原作由抗体的亲和力决定(极佳极佳 极佳 用信号强度 或者极弱) 通常很好,但有时会极佳(由于选择可以进行IP且没有交特异性 极佳,但有时会有交叉反应 有非特异性相互作用 叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 亲和力高(由于抗体特异性好,亲和力高(由于选择可以进可以与目的蛋白的多特异性好,且可以无限量供优点 行IP且没有交叉反应的抗体组成单克个抗原决定蔟相互作应 隆抗体群) 用) 需要筛选亲和力高的抗体;能够筛选得到的符合条件的单克隆并非特异性相互作用很缺点 抗原表位可能会被相互作不多,所以单克隆抗体群也就不容易获难去除 用蛋白遮蔽 得

免疫沉淀效由抗体的亲和力决定(极佳极佳(由于选择可以进行IP且没有交极佳(由于亲和力高) 果 或者极弱) 叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 由抗体的亲和力决定和抗通常很好,但有时非免疫共沉淀原表位是否被相互作用蛋极佳(由于选择可以成功进行IP且没特异性相互作用会带效果 白遮蔽决定(极佳或者极有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 来假阳性 弱) 由抗体的亲和力决定和抗

通常很好,但有时非原表位是否被遮蔽或者以染色质免疫极佳(由于选择可以成功进行IP且没特异性相互作用会带及抗原表位是否被交联实沉淀效果 有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 来假阳性 验所破坏决定(极佳或者极

弱)