绿原酸（精选8篇）
篇1：绿原酸
绿原酸应用小结
绿原酸具有广泛的生物活性，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。
抗菌、抗病毒
杜仲绿原酸有较强的抗菌消炎作用，日本爱知医科大学加龄医科学研究所经研究确认，从杜仲中提取的碱性物质有抗破坏人体免疫系统病毒的功能，这种物质有可能用于预防和治疗艾滋病。抗氧化作用
绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、等。绿原酸之所以有抗氧化作用，是因为它含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害。
清除自由基、抗衰老、抗肌肉骨骼老化
绿原酸可有效清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基，还可抑制低密度脂蛋白的氧化。有效地清除体内自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止和延缓肿瘤突变和衰老等现象的发生具有重要作用。
抑制突变和抗肿瘤
绿原酸还可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果。绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用，被认为是癌症的有效化学防护剂。
对心血管保护作用
绿原酸作为一种自由基清除剂及抗氧化剂已被大量的试验证明，绿原酸的这种生物活性，对心血管系统能产生保护作用。
经多年临床试验证实的，杜仲绿原酸有明显的降压作用，而且疗效平稳，无毒、无副作用。
篇2：绿原酸
高效液相色谱-串联质谱法分离鉴定绿原酸及其相关杂质
建立了高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)分离和鉴定绿原酸及其相关杂质的方法.采用C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×150 mm),乙腈-水(含0.1%甲酸)(体积比为8:92)为流动相,经HPLC-MS/MS和HPLC-二极管阵列检测器在线检测,对工业绿原酸中的奎尼酸、咖啡酸、绿原酸同分异构体等8个相关杂质的结构进行了鉴定.
作 者：田晨煦 徐小平廖丽云 张洁 刘静 周莎 TIAN Chenxu XU Xiaoping LIAO Liyun ZHANG Jie LIU Jing ZHOU Sha 作者单位：田晨煦,徐小平,张洁,刘静,周莎,TIAN Chenxu,XU Xiaoping,ZHANG Jie,LIU Jing,ZHOU Sha(四川大学华西药学院,四川,成都,610041)廖丽云,LIAO Liyun(成都医学院,四川,成都,610083)
刊 名：色谱 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY 年，卷(期)： 25(4) 分类号：O658 关键词：高效液相色谱-串联质谱法 绿原酸 相关杂质 鉴别篇3：绿原酸稳定性研究
绿原酸(Chlorogenic Acid,以下简称CA),是一种重要的生物活性物质,具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用[1]。它是许多中药材的有效成分之一,又是某些成药的质量指标。CA应用非常广泛,主要为医药、日用化工和食品等行业。CA是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯,其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分[2]。其结构式见图1。在从植物提取过程中,往往因为水解和分子内酯基迁移而发生异构化,或氧化等作用而引起有效成分的提取率明显下降。如何预防氧化、抑制水解,提高有效成分稳定性是影响CA的关键应用因素。
本研究以CA对照品为样本,设计并考察了CA在不同环境中乙醇的水溶液中的稳定性,结果可为CA的制备及相关制剂的生产提供参考。
1 实验部分
1.1 仪器、药品
双频数控超声波清洗器(KQ3200VDB型,频率45k Hz);UV1102紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);1/10万电子分析天平Sartorius Cp22SD);Waters600E-2487高效液相色谱系统;CA对照品(中国药品生物制品检定所批号:110753-200413);乙腈为色谱纯;甲醇、乙醇、30%双氧水、磷酸均为分析纯;水为超纯水。
1.2 HPLC色谱条件
色谱柱:Waters Column(4.6mm×150mm,5μm);流动相:乙腈:0.2%磷酸溶液(8∶92);流速1m L·min-1;柱温:室温;检测波长327nm;进样量:10μL。
2 绿原酸稳定性研究方法设计
2.1 CA储备液的的配置:
精密称取CA适量,用50%乙醇溶解,定容后作为储备液备用。
2.2 精密量取储备液2等份:
分别置于50ml棕色瓶中,标记为1号、2号试样,1号试样用50%乙醇定容,2号试样中加入30%双氧水0.5ml。用50%乙醇定容,两试样均保存于冰箱(约4℃)中,分别于0d、4d、10d取样,用紫外可见分光光度法测定吸光度,参照文献方法[3]计算CA的含量。
2.3 精密量取储备液2m L三份:
分别置于50ml容量瓶中(一个无色、二个棕色),标记为:3号、4号、5号试样。3号、4号试样用50%乙醇定容,5号试样中先加入30%双氧水0.5m L(模拟氧化环境),后用50%乙醇定容;
2.4 精密量取储备液1m L
置于50ml棕色容量瓶中,标记为6号试样,其中加先一定量50%乙醇,以磷酸调至p H=3,再向样品中加入30%双氧水0.5m L;定容后均于室温保存,分别于0d、1d、4d、10d取样,用HPLC法测定样品中CA含量变化。
3 结果与讨论℃
3.1 温度、氧化剂对CA溶液含量的影响
在表1中,1号试样中CA的含量10d内基本不变,这表明用棕色量瓶较低温度下(约4℃)保存,CA相对稳定,这与顾利红等报道[4]一致。而2号试样的CA含量呈明显下降趋势,10天后CA的含量变为原来的88.9%,表明氧化剂(H2O2)能明显促进CA发生变化。对比表2中试样4和5的数据可知,常温下氧化剂对CA稳定性的影响更加明显。
分析表2中试样3和4的数据可知:常温条件下保存,随着时间的延长,棕色瓶中保存的试样的CA含量也不断下降,且在第一内变化量相对更大,到第四天时含量相当,但是常温保存超过10d时,CA基本被消耗,这表明相对光照的影响,温度对CA稳定性的影响更明显。图1中的HPLC图1、2、3、4分别为4号试样保存0d、1d、4d、10d后,在1.2条件下测定后得到的HPLC图,其规律与表2对应。
3.2 光照及氧化剂对CA稳定性的影响
图2中的HPLC图1、2、3、4、5分别是4号试样保存0d、5号试样保存0d、1d、4d、10d后,在1.2条件下测定后得到的HPLC图。对比图2中4、5,笔者认为:图中a峰及c峰峰高的变化对应于CA的水解反应;d峰对应于CA被氧化,其氧化产物具体是什么物质,至今还未见详细报道,有待于进一步研究。但相关文献[7]报道认为:绿原酸的氧化后生成绿原酸p-醌。
3.3 在酸性条件下,氧化剂对CA稳定性的影响
据文献[6]报道:CA为咖啡酸奎尼酸酯,因而既能被酸也能被碱催化水解,在p H值为2.0~3.0,反应常数k值趋小,可推断其反应机制为酸催化的水解反应;在p H值为3.0~8.0,反应常数k值趋大,推断为碱性催化其发生水解反应,因此其水溶液在p H=3.0时最稳定。
上图3中的HPLC图1、2、3、4分别为6号试样保存0d、1d、4d、10d后,在1.2条件下测定后得到的HPLC图。试样保存10d后,其中CA的含量约为原来的70%,同图2中的HPLC图4、5相对比,据笔者认为:在p H=3的环境中,CA稳定性明显增加;并且对比有无磷酸作用,CA发生的变化不同,图2中的a峰、c峰为水解产物峰,由于磷酸抑制了水解反应,故在图3中的相应位置没有出峰,而图2中的d峰和图3中的b峰应为氧化反应产物所对应的峰,随着保存时间延长,CA含量因氧化而减少,但是在p H=3时,为什么氧化剂(H2O2)对CA的影响减缓机理有待探讨。
参考文献
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[8]曾爱群,肖峻松.超声辐射在有机合成中的应用[J].广西化工,1999,28(2):24-27.
篇4：绿原酸
1 仪器与试剂
8810型高效液相色谱仪(美国SP公司);SP100型紫外检测器;HW色谱工作站(HW-2000);AE240型电子天平(瑞士梅特勒);绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号:110753-200413);甲醇为色谱纯;水为纯化水;其余试剂均为分析纯;银黄颗粒(市售样品,批号见表2)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件。色谱柱:Thermo Hypersil-Keystone C18(4.6×250mm,5μm);流动相:甲醇—0.2mol•L-1磷酸二氢钠溶液(磷酸调PH至2.7±0.1)(4060);检测波长:320nm;流速:1.0ml•min-1;柱温:30℃;进样量:10μl;绿原酸的理论板数4213。
2.2 对照品溶液的制备。精密称取绿原酸对照品10mg,置于100ml容量瓶中加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用。
2.3 供试品溶液的制备。取本品10袋内容物,混匀,研细,精密称取0.5g置于50ml量瓶中,加入50%甲醇30ml,超声处理30分钟,放置至室温,再加50%甲醇至刻度摇匀,滤过。
2.4 干扰性试验。按银黄颗粒的制法,制成不含金银花的阴性样品,并按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液测定。阴性对照液对测定无干扰。
2.5 线形关系测定。精密量取对照品储备液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl分别进样,按上述色谱条件进行测定,以峰面积为纵坐标,进样量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,回归方程为A=1.4×105C+7.6×104,r=0.9995,在0.1～2μg范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验。取对照品溶液,重复进样5次,按峰面积计算绿原酸的RSD为0.32%。
2.7 重复性试验。取同一批供试品溶液5份,分别精密称定,按供试品溶液制备方法制备并测定,结果绿原酸平均含量为5.6956mg•g-1,RSD为0.45%。
2.8 稳定性试验。精密吸取同一份供试品溶液分别在0、6、12、24小时进样,4次测定绿原酸峰面积的RSD为0.48%;说明供试溶液在24小时内稳定。
2.9 回收率试验。分别称取已知含量的样品(批号为J05016,含量为5.6956mg•g-1)6份,各0.25g,精密称定,分别加入对照品溶液15ml,按供试品溶液制备方法制备并测定,计算回收率,结果见表Ⅰ。
表Ⅰ 样品中绿原酸回收率测定结果
2.10 样品测定。取3个不同厂家的供试品,按供试品溶液的制备方法处理并测定,结果见表Ⅱ。
表Ⅱ 样品含量测定结果(mg•g-1)(n=5)
3 讨 论
3.1 质量控制指标的选择。银黄颗粒组方中,金银花为主药,其主要成分为绿原酸,《中国药典》2005版一部将绿原酸的含量作为控制质量的指标,故选绿原酸作为本方剂的质量控制指标。
3.2 提取方法的考察。经考察,样品超声提取30分钟、40分钟、60分钟,其RSD为0.31%,表明30分钟超声提取可使绿原酸提取完全。
3.3 含量差异的原因。不同厂家生产的银黄颗粒中绿原酸的含量差异较大,差异大的原因可能由于:①药材的产地、收获季节不同;②药材的炮制及颗粒剂的制备工艺造成绿原酸不同程度的损失;③厂家少投料、投次料。
3.4 流动相的选择。试验过程中,笔者曾选用甲醇—水—冰醋酸(50501)[2]、甲醇—0.2mol•L-1磷酸二氢钠(磷酸调PH至2.7±0.1)4456为流动相,均未获得满意的分离效果。经反复试验,本文采用的流动相较为适宜,能得到满意的分离效果。
3.5 本文建立的含量测定方法简便易行、稳定、可靠,能够有效控制银黄颗粒的质量。
参考文献
1 卫生部药品标准[S].中药成方制剂.第六册,1992:169
篇5：绿原酸的生物活性及其应用
关键词：绿原酸,分布及存在,理化性质和结构,生物活性,应用
绿原酸类是植物在有氧呼吸过程中经桂皮酸途径 (Cinnamic acid pathway) 所产生的一类苯丙素类化合物, 是许多中药材和食品 (如金银花、咖啡豆、杜仲、茵陈等) 的有效成分。绿原酸 (Chlorogenic acid) 是由咖啡酸 (Caffeic acid) 与奎尼酸 (Quinic acid) 组成的缩酚酸, 异名咖啡单宁酸, 化学名3-O-咖啡酰奎尼酸 (3-O-caffeoylquinicacid) 。
1 绿原酸分布及存在
绿原酸广泛存在植物中, 如葵花籽、水果 (如苹果、梨、葡萄) 、蔬菜 (如土豆) 、咖啡豆、可可豆、大豆、小麦等。因此, 人们在日常生活中, 都能从食用的粮食、蔬菜、水果、茶和果汁中或多或少地摄取绿原酸类物质。绿原酸主要存在于忍冬科忍冬属、菊科嵩属植物中, 但含量较高的植物不多, 其中包括杜仲、金银花、向日葵、菊花、咖啡、可可树。绿原酸是金银花、杜仲的主要有效成分之一。金银花中绿原酸含量最高的当属大花毛忍冬花, 最高可达11.14%, 其次是红腺忍冬花, 最高达7.1%, 含量较稳定者当属贵州忍冬花, 其含量约5.3%~5.7%。其中金银花越冬老叶中绿原酸含量是普通叶1.41倍。不同时期杜仲叶中绿原酸含量差异显著, 在年周期中, 杜仲叶绿原酸含量以6月份最高, 其次是11月份, 而5月份最低[1]。表1为常见植物花、果或叶中绿原酸含量。
2 绿原酸理化性质和结构
绿原酸类化合物是含有羟基和邻二酚羟基的有机物, 除极易溶于乙醇外, 还易溶于水、甲醇和丙酮等溶剂, 微溶于乙酸乙酯等极性溶剂, 难溶于氯仿、乙醚等弱极性溶剂。因此, 利用这一性质可将绿原酸从植物中提取出来。
绿原酸分子式为C16H18O9, 分子量为354.3, 它的半水化合物为白色或微黄色针状结晶, 110℃变为无水化合物, 熔点208℃, 在25℃水中溶解度为4%, 热水中溶解度更大, 且溶解度随温度而变化。
绿原酸由奎尼酸和咖啡酸缩合而成, 为极性有机酸, 不太稳定。在提取过程中, 通过水解和相继分子内酯基迁移而发生异构化[2]。绿原酸与异绿原酸分子中都含有邻二酚羟基, 受热、见光易氧化, 因而供试液要在50℃以下浓缩, 并在阴凉、避光下保存备用。绿原酸的邻二酚羟基结构不稳定, 高温加热易氧化分解。因此, 高温及长时间加热不利于绿原酸提取。在碱性条件下, 绿原酸可发生水解, 碱性及高温时会氧化成为绿色醌类。植物体内存在的绿原酸往往是混合物而非单一组分, 从葵花籽仁和金银花中提取的绿原酸均含有不同数量异构体。
3 绿原酸生物活性
绿原酸具有广泛的生物活性, 现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。据文献报道[3], 绿原酸具有以下活性:抗氧化作用, 对心血管作用, 抑制突变及抗肿瘤, 清除体内自由基, 保肝利胆, 抗菌抗病毒。咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、阿魏酸、阿魏酸苯乙酯及绿原酸等作为羟基肉桂酸化合物的代表, 羟基肉桂酸化合物主要以有机酸酯和多糖苷的形式广泛存在于植物体内。
3.1 抗氧化活性
绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂, 其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、丁香酸、丁基羟基茵香醚 (BHA) 和生育酚。绿原酸之所以有抗氧化作用, 是因为它含有一定量的R-OH基, 能形成具有抗氧化作用的氢自由基, 可以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性, 从而保护组织免受氧化作用的损害。
3.2 抑制突变和抗肿瘤活性
蔬菜、水果中的多酚类如绿原酸、咖啡酸等可通过抑制活化酶来抑制致癌物黄曲霉毒素和苯并芘的变异原性;绿原酸还可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果。绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用[4], 被认为是癌症的有效化学防护剂。
3.3 对心血管的作用
异绿原酸B对大鼠具有较强促进前列腺环素 (PGI) 的释放和抗血小板凝集作用;对豚鼠肺碎片感应的抗体诱导SRS-A释放抑制率为62.3%。异绿原酸C也有促进PGI的释放作用。另外, 异绿原酸B对血小板血栓素的生物合成和氢过氧化物诱发的内皮素细胞损伤有极强的抑制作用[3]。
3.4 对透明脂酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用
透明脂酸酶 (HAase) 是裂解粘多糖的酶之一, 可催化透明脂酸 (HA) 的分解, 关系到血管系统的通透性和炎症反应。HA是由糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的一种粘多糖, 具有多种功能, 如治愈创伤、使皮肤润湿健康、润滑关节和防止炎症等。因此, 从天然产物中发现多种抑制HAase激活的活性成分, 同时又具有较强的抗变态反应活性, 有望作为先导化合物, 进一步开发为新的抗变态反应药物。从狭叶紫锥花根的乙酸乙酯提取物中发现3, 5-二咖啡酰奎尼酸和绿原酸有较强的抑制HAase激活的作用[5]。葡萄糖-6-磷酸酶体 (Gl-6-Pase) 在体内平衡血糖调控中发挥重要作用。它承担着由糖原异生和糖原分解产生内源性葡萄糖的形成。最近, 绿原酸被确认为是大鼠肝微粒体中葡萄糖-6-磷酸位移酶 (Gl-6-P-translocase) 第1个新型特异性抑制剂。通过测定正常大鼠肝微粒体中Gl-6-Pase水解程度, 测定绿原酸及其合成类似物对位移酶活性的抑制强度。
3.5 保肝利胆活性
据文献报道[6], 国内有人从金银花水溶性部分经乙酰化后获得绿原酸四乙酰化物, 经药理实验表明, 该物质对四氯化碳引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用, 这为证明金银花具有保肝利胆的功效提供了理论依据。
3.6 抗菌、抗病毒等活性
有文献报道[5], 绿原酸和异绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用, 对急性咽喉炎症及皮肤病有明显疗效, 临床上用于治疗急性细菌性感染疾病。绿原酸的水解产物咖啡酸也具有升白、止血、利胆及抑制单纯疱疹病毒的功效。最近报道, 德国Free大学Eich教授在研究有些植物次生代谢物作为抗逆转录病毒剂时, 根据其试验结果推理认为:绿原酸是有希望的抗艾滋病毒 (HIV) 先导化合物。
4 绿原酸的应用
4.1 食品工业
绿原酸具有利胆、抗菌、抗病毒、止血、增加白血球、缩短血凝和出血时间及兴奋中枢神经系统的生理功能, 可用绿原酸制作保健食品或饮料。绿原酸具有增香和护色作用, 可用于食品和果品保鲜。绿原酸用于果汁保鲜, 可有效防止饮料和食品的腐败变质。研究还发现, 绿原酸大大可提高草莓等果汁稳定性[6]。随着天然食品抗氧化剂越来越受消费者欢迎, 绿原酸作为一种新型高效的酚型天然抗氧化剂, 在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。在猪油中, 若添加少量绿原酸, 可提高猪油氧化稳定性, 增长贮存期;将少量绿原酸加到天然色素溶液中, 对色素颜色有稳定作用。因此, 绿原酸又是一种良好的食品添加剂。目前, 日本将葵花籽粕中提取的绿原酸成功开发成水溶性天然抗氧化剂。
4.2 医药工业
卫生部《药品标准》收录了具有清热解毒、抗菌消炎的中成药170种, 均含有绿原酸且为主要成分。目前, 在银黄制剂、双黄连制剂等药品的生产中, 已将绿原酸作为质量控制的重要指标之一, 从植物中提取纯的绿原酸, 可作为二类新药[7]。绿原酸还是很重要化学试剂, 在生理生化分析和化学工业中具有广泛应用, 开发医用甚至化学纯绿原酸具有巨大的社会和经济效益。
4.3 日用化妆业
研究发现, 以绿原酸为代表的天然多酚物质, 它们可以保护胶原蛋白不受活性氧等自由基伤害, 并能有效防止紫外线对人体皮肤产生伤害。现已有多项添加绿原酸用于抗脲酶化妆品、皮肤防晒霜和防止紫外线和染发剂对头发损伤洗发水的欧洲专利。
参考文献
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篇6：金银花中绿原酸的研究进展
关键词：金银花；绿原酸；提取；纯化；生物活性；研究进展
中图分类号：R932 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）06-0059-03
金银花（Flos Lonicerae）为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、凉散风热、保肝利胆等功效，是常用中药材之一。金银花之所以具有清热解毒等功效，是因为其中含有一种有效成分——绿原酸（Chlorogenic acid）。绿原酸是一种多酚类化合物，分式子为C16H18O9，易溶于水、醇、丙酮等，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血脂、提高白细胞数量、增强免疫调节、增香护色等作用。近年来，通常以绿原酸的含量高低来评价金银花质量的好坏[1]。国内对金银花中绿原酸的提取、纯化及其生物活性等进行了大量的研究，本课题在查阅收集大量文献的基础上，综述近几年金银花中绿原酸的提取、分离纯化、生物活性等方面的研究进展，以期为今后进一步研究提供参考。
1 提取方法
1.1 溶剂提取法
金银花中绿原酸的提取一般用水和醇溶液为溶剂提取，但用水作溶剂存在测得的绿原酸含量偏低、难以过滤等缺点，所以目前大多采用醇提法[2]。李春燕等人对比了药典方法、回流提取法、超声提取法、水煎法以及萃取与不萃取等不同处理方法提取金银花中绿原酸的得率，结果显示，不同提取方法对金银花中绿原酸的提取率影响较大，其中醇提回流提取不萃取方法所得绿原酸提取率最高、为4.16%[3]。
1.2 超声波辅助提取法
绿原酸提取时不能高温、强光及长时间加热，而超声波提取能克服绿原酸的不稳定性，采用全物理过程提取，没有水提法难以过滤之虑和醇提法溶剂使用成本高、溶剂回收难的问题，是较为理想的提取方法。袁飞的研究表明，各因素影响超声波提取绿原酸的顺序为溶剂类型>预处理>提取时间>物料比，优化的最佳提取工艺为以60%乙醇为溶剂、物料比1∶30、提取时间45 min、远红外微波1 min，得到的绿原酸含量比水和乙酸乙酯提取的高近2倍[4]。
1.3 微波辅助提取法
李燕婷等人通过采用单因素试验和正交试验确定微波辅助提取金银花中绿原酸的最佳工艺为乙醇体积分数60%、微波处理时间9 min、微波功率300 W、料液比1∶10（g∶mL），提取率为3.779%，该法与传统提取方法相比，操作时间明显缩短，且无需回收溶剂[5]。尤秀丽等人采用超声波和微波双辅助提取技术得到的绿原酸提取率较单独采用超声波或微波辅助得到的绿原酸提取率高[6]。采用微波技术会造成提取过程温度的迅速上升，影响绿原酸的提取率，所以在提取过程中要严格控制温度。
1.4 其他提取方法
除了以上常用的提取方法外，也有很多研究采用了其他提取技术，如酶解法辅助提取、酶法辅助聚二乙醇（PEG）-200提取、微波辅助聚二乙醇（PEG）提取、破壁法辅助提取、超临界二氧化碳提取等，均取得了较好的提取效果。
2 纯化方法
2.1 大孔树脂柱层析纯化法
利用大孔树脂分离纯化绿原酸，其工艺简单、成本低、产率高，现较多采用。兰雪萍等人分别考察各种类型的大孔树脂对金银花中绿原酸分离纯化的影响，结果表明，NKA-2大孔树脂、HPD450大孔树脂、ADS-21型大孔树脂和D101型大孔树脂均对绿原酸有较好的纯化效果，可用于工业化大生产[7]。
2.2 膜分离纯化法
范远景等人比较3种微滤膜MF1，MF2和MF3，4种超滤膜UF1，UF2，UF3和UF4，及2种反渗透膜RO1和RO2对绿原酸提取液的过滤特性，结果表明，MF1，UF1和RO2膜的过滤性能明显优于其他同类型膜[8]。
2.3 其他纯化方法
除了上述分离纯化方法外，其他方法也较为常用，如凝胶柱层析、聚酰胺柱层析等。
3 生物活性
3.1 抑菌、抗病毒作用
金银花中绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用；而且，其抑菌效果主要受温度影响，绿原酸抑菌效果随温度的升高而增加，但是当温度超过60 ℃时，抑菌效果明显下降；pH值和紫外灯照射时间对其抑菌效果影响不大，不过绿原酸在酸性条件下的抑菌效果略好。徐跃成的试验结果表明，绿原酸对革兰氏阴性菌（志贺氏菌、沙门氏菌）的抑菌活性比革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、李斯特菌）更强，绿原酸水溶液抑菌效果与0.1 mg/mL的卡那霉素的抑菌效果相当[9]。金银花主要活性成分绿原酸可以抑制烟曲霉生物膜胞外基质的形成，其抑制作用呈浓度依赖性。王林青的研究结果表明，在安全浓度范围内，金银花和山银花绿原酸类提取物在体外对PRV，NDV分别表现出显著的阻断病毒吸附，抑制病毒感染作用和中和病毒作用，且有一定的量效关系；而且金银花绿原酸类提取物能促进淋巴细胞增殖及协同LPS，ConA的作用[10]。
3.2 抗血栓作用
樊宏伟等人研究金银花中绿原酸、异绿原酸类化合物的体外抗血小板聚集作用及H2O2损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用，结果表明，金银花中有机酸类化合物有抗ADP诱导血小板聚集的作用；对H2O2损伤绿原酸虽然未观察到直接对抗作用，但具有预防性保护作用[11]。
3.3 抗氧化（清除自由基）作用
刘豪等人的研究结果表明，金银花95%乙醇提取物中绿原酸、总黄酮和总酚含量分别为123.99，242.62和48.76 mg/g；95%乙醇提取物清除
nlc202309090941
·OH和DPPH·能力也最强，清除率分别为90.69%和65.64%[12]。石奇的研究结果表明，金银花绿原酸具有较强的抗氧化能力，其抗氧化能力与绿原酸浓度在一定范围内呈线性关系。金银花绿原酸添加量为0.5 mg/mL时，对OH·的清除率比VC效果略好；添加量为0.4 mg/mL时，对O2-·的清除效果明显优于VC[13]。
3.4 解热和抗炎作用
雷玲的研究结果表明，金银花水提取物（绿原酸、木犀草素）于10 mg/mL具有抗内毒素作用，金银花为5.625 g/kg时具有解热作用，为45 g/kg时具有抗炎作用[14]。
3.5 防腐作用
杨明阳等人的研究结果表明，绿原酸对贡梨、红富士鲜切片都有保鲜效果，对圣女果的保鲜作用差[15]。詹晓如提取分离金银花活性成分绿原酸，然后将其用于医院常用几种制剂防腐试验，结果表明，0.02%绿原酸具有与0.03%尼泊金乙酯相同的防腐作用，证明绿原酸可以用于制剂防腐，以消除化学防腐剂毒副作用[16]。
3.6 防晒作用
张英等人的研究结果显示，金银花提取物在280～350 nm内具有良好的紫外吸收性能，金银花防晒霜体外评价SPF值与金银花提取物中绿原酸含量有关[17]。
4 结语
金银花作为传统的中药，对机体具有广泛的作用，是国家第一批药食兼用植物，具有极高的营养价值和保健作用，而其有效成分绿原酸是发挥作用的主要成分。目前关于金银花绿原酸的研究仍需进一步深入，还要做大量的试验研究，以促进金银花更大规模化生产和新型保健用品的开发。
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篇7：绿原酸无致敏性的综合评价
20世纪60年代初,Freedman SO等在寻找引起咖啡豆工人不断出现咳嗽、哮喘等过敏反应的原因时,于1964年首次在《Nature》杂志上提出了绿原酸可能是引起这一过敏反应的过敏原[8,9],然而,1965年的Lowell FC[10]和1966年的Layton LL等[11]分别根据各自的研究结果,发表了关于高纯度绿原酸不是致敏原的报道,并刊登在《The Journal of Allergy》杂志上。经过几年的争论,最终确定了绿原酸没有致敏原性,引起过敏的因素与低纯度绿原酸提取物杂质或共存大分子相关。
随着近年中药注射剂(TCMI)过敏反应的屡屡出现,业内人士在寻找致敏原时又将目光再次集中于绿原酸。依据是绿原酸为多数中药注射剂的有效成分之一,且又曾有报道绿原酸具有致敏原性。为了进一步验证并揭示绿原酸是否存在致敏性,本文在长期从事绿原酸及其制剂纯化、质控和安全性评价研究中,结合绿原酸相关文献提出的几种可能的致敏物,如绿原酸、小分子杂质和大分子物质等,设计了高纯度绿原酸及其注射剂、不同纯度绿原酸提取物、透析分离物、过期和降解制剂作为试验药物,通过豚鼠的全身主动过敏反应试验和大鼠(豚鼠)的皮肤被动过敏反应试验分别进行验证,同时采用LC-MS法分离鉴定能引起过敏反应溶液中的大分子物质,从而验证绿原酸是否有致敏原性,揭示引起致敏反应的可能物质,为绿原酸及其中药注射剂的安全性研究提供科学依据。本试验时间2007年11月～2010年9月。
1材料和方法
1.1仪器、试药和动物
1.1.1仪器LC-2010A高效液相色谱系统(日本岛津);LC-8A高效液相色谱仪系统(日本岛津);Acquity®SQD LC/MS仪(美国,Waters);磁力搅拌器(杭州华瑞仪器);高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1.1.2试药绿原酸原料药(纯度>99%);注射用绿原酸(规格:30mg,纯度>99%,含量>98%)、杜仲叶提取物(含绿原酸约28%)、杜仲叶提取物(含绿原酸约33.17%)、杜仲叶提取物(含绿原酸约92%)、金银花提取物(含绿原酸约22%)、过期注射用绿原酸(含量:97.71%)、降解注射用绿原酸(含量:91.35%,80℃加热48小时)由四川九章生物化工科技发展有限公司提供。卵白蛋白(华美生物工程公司分装);蛋清(市售);依文思兰(Koch-light)(上海化学试剂采购站分装);生理盐水(四川科伦药业股份有限公司);硫化钠(成都化学试验厂);透析膜(MWCO1000)(德国Visking)。
1.1.3动物豚鼠,雌雄兼有,体重(250～400)g,四川大学实验动物中心和四川省实验动物专委会养殖场提供[SCXK(川)2008-14];SD大鼠,雌雄各半,体重180～210g,四川大学实验动物中心提供(许可证号:第10号)。
1.1.4剂量设计根据临床人拟用绿原酸最大剂量lmg/kg体重,折算成豚鼠剂量约为7.5mg/kg体重,以每只豚鼠300g体重和给药体积0.5ml计算,确定供试药液浓度为2.25%。折算成大鼠剂量约为10mg/kg体重(豚鼠7.5mg/kg),以每只大鼠200g体重(豚鼠300g)和给药体积0.5ml计算,低剂量组供试药液浓度为0.45%(大鼠)[12],剂量组的供试药液浓度为2.25%。
1.2方法
1.2.1供试品溶液的制备取各受试药适量,加生理盐水溶解或稀释成含供试品2.25%和0.45%的溶液,作为高、低浓度供试品溶液;取高浓度供试品溶液2ml,加入透析袋,将袋悬浮于生理盐水中进行透析,直至袋内溶液中无绿原酸检出为止,制得无绿原酸的含未扩散大分子部分的透析内液,作为拟含大分子供试品溶液(简称大分子内液);取绿原酸饱和溶液适量,加入透析袋,经透析后至外液中绿原酸含量达约2.25%时,制得含小分子扩散部分的透析外液,作为无大分子的小分子供试品溶液(简称小分子外液)。
1.2.2全身主动过敏反应试验将豚鼠随机分为15组,每组5只,各组分别腹腔注射相应药液进行致敏,给药量为0.5ml/只,隔日一次,共4次。于末次致敏后第10天,各组豚鼠分别足趾静脉注射各组相应供试药液1.0ml/只激发,各组在激发注射后30min内观察是否出现过敏反应。结果见表1。
1.2.3皮肤被动过敏试验取健康SD大鼠16只,分为4组,即阴性对照组、阳性对照组、1.0%和0.4%绿原酸组,每组4只,雌雄各半,按组,隔日一次,连续4次分别腹腔注射生理盐水、20%蛋清液、1.0%及0.4%注射用绿原酸,注射量均为0.5ml/只,进行致敏。末次致敏后10天股动脉采血,制备各组血清,-20℃保存备用。将各组所得抗血清,分别用生理盐水稀释为1:2、1:4、1:8和1:16浓度溶液备用。另取健康SD大鼠按性别、体重分为4组,每组16只,雌雄各半。各组又分为4个抗血清浓度组,每组4只,雌雄各半。于各大鼠背部两侧脱毛(面积约3×4cm2),清洗制备实验区。于实验区皮内注射各组抗血清0.1ml。注射后24小时,各组分别尾静脉注射与致敏相同的激发抗原0.5ml及等量1%依文思兰液0.5ml进行激发,30min后处死动物,取实验区皮肤内层蓝色斑点,测量蓝色反应斑直径。蓝色反应斑大于5mm者判定为过敏试验阳性。结果见表2。
以豚鼠为实验动物同法试验。蓝色反应斑直径大于5mm者判定为被动皮肤过敏试验阳性。结果见表2。
1.2.4致敏物质的分离鉴于试验中,高纯度绿原酸和绿原酸提取物含小分子组分的透析外液均无致敏性现象,而含有大分子组分的透析内液可能出现明显的过敏现象,进一步分离鉴定透析内液中的大分子组分成为新的研究焦点。为此,采用LC-MS技术和大分子分离色谱柱对低纯度绿原酸提取物的透析内液进行分离鉴定。
液相色谱-质谱条件:色谱柱:Kromasil C-18 150×4.6mm,5μm,300A;流动相为0.1%甲酸:乙腈=95:5(v/v);流速:1μl/min;质谱条件:电喷雾离子源,ESI+电离方式;喷雾电压:2.8kv;源温度:90℃;椎孔电压:40 V;碰撞气流速:0.45。色谱图见图1,质谱图见图2。
2结果与讨论
由表1全身主动过敏试验结果表明,阳性对照组发生强烈的过敏反应,绿原酸的杜仲叶提取物和金银花提取物在绿原酸含量低于92%的33%,28%和22%供试品组均发生明显的过敏反应,而绿原酸含量在92%以上的绿原酸提取物供试品组皆未发现任何过敏现象;相同样品无论绿原酸含量高或低,经过平衡透析后,含小分组分的透析外液均未观察到任何过敏现象,同时,绿原酸含量大于92%的提取物及其绿原酸注射剂的透析内液均未观察到任何过敏反应。然而,绿原酸含量小于92%的提取物的透析内液发生明显的过敏反应,显然,过敏反应发生在低纯度绿原酸组及其透析内液组,反映出绿原酸提取物的纯度产生的致敏性与其中可能存在的大分子杂质相关联,而与绿原酸及其小分子杂质无关。
由表2大鼠和豚鼠皮肤被动试验结果均表明,静脉注射激发30min后,阳性对照组各抗体血清稀释度皮内注射动物的皮肤内层均出现蓝色斑点,测量蓝色反应斑直径均大于5mm,且随着抗血清浓度的降低,过敏反应阳性发生程度减弱。阴性对照组和各供试品组均未出现过敏反应。注射用绿原酸没有致敏性、甚至降解后的注射用绿原酸及其降解杂质和过期存放含量有一定下降的的注射用绿原酸也不引起过敏反应。再次表明绿原酸及其小分子降解杂质没有致敏性。
HPLC和LC/MS检测结果表明(如图1和图2),低纯度提取物透析内液中发现有大分子组分(分子量范围在1074～1081道尔顿和1431～1437道尔顿),而透析外液和高纯度绿原酸的透析内液均未检出类似大分子组分,外液中检出了绿原酸及其微量的类似物杂质峰。由于大分子更容易形成致敏原,且具有致敏性的低纯度绿原酸提取物,在除去大分子杂质后的含绿原酸的外液不再引起过敏反应,说明低纯度绿原酸提取物的致敏性也与其中的大分子物质密切相关,而与绿原酸及其小分子杂质没有关系。这一结果与上世纪60年代Layton研究小组实验结果相吻合。
综合国外文献对绿原酸致敏性的评述可知,人们对绿原酸致敏性的研究源于咖啡厂工人经常发生呼吸道哮喘、鼻炎或皮炎等过敏现象引起了医生的关注,在寻找致敏原时,发现咖啡豆中含量较高酸性小分子——绿原酸,从而展开了有关绿原酸是否致敏原的研究。自20世纪60年代初,加拿大的Freedman研究小组和美国的Layton研究小组分别发表的一系列的研究文章。在观点和结果相悖的情况下彼此印证,就绿原酸是否致敏原性进行了激烈的争论。
最初,Freedman研究小组发现生咖啡豆的水提液有强致敏性,皮肤直接接触0.02～5ml的水溶液(含5mg/ml)可产生明显的阳性水疱和红斑反应,水提取液通过Sephedex G-25柱进行分离,发现中间部分可产生强烈的被动转移阳性反应,通过三氯化铁鉴别这些组分中存在高浓度酚类化合物,经系统分析评价,将可疑化合物注入对绿咖啡过敏的10个工人的皮肤中,只有商购绿原酸(绿原酸纯度不确定)产生了阳性反应,根据这一结果,研究人员提示绿原酸可能是绿咖啡中的主要过敏原,并率先进行了报道[8,9]。Freedman小组进一步的研究推测绿原酸致敏机理为进入人体内与蛋白结合,而产生致敏活性,并由此推测绿原酸为半抗原物质[13],但是这一推断并没有被其进一步的实验所证实。之后Freedman等进行了咖啡酸和奎宁酸的被动皮肤转移试验,结果均为阴性[8,9]。由于绿原酸是咖啡酸和奎宁酸的缩合物,如果绿原酸为半抗原,则咖啡酸或奎宁酸中至少有一个部位与蛋白结合会使被动皮肤转移试验呈阳性,然而,阴性的试验结果证明了绿原酸没有与蛋白结合的活性部位,因此绿原酸作为半抗原的可能性不大。这也是Freedman等观点的欠缺之处。
根据Freedman等的研究结果,Layton研究小组进行了较为全面的系统研究,采用了逆流色谱纯化和平衡透析纯化等手段,采用高纯度绿原酸进行临床试验和动物试验,结果证明了绿原酸以及生咖啡中的小分子物质不是过敏原,明确指出低纯度绿原酸中存在的不能被透析的大分子物质才是引起过敏反应的致敏原[11],对此,两个研究小组分别以信函的形式在杂志上进行了多次讨论[14,15,16]。针对Freedman等研究中采用的商购绿原酸出现致敏性,Layton研究小组通过透析分离,证明了在商购绿原酸样品中存在的大分子杂质是导致过敏反应的原因;之后,Freedman等采用Layton小组提供的通过逆流层析法(CCD法)纯化后的绿原酸样品重复其试验,也得到与Layton小组相同的无过敏反应的试验结果,最终认同了精制后的绿原酸无致敏性。
其后,大规模的临床试验也证实了绿原酸不是致敏原。60年代末期,Francis C.Lowell也在超过300多例的具有各种过敏症状的病人中进行了皮肤划痕试验,结果未发现对绿原酸过敏的病例[17]。R.M.Karr等人在70年代末再次采用放射免疫吸附试验,对绿原酸是否为患有过敏性哮喘等职业病的咖啡工人的致敏原进行了研究,结果表明,绿原酸与这些职业病患者的过敏原无关[18]。再次通过人体临床试验证实了绿原酸无致敏性。至此,绿原酸不是致敏原在国外形成了定论。
此外,在1998年和2006年Hisatomi Ito和Maria Alejandra Hossen等人报道了咖啡酸及多酚类化合物可通过降低血管通透性发挥抗过敏作用[19,20],表明绿原酸不仅不具有致敏性,而且还具有抗过敏的作用。
2000年伊始,随着中药注射剂的安全性问题的不时出现,赖宇红等就中药注射剂变态反应研究亟待加强发表了综述,文中提出绿原酸广泛存在于中药注射剂中,且国外曾有绿原酸致敏性文献的报道,绿原酸是否具有致敏性问题在国内再次引起争议,但并无系统的研究文献支撑。2008年陈朝辉等所著注射用双黄连的免疫毒性研究,比较了绿原酸和注射用双黄连的过敏原性[21],结果表明,在大鼠同种和兔-豚鼠异种被动性皮肤试验(PCA)中,均未观察到阳性反应,证明绿原酸本身不具有抗原性,不能刺激机体产生针对绿原酸的特异性抗体。2010年初,Fang-hua Huang等研究组也试验证实在全身主动过敏和被动过敏反应中均未观察到绿原酸的致敏反应[22]。
但在2010年初,Fang-hua Huang等从类过敏反应角度,进一步进行绿原酸类过敏反应及其机理研究。作者进行了高剂量绿原酸诱导的豚鼠腹膜肥大细胞脱颗粒(DI%)试验,并采用光学显微镜、透射电子显微镜、流动细胞计数和β-己糖胺酶释放等试验观察和分析了绿原酸诱导的RBL-2H3细胞的脱粒情况。结果表明,绿原酸能引起肥大细胞脱颗粒,但与对照组比较脱粒指数(DI%)并未显著增加,作者提示该实验条件下绿原酸引起的应是一种类敏反应(naphylactoid),而类敏反应特指机体受外界物质刺激(药物,X光等)造成的类似过敏反应(anaphylaxis)的中毒症状。文献中所采用的高剂量绿原酸给药,可视为豚鼠腹膜肥大细胞在高剂量绿原酸作用下的一种应激反应,而不是过敏反应。该文献结论为:绿原酸可诱导的豚鼠肥大细胞和RBL-2H3细胞的脱粒作用是高剂量绿原酸类敏反应的机理之一。由于目前绿原酸的类敏反应国内外尚处于研究初期,公开发表的文献仅见上述一篇报道;且该研究主要试验数据来自于体外试验,其给药的剂量和浓度是否与药物人体应用情况相符还有待考证;另外,目前文献资料显示,整体动物模型用于评价类敏反应的动物为犬,而非豚鼠[23],我们在前期的绿原酸大剂量注射给药的犬急性毒性和长期毒性试验中均未观察到类敏反应。因此,这一结果是否可用于绿原酸类敏反应机理的依据尚需进一步动物实验和人体试验证实。
综上所述,20世纪60年代和70年代末,国外经过近20年研究和争论,以及后期的大规模临床研究已经统一到绿原酸本身无致敏性的定论上。国内由于中药注射剂的致敏性问题,在近年来又开展了一些关于绿原酸致敏性的探讨性研究,公开发表的文献虽然较少,但相关研究文献同样支持了绿原酸不是致敏原这一结论。本文通过全身主动过敏试验和皮肤被动过敏试验研究了不同纯度绿原酸提取物和高纯度绿原酸注射剂的致敏性,初步鉴定了存在于低纯度绿原酸提取物中的大分子物质的分子量范围在1074～1437道尔顿,系统证明了绿原酸不引起过敏反应,低纯度提取物中残存的大分子杂质可能为真正的致敏原,这一结论与国内外研究结果彼此印证。因此,从目前的动物实验看,绿原酸不存在致敏性的国内外研究结果基本一致,而目前国内尚未进行大规模临床试验,在人体实验中能否得出与国外临床研究一致的“绿原酸无致敏性”的结论,以及是否可能产生类敏反应,尚需要进一步临床研究证实。
摘要：目的:本文通过不同纯度绿原酸的致敏试验、通过平衡透析除去大分子后不同纯度绿原酸的致敏性试验、透析获得的大分子物质的致敏性试验、通过LC-MS分离鉴定致敏透析物以及比较分析国内外有关绿原酸致敏研究的文献,综合研究并论证了绿原酸是否具有致敏原性。方法:以豚鼠和SD大鼠为受试动物,分别采用了主动和被动过敏试验验证不同纯度绿原酸提取物、注射用绿原酸及经平衡透析后的透析内液和外液、过期和降解后的注射用绿原酸等受试药物;采用LC-MS法(Kromasil C-18 150×4.6mm,5μm,300A;流动相为0.1％甲酸:乙腈=95:5(v/v);流速:1μl/min;进样量:2μl。质谱条件:电喷雾离子源,Esi+;喷雾电压:2.8kv)鉴定了透析内液中1000道尔顿以上的大分子残留物的分子量范围;对比分析了从60年代初期至今绿原酸致敏性研究的相关文献。结果:纯度高于92％的绿原酸提取物、注射剂、过期注射剂、降解后注射剂、透析外液和透析内液均未发生过敏反应;纯度低于40％的绿原酸提取物及其透析内液均被LC-MS鉴定出大分子化合物并且发生明显的过敏反应。结论:试验结果证明了绿原酸没有致敏原性,与文献最后结论绿原酸无致敏性相吻合,同阐明引起致敏性的主要原因与提取物中存在的大分子物质密切相关。
篇8：绿原酸
关键词：菊花;绿原酸;超声提取;分光光度法
中图分类号： R284.2 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）04-0264-03
收稿日期：2014-05-09
基金项目：国家自然科学基金（编号：31300321）;河北省自然科学基金（编号：C2012201080）;河北大学大学生科技创新项目（编号：2013080）。
作者简介：司 超（1985—），女，山东滕州人，硕士研究生，主要从事药用植物次生代谢研究。E-mail：sisi19851204@163.com。
通信作者：姚晓芹，博士，副教授，主要从事药用植物次生代谢、植物逆境生理研究。E-mail：yaoxiao301@126.com。
菊花为多年生菊科草本植物，以头状花序入药，是我国传统中药，主要功效有散风清热、平肝明目、解毒、降压等，主治风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、明目昏花等症[1]。绿原酸是菊花主要的活性成分，它是植物体在有氧呼吸过程中合成的一种苯丙素类物质，具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利胆等多种功效[2-3]。目前，提取药用植物中绿原酸采用的方法主要有超高压提取法、热回流法、溶剂浸提法、酶解法、微波辅助萃取法、超声提取法等[4-7]。绿原酸含量测定方法主要有高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、紫外分光光度法等[8-10]。有学者利用可见分光光度法测定绿原酸含量，该方法主要是利用绿原酸能与FeCl3进行特殊的显色反应来测定植物中绿原酸含量，具有原理简单、仪器常见、成本低等优点[11]。笔者在前人研究的基础上对超声提取、显色条件进行深入研究，进一步完善采用可见分光光度法快速测定植物中绿原酸含量的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
主要仪器：722型可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），240W PS-40A型数控超声波清洗器（深圳市康洁洗净电器有限公司）。主要试剂：标准绿原酸（纯度95%，阿拉丁试剂上海有限公司）、FeCl3溶液、甲醇、乙醇。笔者所在实验室种植的怀菊，将菊花头状花序在105 ℃下杀青30 min，55～60 ℃下烘干至恒质量，粉碎、过筛，混匀备用。
1.2 超声波提取条件优化
1.2.1 提取溶剂 用60%甲醇、60%乙醇进行提取溶剂试验，比较不同提取剂对绿原酸提取效果的影响。取0.3 g干样，分别加入15 mL 60%甲醇、15 mL 60%乙醇溶液，超声提取30 min，过滤后用提取溶剂定容至25 mL刻度管内;取1 mL上述溶液加4 mL提取溶剂，置于10 mL刻度管中，加0.5 mL 0.02 mol/L FeCl3溶液（分别用60%甲醇、60%乙醇配制）振荡摇匀后静置60 min，用722型分光光度计于755 nm波长下进行比色，确定最佳提取溶剂。
1.2.2 提取容器 选择等容积的烧杯、锥形瓶、塑料瓶、试管进行试验，提取溶剂为60%甲醇溶液，提取方法、测定步骤同“1.2.1”节，比较提取容器对绿原酸提取效果的影响。
1.2.3 浸泡时间 用甲醇提取液分别浸泡样品0、3、6、12、18、24 h后进行超声提取，测定方法同“1.2.1”节，比较浸泡时间对绿原酸提取效果的影响。
1.2.4 提取时间 用甲醇提取液分别超声提取样品10、20、30、40、50、60 min，测定方法同“1.2.1”节，比较超声提取时间对绿原酸提取效果的影响。
1.2.5 提取次数 用甲醇提取液分别经超声波提取样品1、2、3、4次，每次时间10 min，每次加入最佳提取溶剂5 mL，提取完成后合并每次的提取液，过滤并定容，测定方法同“1.2.1”节，比较提取次数对绿原酸提取效果的影响。
1.2.6 提取溶剂浓度 分别用20%、40%、60%、80%、100%甲醇溶液提取样品，其他条件为已选出的最佳條件，测定方法同“1.2.1”节方法，比较不同浓度甲醇提取液对绿原酸提取效果的影响。
1.3 显色条件优化
配制0.01、0.02、0.03 mol/L FeCl3-甲醇显色溶液，显色时分别在样品液中加入0.5、1.0 mL进行试验，提取条件采用“1.2”节的优化条件。
1.4 正交试验
在提取、显色条件优化试验结果基础上设计正交试验，选出最优水平组合。选取对测定结果影响较大的2个因素，即提取剂浓度、显色剂用量进行正交试验。
1.5 标准溶液的配制
准确称取绿原酸对照品10 mg，加入最佳提取溶剂溶解并定容至50 mL，制成200 μg/mL标准液。在7个10 mL刻度管内分别加入0、1、2、3、4、5、6 mL标准贮备液，用80%甲醇稀释至标线，分别制成0、20、40、60、80、100、120 μg/mL标准液。按“1.3”节优化结果进行显色、测定。
2 结果与分析
2.1 超声波提取条件优化
2.1.1 提取溶剂对绿原酸提取效果的影响 绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，分子结构中有酯键、不饱和双键、多元酚3个不稳定部分，可以利用甲醇、丙酮、乙醇等极性溶剂从植物中提取出来。笔者分别以甲醇、乙醇为提取溶剂进行试验，试验过程中发现，以乙醇为提取剂在显示过程中容易出现沉淀，因此下面其他优化试验都用甲醇作为提取溶剂。
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2.1.2 提取容器对绿原酸提取效果的影响 由表1可知，试管提取效果最佳，另外，利用试管作为提取容器操作更方便。因此，本试验选用试管作为提取容器。
表1 不同容器对绿原酸提取效果的影响
容器 D755nm
烧 杯 0.188±0.005b
锥形瓶 0.181±0.007ab
塑料瓶 0.189±0.009ab
试 管 0.211±0.004a
注：同列数据后标有不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下表同。
2.1.3 样品浸泡时间、提取时间、提取次数对绿原酸提取效果的影响 由表2至表4可知，浸泡时间、提取时间、提取次数3个因素对绿原酸提取没有显著影响，因此选择不浸泡，超声提取1次，提取时间为30 min。
2.1.4 提取溶剂浓度对绿原酸提取效果的影响 由表5可知，甲醇浓度对菊花中绿原酸的提取效果有显著影响。提取
表2 浸泡时间对绿原酸提取效果的影响
浸泡时间（h） D755 nm
24 0.157±0.009b
18 0.162±0.004ab
12 0.166±0.002ab
6 0.168±0.003ab
3 0.167±0.003ab
0 0.178±0.003a
表3 提取时间对绿原酸提取效果的影响
提取时间（min） D755 nm
60 0.213±0.002a
50 0.192±0.011a
40 0.195±0.008a
30 0.202±0.003a
20 0.184±0.010a
10 0.205±0.006a
表4 提取次数对绿原酸提取效果的影响
提取次数（次） D755 nm
4 0.189±0.002a
3 0.183±0.002a
2 0.163±0.004b
1 0.160±0.007b
液吸光度随甲醇浓度的增加而增大。当甲醇浓度≤60%时，提取液吸光度随着浓度的增加变化比较剧烈，当甲醇浓度>60%时，提取液吸光度变化比较平缓，并且80%、100%甲醇处理对绿原酸的提取效果差异不显著。
表5 提取溶剂浓度对绿原酸提取效果的影响
甲醇浓度（%） D755 nm
20 0.028±0.003d
40 0.078±0.006c
60 0.195±0.004b
80 0.218±0.000a
100 0.222±0.003a
2.2 显色条件优化
表6表明，当显色剂浓度为0.01 mol/L、用量为0.5 mL时，样品产生沉淀，这可能是因为FeCl3含量不足;当显色剂浓度为0.02 mol/L、用量为0.5 mL时，吸光度最大;当显色剂浓度为0.03 mol/L时，吸光度显著降低。
表6 显色剂浓度及用量对绿原酸提取效果的影响
显色剂浓度
（mol/L） 显色剂用量
（mL） D755 nm
0.01 0.5 0（沉淀）
1.0 0.165±0.004b
0.02 0.5 0.182±0.004a
1.0 0.101±0.002d
0.03 0.5 0.136±0.003c
1.0 0.077±0.001e
2.3 正交试验结果
选取对绿原酸提取、显色影响明显的因子进行正交试验。以提取剂浓度、0.02 mol/L显色剂FeCl3的用量为考察因素，设计正交试验 （表7、表8）。由此可知，最優水平组合为A2B2，即甲醇浓度80%，显色剂用量0.5 mL。
表7 正交试验因素水平
水平
因素
A：提取剂浓度（%） B：显色剂用量（mL）
1 60 0.25
2 80 0.50
3 100 0.75
4 1.00
表8 正交试验结果与极差分析
序号
因素水平
A：提取剂浓度 B：显色剂用量
吸光度
1 1 1 0（沉淀）
2 1 2 0.206±0.001d
3 1 3 0.170±0.002e
4 1 4 0.154±0.002f
5 2 1 0.269±0.004a
6 2 2 0.239±0.003b
7 2 3 0.224±0.002c
8 2 4 0.217±0.003c
9 3 1 0.240±0.004b
10 3 2 0.239±0.003b
11 3 3 0.240±0.004b
12 3 4 0.237±0.005b
k1 0.177 0.127
k2 0.316 0.171
k3 0.319 0.159
k4 0.152
极差R 0.142 0.044
2.4 标准曲线
取不同浓度标准液5 mL，加入显色剂FeCl3-甲醇溶液0.25 mL充分振荡，静置30 min后于波长755 nm下比色，以80%甲醇加显色剂作参比调零。以吸光度为纵坐标、相对应的绿原酸浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为y=0.002 3x-0.010 4，r2=0.995 9（图1）。
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2.5 加标回收率
称取菊花干样粉末6份，每份0.3 g，按正交试验筛选出的最优条件进行提取，取6支试管，分别加入提取液0.5 mL、60 μg/mL标液0.5 mL，定容至5 mL，加0.25 mL显色剂进行显色，利用分光光度分析加标率直接计算数学模型[12]，得出平均回收率为100.83%。
2.6 精密度
對120 μg/mL标准溶液连续测定20次，测得样品中绿原酸吸光度RSD值为0.22%，符合相关规定，表明试验精密度很好。
2.7 重复性
称取5份样品，每份0.3 g，按照优化条件进行提取测定。经计算RSD值为1.10%，表明试验重复性符合有关规定。
3 结论
与常规提取方法相比，超声波提取法具有操作简单、溶剂用量少、提取时间短、对环境污染小、被提取活性物质不易被破坏、提取率较高等优点[13]。酚类物质与FeCl3发生显色反应，能够用来检验酚羟基的存在，并对绿原酸进行简单快速的定量分析[14]。本试验综合考虑了与测定相关的提取及显色因子，结果表明，菊花中绿原酸提取测定最优方法为用80%甲醇作提取剂，超声提取30 min，加0.02 mol/L FeCl3 0.5 mL 进行显色反应，静置30 min后，在可见分光光度计 755 nm 波长下测定吸光度。本方法成本低、简便易操作、精密度好、重复性强，可用于菊花中绿原酸的提取测定。
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