花背蟾蜍胎肺发育中表皮生长因子受体的表达和定位作用

花背蟾蜍胎肺发育中表皮生长因子受体的表达和定位作用（精选2篇）

篇1：花背蟾蜍胎肺发育中表皮生长因子受体的表达和定位作用

1 资科与方法

1.1 标本来源及制备

自2008年6月~2010年6月选取大面积烧伤患者, 平均烧伤面积为 (32.5±4.2) %TBSA, 创面中的浅Ⅱ度创面, 共15例, 男10例, 女5例;年龄19~43岁, 创面位于下腹部和大腿, 经组织学证实均为浅Ⅱ度创面, 患者无特殊疾患。每一病例经知情同意后, 分别于伤后1、3、5、7、9、11 d时于局麻下用眼科角膜环钻切取包括创面、创基及少量皮下脂肪在内的标本, 选取植皮手术时取皮区的正常皮肤作为对照, 分别置于10%中性福尔马林和4%多聚甲醛中固定, 乙醇脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋, 切成5μm的组织切片备用。

1.2 OPN和EGFr检测

(1) OPN检测:切片二甲苯脱蜡2次, 每次10 min;梯度乙醇水化, 0.01 mol/L PBS浸洗3次, 每次5 min;3%过氧化氢室温孵育30 min, 0.01 mol/L PBS浸洗;0.1%胃蛋白酶37℃孵育10 min, 0.01 mol/L PBS浸洗3次, 每次5 min;滴加5%BSA, 37℃封闭30 min, 吸去多余液体。鼠抗人OPN单克隆抗体 (1∶100) (美国SANTA CRUZ公司) 37℃孵育1 d, 经0.01 mol/L PBS浸洗后滴加生物素化羊抗鼠Ig G (美国SANTA CRUZ公司) , 37℃孵育30 min后, 0.01 mol/L PBS清洗, 滴加SABC, 37℃下孵育30 min, 再次经0.01 mol/L PBS清洗, 以二氨基联苯氨 (DAB) 显色, 镜下控制反应时间, 苏木精轻度复染, 常规脱水、透明、封片, 同时设无一抗的空白对照。显微镜下观察, 阳性颗粒为棕色。 (2) EGFr检测:用地高辛标记EGFr的c DNA探针后进行组织切片的原位杂交, 组织切片脱蜡入水, 0.2 mol/L盐酸酸化, 蛋白酶K消化, 酒精脱水, 置预杂交液 (42℃) 预杂交4 h, 入杂交液杂交 (42℃) 17 h后用Boegringer Mannheim公司产品Dig-DNA labelling and detection试剂盒观察切片中EGFr活化表达的m RNA的变化情况。显微镜下观察, 阳性颗粒为棕黄色。400倍光镜下测定其相对含量, 每组选择5张切片, 每张切片连续记数5个视野, 求出每个视野内阳性颗粒平均数。阴性 (-) :视野内无阳性信号;弱阳性 (+) :视野内可见10个以下阳性信号;中等阳性 (++) :视野内可见11~30个阳性信号;强阳性 (+++) :视野内可见大于30个阳性信号。

1.3 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件处理组间变化, 进行方差分析, 组间行Student's t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

实验结果显示, 烧伤能诱导创面组织OPN和EGFr的表达, 但二者表达不尽相同。在正常皮肤中, OPN阳性颗粒细胞分布于毛囊、汗腺及皮脂腺, 在表皮及真皮部分均无分布, 表达强度 (-) 。烧伤后第1天起OPN阳性颗粒广泛分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中及毛囊、汗腺及皮脂腺周围, 但呈松散稀疏分布;在第3天时这种分布最为密集, OPN表达强度最高 (+++) , 随后的5~7 d其表达强度逐步减弱。正常皮肤内EGFr仅有弱阳性表达 (+) , 烧伤后第1天起EGFr的表达逐渐增加, 在伤后7 d时达峰值, 呈强阳性表达 (+++) , 此后逐渐下降, 其阳性颗粒主要分布于表皮基底细胞胞浆、真皮成纤维细胞的胞核内及毛囊、汗腺及皮脂腺周围。伤前OPN和EGFr阳性颗粒表达数量与伤后表达高峰期自身对比差异均有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1、图1。

注:伤前OPN和EGFr阳性颗粒表达强度与伤后高峰期表达强度自身对比差异有高度统计学意义, P<0.01

3 讨论

皮肤创伤愈合的基本过程可以分为三个连续或者重叠的时期:炎症期、细胞外基质沉积期及组织改建期。这一过程有多种细胞因子、各类型的细胞和细胞外基质共同参与[4,5]。这些细胞因子如果调控失常会干扰正常的组织修复过程而出现愈合过慢形成溃疡或者愈合过度形成瘢痕[6]。骨桥蛋白是一种磷酸化糖蛋白, 在1985年, Franzen等[7]在大鼠矿化的骨基质中分离出一种含“精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸”序列 (RGD sequence) 的磷酸化糖蛋白, 命名为骨桥蛋白 (Osteopontin, OPN) 。随后的研究发现OPN广泛存在于多种组织中, 包括肾、胆囊、肺部、乳房、肠胃以及尿道[8,9]。此外, OPN作为一种炎症因子, 参与各种组织的病理性纤维化过程, 在多种肿瘤组织内也发现OPN的表达[10,11]。在皮肤创口愈合方面, 最近的研究发现抑制ICR小鼠OPN的表达可加速其皮肤创口愈合, 并减少肉芽组织及瘢痕的形成, 但其内在机制有待进一步研究。本实验显示, 在正常皮肤的表皮及真皮部分均未检测到OPN阳性颗粒, 在毛囊、汗腺及皮脂腺周围可见散在分布。烧伤后第1天起OPN阳性颗粒广泛分布于真皮层成纤维细胞的胞浆及毛囊、汗腺、皮脂腺周围, 但呈松散稀疏分布;在第3天时这种分布最为密集, OPN表达强度最高, 随后的5~7 d其表达强度逐步减弱。可以看出OPN表达的高峰期与细胞外基质沉积的高峰期一致, 推测OPN可能参与了创面修复初期的细胞外基质的沉积, 从而影响创面愈合。表皮生长因子 (EGF) 、EGFr蛋白在调控组织细胞的增殖方面有很重要的作用, 各种刺激引起EGF、EGFr蛋白表达后, 组织中相应的细胞因子增多, 从而促进细胞分裂增殖和创伤的愈合[12]。EGFr是多细胞生物中介导EGF发挥其生物学效应的关键成分, EGF只有与其靶细胞膜表面的EGFr结合才能发挥其生物学作用。本研究结果表明:正常皮肤内EGFr仅有弱阳性表达, 烧伤后第1天起EGFr的表达逐渐增加, 阳性颗粒多数分布在创缘上皮、创面表面的细胞、真皮浅层成纤维细胞、皮脂腺、汗腺、毛囊周围, 伤后7~9 d EGFr表达量最多, 表达最强, 伤后3~5 d次之, 伤后11 d进一步减少。这可能是伤后早期创面组织细胞对创伤刺激尚无明显反应, EGFr合成较少;伤后7~9 d时组织细胞对创伤刺激反应明显增强, EGFr合成增多;伤后11 d以后, 创面缩小, 组织细胞自我调节, 降低了反应性, 因此EGFr蛋白合成下降, 这与机体为避免组织过度增生所产生的“接触性抑制”相一致[13]。

创面修复是一个多种因素参与的复杂生物过程, 本研究显示:在整个临床创面修复过程中, 特别是创面修复的初、中期, OPN和EGFr均有明显的表达, 且分布范围多数在创面修复细胞增殖的活跃部位 (表皮或真皮层成纤维细胞的胞浆或胞核、毛囊、汗腺、皮脂腺等) , 这与以往动物实验的结果相似, 这种表达的时相性和区域性分布特点表明OPN和EGFr参与了临床创面修复的各时期 (特别是初、中期) 的细胞代谢和增殖。提示我们如果在临床创面修复的不同时期采取措施, 合理调控OPN和EGFr的表达, 将有助于加快创面愈合, 减少瘢痕形成。

摘要：目的:探讨烧伤后创面组织愈合过程中骨桥蛋白 (osteopontin, OPN) 和表皮生长因子受体 (epithelial growth fac-tor receptor, EGFr) 表达顺序及分布规律。方法:应用免疫组化与原位杂交方法对临床15例烧伤患者创面愈合过程中OPN和EGFr表达变化进行检测, 并计算阳性表达颗粒细胞数。结果:烧伤创面愈合中OPN和EGFr有明显规律性的表达变化, 但两者的表达模式不尽相同。OPN的表达在伤后3 d达最高值, 其阳性颗粒主要分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中。EGFr的表达在伤后7 d达峰值, 其阳性颗粒主要分布于表皮基底细胞胞浆及真皮成纤维细胞的胞核内。结论:烧伤可以诱导皮肤创面组织中OPN和EGFr的表达, 其表达具有时相与部位分布特征。这表明OPN和EGFr作为调控因子参与了临床创面修复过程, 合理调控其表达变化有助于临床创面修复。

篇2：花背蟾蜍胎肺发育中表皮生长因子受体的表达和定位作用

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集河南省焦作市第一、二人民医院和贵阳医学院附属医院2005至2009年临床资料完整并经病理证实的原发性食管癌患者共57例。男42例,女15例。年龄45~74岁,平均(56.05±7.99)岁。良性对照12例。所有患者术前均未接受过化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗。

1.2 方法

1.2.1 EFGR检测

69例组织标本应用10%中性福尔马林固定,然后石蜡包埋,看原病理切片后,再选择相应部分做5μm连续切片。采用SABC(Strep Avidin-Biotin Complex,SABC)法[2],先进行EGFR免疫组织化学染色,其后用苏木素复染。操作步骤严格按说明书进行。空白对照采用PBS代替一抗。

1.2.2 s IL-2R测定

应用双抗体夹心法,取术前患者外周静脉血2m L,2h内分离血清,用抗IL-2R单抗包被聚乙烯酶标板,100µL/孔,4℃,过夜。1%BSA 200µL/孔封闭,43℃,1.25h,洗涤后每孔加100µL样品稀释液,50µL不同稀释度的标准品或待测血清,37℃,2h,洗涤后加100µL兔抗IL-2R多克隆抗体,43℃,30min。洗涤后加驴抗兔抗体100µL,43℃,30min。洗涤后加OPD底物液100µL/孔,室温避光反应5~10min后加50µL中止液中止反应。以波长490nm测定吸光度(OD)值,以标准品浓度(OD)值绘制标准曲线,用样品OD值减空白对照OD值,在曲线上查出样品s IL-2R含量,以U/m L表示。

1.2结果判定[3]

本实验染色阳性信号呈棕黄色。结果由一名医师在光镜下任意选择5个具有代表性的高倍视野,每个视野分别计数200个细胞,共计1000个细胞。EGFR阳性判定[2]:EGFR的阳性染色为位于胞浆及胞膜上、个别位于胞核上的棕黄色颗粒,按染色深度和阳性细胞所占比例分别计分:(1)染色深度:无着色为0;浅着色为1;深着色为2。(2)阳性细胞所占比例:无着色为0;着色≤1/3为1;1/3<着色≤2/3为2;着色>2/3为3。两者结果相加>3,为阳性。

1.4 统计学方法

均数表示采用均数±标准差,计数资料比较采用卡方检验,计量资料采用t检验,P值<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者EGFR和s IL-2R的表达

见表1。

2.2 食管癌EGFR和s IL-2R的表达与临床病理特征的关系

见表2。

3 讨论

3.1 EGFR是原癌基因C-erB-1的表达产物,现代研究发现,细胞的生长速度主要与细胞的EGFR有关。一般认为,正常良性病变EGFR的阳性表达率很低或呈阴性,癌变时可明显升高[4]。本研究发现,在12例对照组中,2例EGFR阳性,阳性率为16.67%,表达低于食管癌组(66.67%),有显著临床意义。本实验显示,EGFR在食管癌中表达情况与患者病变部位、性别无关。

由表2可知,中晚期食管癌EGFR的阳性率为80.00%,明显高于早期食管癌(16.67%)。其中有食管外浸者为81.82%,无食管外浸者为45.83%(P<0.05)。同时,在有淋巴结转移的食管癌中,EGFR的阳性率为88.89%,显著高于无淋巴结转移者(56.41%)。因此,EGFR可以作为判断食管癌预后的一个良好指标。

3.2可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)是1985年由Rubin等发现并报道的,是由活化的淋巴细胞膜表面的IL-2R脱落所形成的,是一种重要的免疫抑制因子。它可竞争性地与IL-2结合,抑制T淋巴细胞的增殖,在免疫缺陷病、感染性疾病、器官移植、排斥反应、恶性肿瘤等血清sIL-2R的浓度增高。本组食管癌患者血清sIL-2R水平较良性对照组明显升高,表明食管癌患者存在着明显的免疫调节紊乱和免疫抑制。恶性肿瘤患者sIL-2R增高的机制目前还不完全清楚,多数学者认为不是肿瘤本身直接引起的,而是与肿瘤透导的免疫反应有关。我们认为血清sIL-2R的升高反映了恶性肿瘤患者的免疫功能低下,并且它可作为一种间接的标志物,有助于胃肠道良、恶性疾病的诊断。

本文发现,血清sIL-2R水平与性别无关,但与肿瘤浸润和转移有关。肿瘤有食管外浸润,血清sIL-2R显著高于无食管外浸润;有淋巴结转移者,sIL-2R水平显著高于无淋巴结转移者。提示肿瘤的播散转移与血清中sIL-2R释放增多有关。

参考文献

[1]Boonstra J,Rijken P,Humbel B,et al.The epidermal growth factor[J].Cell Biol Int,1995,19(5):413-433.

[2]杜卓民.实用组织学技术[M].北京:人民卫生出版社,1998.

[3]栾复新,王孟薇,祝庆孚,等.幽门螺杆菌感染与PCNA、TGF-α、EGFR表达关系的探讨[J].临床消化病杂志,1996,8(4):148-150.