CD34+细胞

2024-07-09

CD34+细胞(精选八篇)

CD34+细胞 篇1

关键词:诱导多潜能干细胞,重编程,脐带血CD34+细胞,非整合型质粒

诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)是指将特定的转录因子导入成体细胞,重编程形成的形态和功能上类似于胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的一类细胞。自从2006年日本东京大学的Takahashi等[1]第一次发现i PS细胞以来,经过各国研究者努力探索,i PS诱导技术有了突飞猛进的发展。近年来重编程i PSCs的方法不断优化,如纯化的蛋白、m RNAs和非整合型质粒等[2,3,4,5,6,7,8,9,10]。然而,使用蛋白和m RNAs都需要多次重编程靶细胞,效率较低。人们使用非整合质粒成功的重编程人神经祖细胞和神经成纤维细胞,形成了非整合型i PS细胞系[4,5]。Chou等[8]报道了使用一种游离型载体EBNA1/Ori P高效重编程人脐带血细胞和外周血细胞形成i PSCs,避免了基因整合的危险。Meng等[11]也利用改进的游离型载体高效重编程脐带血CD34+细胞形成了无基因整合的i PSCs。为了使人体细胞的i PSCs可以分化成所需的细胞类型,用于临床治疗、体外重建疾病模型、药物筛选,利用一种基因非整合型和无病毒插入型诱导技术重编程人成体细胞形成i PSCs是更有应用价值的方法。本研究利用两种游离型载体,并携带不同的质粒组合,即p EB-C5、p EB-Tg和p EV SFFV-OS、p EV SFFV-MK、p EV SFFV-B分别将人脐带血来源的CD34+细胞重编程形成了质粒非整合型hi PSCs,并对其多能性进行鉴定。两种方法效率相似,均无外源基因插入,具有高效性和安全性,进一步推动了hi PSCs临床应用的进程。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人脐带血(天津市中心妇产科医院提供,患者签署知情同意书)来源的CD34+细胞;小鼠成纤维细胞(MEF);H1细胞系(天津血液病研究所保存);p EB-C5(表达OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC和LIN28)和p EB-Tg(SV40 Large T antigen)(Addgene公司);p EV SFFV-OS(OCT4-2a-SOX2),p EV SFFV-MK(MYC-2a-KLF4)和p EV SFFV-B(BCL-XL)(天津血液病研究所保存);Human CD34+cell nucleofection kit(Lonza公司);Anti-TRA-1-60、Anti-SSEA4、Anti-OCT4、Anti-Nanog和Accutase(Stemgent公司产品);引物对(Millipore公司):h Oct4上游引物5′-ATTCAGC-CAAACGACCATCT-3′,下游引物5′-GCTTCCTC-CACCCACTTCT-3′;h Sox2上游引物5′-CACACTGC-CCCTCTCACACA-3′,h Sox2下游引物5′-CCCTCC-CATTTCCCTCGTTT-3′;NANOG上游引物5′-GCC GAAGAATAGCAATGGTGTG-3′,NANOG下游引物5′-GGAAGAGTAGAGGCTGGGGTAG-3;h GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′,h GAPDH下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.2 方法

1.2.1 人脐带血CD34+细胞的分离培养

利用Ficoll密度梯度离心法分离取得人脐带血单个核细胞(human cord blood mononuclear cells,h CB-MNCs),然后避光操作,每108个细胞先加入100μL Fc-R阻断剂,再加入100μL CD34+Microbeads,充分混匀后4℃避光孵育30 min,再利用MACS磁珠分选得到人脐带血CD34+细胞。获得人脐带血CD34+细胞培养在6孔板,使用人CD34+细胞培养基进行培养。

1.2.2 非整合质粒转染重编程过程

人脐带血CD34+细胞培养9 d,使用Amaxa细胞核转染仪行细胞核转染(称为转染第0天)。两组不同的方法分别进行转染。第1种方法:质粒包含p EB-C5和p EB-Tg,比例为8μg p EB-C5+2μg p EB-Tg,质粒转染程序为T-016。第2种方法:p EV SFFV-OS、p EV SFFV-MK和p EV SFFV-B,比例为10μg OS+5μg MK+5μg B,质粒转染程序为U-008。将转染后的细胞(2×106细胞)种到12孔板的1个孔中培养,24 h后转移到预先铺有MEF的6孔板,加入h ES培养基和MEF培养基每孔各1m L,封口膜封闭平板进行离心,1000 r/min25℃30 min。继续培养,用h ES培养基隔天换液,第9天时更换条件培养基(MEF-derived conditioned medium,MEF CM),电转后第3天开始加Na B(0.25 mmol/L),直到克隆形成。转染第14天用TRA-1-60活染鉴定完全重编程的细胞并挑取克隆进行传代培养(图1)。

人脐带血CD34+细胞培养9 d(即第0天)开始转染,24 h后转移到铺有MEF的6孔板培养,第3天开始使用人ESC培养基并加入NaB,第9天更换MEF CM培养基,第14天用TRA-1-60活染鉴定完全重编程的细胞并挑取克隆进行传代培养

1.2.3 i PSCs初步鉴定并传代

用TRA-1-60鼠Ig M抗体染色,初步鉴定重编程的克隆,TRA-1-60抗体(1∶300)和Alexa555标记的抗小鼠Ig M二抗(1∶500)稀释于ESC培养基中,然后加入重编程的细胞中,0.5 m L/孔,37°C孵育1 h,PBS洗1遍,加入新鲜的ESC培养基或CM。倒置荧光显微镜下观察TRA-1-60+克隆形成情况,计数克隆总数及TRA-1-60+克隆数,挑取阳性的克隆传代培养扩增,传至8~10代细胞系基本稳定。

1.2.4 免疫荧光染色检测i PSCs多能性基因表达

两组质粒诱导形成的CB-CD34+i PSCs分别传代扩增,取传代至第5代(P5)的一部分细胞传到24孔板中,当i PS细胞克隆长到适当大小时,使用4%多聚甲醛固定细胞15 min,然后0.1%Triton X-100透膜10 min,PBS洗3遍,再加入山羊血清工作液室温封闭15 min。取稀释好的抗体anti-TRA-1-60(1∶300)、anti-SSEA-4(1∶100)、anti-NANOG(1∶100)、anti-OCT4(1∶100),分别加入相应的孔中,100μL/孔,室温避光孵育2 h,然后PBS洗3遍,每孔加入相应的二抗Alexa FLuor488标记的羊抗兔Ig G或Alexa555标记的羊抗鼠Ig M/Ig G(1∶500),室温避光孵育1 h,PBS洗3遍,再加入DAPI染细胞核5 min,PBS洗3遍,倒置荧光显微镜下观察胚胎干细胞4种多能性标志基因TRA-1-60、SSEA-4、NANOG、OCT4表达。

1.2.5 Real-time PCR检测全能性基因表达

6孔板中i PSCs用稀释好的accutase进行消化,除去支持细胞,加入PBS终止消化,吸出废液。加入h ESM,将i PSCs克隆刮下放入离心管,1000 r/min离心5 min,弃上清,提取细胞RNA,反转录成c DNA。取重编程CB-CD34+形成的i PSCs、H1细胞(即h ES细胞系,阳性对照)、CB-CD34+细胞(阴性对照)的c DNA进行Real-time PCR鉴定内源性基因Oct4、Sox2、NANOG的表达量。采用2-ΔΔCt方法计算各目的基因在各个细胞群的相对表达量,h GAPDH为内参,H1为参照样本。ΔΔCt(目的基因,细胞群)=(Ct目的基因-CtGAPDH)细胞群-(Ct目的基因-CtGAPDH)H1。

1.2.6 核型鉴定

分别取两组质粒诱导形成的i PS细胞进行核型鉴定。使用HE染色,随机选取中期分裂相的细胞20个以上进行核型正确率统计。人正常为46条染色体,一般认为有70%~80%的细胞染色体为46条时,此hi PS细胞系则为较好的细胞系。通过染色体核型显带进行核型分析。

1.2.7 畸胎瘤形成实验

分别选取核型鉴定正常的重编程的i PS细胞传代扩增,传至第9代时,accutase进行消化去掉杂细胞,加入PBS终止消化。约5×106细胞重悬到PBS与Matrigel solution(1∶1)稀释的200μL的溶液中,注射到NOD/SCID免疫缺陷小鼠腋窝皮下,2个月左右可观察到畸胎瘤形成,取下畸胎瘤,10%甲醛固定24 h,石蜡包埋,HE染色,显微镜下观察畸胎瘤组织形态。

1.3 统计学方法

采用Graph Pad Prism 5.0软件处理分析结果数据,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重编程过程中克隆形态变化及诱导效率观察

两种游离型载体p EB-C5(C5)+p EB-Tg(Tg)和p EV SFFV-OS(OS)+p EV SFFV-MK(MK)+p EV SF-FV-B(B)重编程CB CD34+细胞形成的i PSCs的过程中,细胞核转染第9天时,显微镜下即可看到i PS克隆的初始形态;第14天时,完全重编程的克隆使用TRA-1-60活染鉴定,倒置荧光显微镜下观察TRA-1-60+克隆形态,取阳性克隆传代培养并观察形态变化(图2),发现与h ESC克隆非常相似,计数克隆总数和TRA-1-60+克隆数,6孔板的每个孔(2×106CB CD34+细胞)可观察到约900个类似ES细胞的克隆,TRA-1-60+克隆约450个,克隆效率(即TRA-1-60+克隆数/克隆总数)约为50%(图3)。

A、B:C5+Tg和OS+MK+B两组质粒分别诱导9、14 d及TRA-1-60染色的细胞形态图;C:C5+Tg和OS+MK+B两组质粒分别重编程形成的hi PS细胞传代过程中细胞形态图

A:p EB-C5、p EB-Tg和p EV SFFV-OS、p EV SFFV-MK、p EV SFFV-B两组质粒分别诱导CB CD34+形成的类似于ES细胞的总克隆数比较:两组质粒重编程细胞中均可观察到2×106CB CD34+细胞约900个类似ES细胞的克隆形成;B:两组质粒诱导形成的TRA-1-60+克隆占总克隆数的百分比比较:两组质粒重编程TRA-1-60+克隆均约450个,两者克隆效率(即TRA-1-60+克隆数/克隆总数)均约为50%

2.2 重编程的hi PSCs多能性基因的鉴定

利用p EB-C5、p EB-Tg和p EV SFFV-OS、p EV SFFV-MK、p EV SFFV-B两组质粒分别诱导CB CD34+形成hi PSCs经免疫荧光染色显示,hi PSCs高表达多潜能标记基因Oct4和NANOG和未分化特异性膜表面标记基因TRA-1-60和SSEA4(图4)。实时定量荧光PCR显示,hi PSCs多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的表达量与h ES细胞系H1相比,表达量比较接近,差异无统计学意义(P>0.05),而与CD34+细胞相比,差异有统计学意义(P<0.05),见图5。

图A、B分别为利用p EB-C5、p EB-Tg和p EV SFFV-OS、p EV SFFV-MK、p EV SFFV-B两组质粒分别诱导CB CD34+形成hi PSCs,多能性基因TRA-1-60、SSEA4、NANOG、OCT4的表达

hi PS1(C5+Tg诱导形成);hi PS2(OS+MK+B诱导形成);H1(ES细胞系)为阳性对照;CD34+细胞做阴性对照;*P>0.05,***P<0.05

2.3 核型鉴定结果

两组非整合型质粒重编程CB CD34+细胞形成的i PSCs,细胞核型分析发现,染色体为46条细胞比例在70%~80%之间,且核型和正常人的细胞核型相同,即(46,XX)(图6),说明重编程的细胞核型正常。

A:p EB-C5+p EB-Tg重编程CB CD34+细胞形成的i PSCs正常核型图;B:p EV SFFV-OS+p EV SFFV-MK+p EV SFFV-B重编程CB CD34+细胞形成的i PSCs正常核型图

2.4 畸胎瘤形成结果

利用畸胎瘤形成的方法对所建立的i PS细胞进行体内分化潜能检测,发现8~12周时取出免疫缺陷小鼠皮下直径约2 cm畸胎瘤,行病理切片HE染色,结果显示具有三胚层结构,说明来源于CB CD34+细胞的i PS细胞在免疫缺陷小鼠体内具有形成三胚层结构的能力(图7),重编程的hi PSCs具有分化多能性。

3 讨论

为了提高重编程的i PS细胞的安全性使其易于走向临床应用,人们在诱导i PSC技术方面进行了深入的探索,Nakagawa等[12]和Wernig等[13]发现,诱导iP S细胞过程中可以将过表达会导致细胞恶性转变的c-MYC基因[14]剔除,避免了c-MYC原癌基因的插入。研究者们发现,重编程介导的载体和媒介从腺病毒到脂质体、质粒再到后来的蛋白载体[3,15],一定程度上降低了病毒载体带来的风险,但使用蛋白和m RNAs重编程靶细胞,效率较低,使用不方便,不易推广使用。近年来越来越多的研究者[16,17,18,19]发现,利用非整合的游离型载体重编程人体细胞形成iP SCs,不会改变基因组序列,进一步降低了致瘤的风险,重编程的iP S细胞的安全性较高,使其易于走向临床应用。

A:由p EB-C5+p EB-Tg重编程CB CD34+细胞形成的i PS细胞分化形成的畸胎瘤,具有三胚层结构;B:由p EV SFFV-OS+p EV SFFV-MK+p EVSFFV-B重编程CB CD34+细胞形成的i PS细胞分化形成的畸胎瘤,具有三胚层结构

CD34+细胞 篇2

免疫磁珠法分离骨髓CD34+细胞的方法研究

目的 探讨免疫磁珠法分离CD34+细胞的方法. 方法 应用密度梯度离心法分离骨髓单一核细胞,后采用免疫磁珠法从单一核细胞中分选出CD34+细胞,流式细胞仪鉴定其纯度. 结果 各样品分离出的`CD34+细胞占骨髓单一核细胞含量的(2.19±0.12)%,经流式细胞仪鉴定应用免疫磁珠分离的CD34+细胞纯度为(94.6±2.1)%. 结论 免疫磁珠法是分离CD34+细胞较理想的方法.

作 者:万永山 李新华 张开明 WAN Yong-shan LI Xin-hua ZHANG Kai-ming  作者单位:太原市中心医院皮肤科,太原,030009 刊 名:山西医科大学学报  ISTIC英文刊名:JOURNAL OF SHANXI MEDICAL UNIVERSITY 年,卷(期):2008 39(4) 分类号:Q503 关键词:CD34+细胞   免疫磁珠法   骨髓   造血细胞  

CD34+细胞 篇3

目前,OSF的血管分布程度仍然存在争议,虽然不能直接检测新生血管数量,但是可以通过检测CD34、CD31和CD105等内皮细胞标记物计算平均血管密度(mean vascular density,MVD),从而间接反映新生血管生成。CD34为人类造血祖细胞抗原,是高度糖基化的i型跨膜糖蛋白,分子量为110 k D。 CD34也是重要的血管生成标记物,能够反映组织微血管密度[3]。CD34在造血干细胞、内皮细胞、间质细胞及真皮层树突细胞中表达,分布在血管周围和神经鞘内。免疫组织化学法检测显示,CD34主要在小血管或新生血管、内皮及肿瘤内皮细胞中表达[4]。

碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)、 转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)及低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)等生长因子在维持OSF结缔组织血管完整性中发挥重要作用。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)是一种肝素结合蛋白(heparin-binding protein,HBP),FGF的信号传导需要FGF与细胞表面乙酰肝素蛋白聚糖的结合[5]。FGF家族包括22个成员,所有成员都能通过促进内皮细胞增殖及形成管状结构,从而促进血管生成。b FGF不但能促进血管形成,还能促进多种细胞有丝分裂[6]。

本研究采用免疫组织化学法检测OSF中CD34和b FGF的表达,并根据CD34和b FGF的免疫组织化学法检测结果对OSF组织中新生血管进行定量分析。比较不同组织学分级OSF的平均血管密度,并探讨不同组织学分级OSF中CD34和b FGF的表达意义及相关性,旨在进一步阐明微血管系统在OSF进展中的作用。

1资料与方法

1.1研究对象

选取2014年1月-2014年12月在中南大学湘雅医学院附属海口医院口腔科就诊,经临床和病理确诊的OSF患者30例为实验组,取患者口腔颊部黏膜。其中男性19例,女性11例;平均年龄42.5岁。对照组10例标本取自本院口腔外科拔除埋伏阻生牙的健康口腔黏膜,所有健康志愿者无槟榔咀嚼史。30例OSF组织样本中,早期11例,中期17例,晚期2例。对照组包括7例男性和3例女性,平均年龄30.6岁。30例OSF患者中,17例患者(56.7%)有槟榔咀嚼史,12例患者(40.0%)吸烟时咀嚼槟榔。

1.2免疫组织化学法

所有标本4μm石蜡连续切片,60℃烤片2 h, 常规脱蜡至水,30 ml/L过氧化氢灭活内源过氧化物酶10 min,0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤,枸橼酸修复液(p H=6.0)微波加热修复15 min,0.1 mol/L PBS洗涤,正常山羊血清封闭液封闭15 min,滴加CD34或b FGF抗体,常温放置30 min,4℃湿盒过夜,0.1 mol/L PBS洗涤,滴加二抗工作液室温孵育20 min,0.1 mol/L PBS洗涤,滴加辣根酶标记链霉卵自素工作液,37℃孵育20 min, 0.1 mol/L PBS洗涤。滴加新鲜配制的二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB),高倍镜下控制染色,充分水洗终止反应,苏木精复染、透明、脱水,中性树脂封片。免疫组织化学法染色以背景清晰及胞浆、胞膜上出现棕黄色颗粒为CD34或b FGF阳性结果;组织细胞仅为淡淡的浅黄背景,无棕黄色颗粒为CD34或b FGF阴性结果。高倍镜下(×200)每张切片采集5个视野,计算每个视野内细胞总数及阳性细胞数, 得到阳性细胞的百分率(阳性细胞的百分率= 阳性细胞数/ 计数细胞总数×100%),取平均值。按阳性细胞数所占比例不同分为4级:无染色或阳性率< 5%为阴性(-),6%~30%为阳性(+),31%~50%为较强阳性(++),>50%为强阳性(+++)。以已知CD34或b FGF阳性切片为阳性对照,0.01 mol/L PBS代替一抗为阴性对照组。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计数资料以率表示,用 χ2检验和Fisher精确概率法,P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫组织化学法

CD34蛋白及b FGF阳性细胞的胞膜或胞质呈棕黄色,主要表达于上皮基底细胞和血管内皮细胞上,而成纤维细胞极少见其表达分布。CD34蛋白在正常口腔黏膜组织和OSF组织中的阳性表达率分别为90%(9/10) 和30%(9/30),OSF组显著低于对照组(χ2=14.697,P <0.05)(见图1);b FGF蛋白在正常口腔黏膜组织和OSF组织中的阳性表达率分别为80%(8/10)和23.3%(7/30),OSF组显著低于对照组(χ2=21.372,P <0.05)(见图2)。

2.2 OSF组织中的新生血管分布

本实验根据CD34和b FGF免疫组织化学法的阳性染色强度,评估受试者口腔黏膜组织中新生血管分布。采用CD34评价时,对照组及早、中、晚期OSF的MVD分别为42.08、20.48、17.40和14.85。采用b FGF评价时,对照组及早、中、晚期OSF的MVD分别为32.50、15.55、13.88和14.50。OSF组和对照组的MVD比较,差异有统计学意义(P =0.000)。见图3。

2.3上皮细胞层厚度

对照组上皮细胞层厚度(epithelial cell layer thickness,ET)(高倍镜下上皮细胞数)为20~37,平均32.90。OSF组平均ET值为16.10。由于OSF组ET值大致为对照组的1/2,因此可以将对照组ET值(32.90)的1/2作为上皮萎缩临界值。OSF组和对照组ET值比较,差异有统计学意义(P =0.000)。早、 中、晚期OSF的平均ET值分别为15.45、17.29和9.50。早、中、晚期OSF的ET值与对照组比较,差异

A:CD34 在正常黏膜组织中阴性表达;B:CD34 在 OSF 组织中阴;C:CD34 在正常黏膜组织中阳性表达;D:CD34 在 OSF 组织

A:b FGF 在正常黏膜组织中阴性表达;B:b FGF 在 OSF 组织中阴;C:b FGF 在正常黏膜组织中阳性表达;D:b FGF 在 OSF 组织

有统计学意义(P =0.002、0.000和0.014)。见图4。

3讨论

OSF是影响口腔黏膜的潜在慢性纤维化病变, 少数情况下也会影响咽部和食管上段[7]。随着疾病发展,上皮和黏膜纤维化导致口腔黏膜及深层组织僵硬,张口和舌活动受限,造成吃饭、吞咽、发声困难。 上皮细胞发育不良和萎缩是晚期OSF的标志。

目前,OSF血管形成机制仍然存在争论。一般认为随着OSF进展,灌注缺失,上皮萎缩导致血管减少。近期有研究表明,疾病进展期并没有明显减少血管[2]。血管不能直接计数,但是可以通过血管生成标志物间接测量。本研究采用CD34和b FGF评估OSF血管数目。

平均血管密度是微血管计数平均值,是通过显微镜观察一定区域内(3或4个视野)的血管计数得到,主要选择有血管的区域(热点)进行计数。本实验中,CD34计数所得微血管数比b FGF多,提示CD34表达是评估肿瘤血管数量的更可靠方法。以往有研究表明,CD34作为标志物比血管性假血友病因子和凝血因子Ⅷ更好[8]。方厂云等[9]研究分析OSF组织中黏膜血管分布,表明微血管增生发生在早期OSF,中期和晚期反而显著减少。本实验结果表明,MVD与不同阶段OSF相关,与对照组比较,MVD显著减少。CD34计数MVD时,早、中、晚期OSF的血管数量逐渐减少,b FGF计数也同样逐渐减少,与方厂云等[9]的研究结果一致。本研究也显示,b FGF计数MVD时,晚期OSF略高于中期,这可能是由于晚期样本量较少导致。

与之相反,DESAI等[10]采用免疫组织化学法计算MVD,发现MVD随着疾病进展而增加。RAJEN- DRAN等[2]通过图像分析也发现OSF组的MVD与对照组比较,差异无统计学意义,认为MVD增加是黏膜组织短暂性缺血、缺氧的适应性反应。DESAI等[10]采用CD34阳性细胞计数发现血管数目增加, 从而推测恶变时,血管增长在肿瘤增殖中发挥重要作用。本研究结果表明,OSF组的MVD明显低于对照组,差异有统计学意义,与DESAI等[10]的研究结果不一致。本实验结果还表明,OSF组的ET值与对照组比较,差异有统计学意义。同时,进展阶段OSF的ET值显著低于对照组,与DESAI等[10]的研究结果相似。

大多数研究中,瘤内高MVD常常和不良组织学预后相关。PAZOUKI等[11]也报道血管减少常发生在正常组织向发育异常早期癌症阶段的转变过程中。 笔者推测,OSF进展阶段血管减少导致短暂性缺血、 缺氧,而缺氧使细胞外基质增加,从而在纤维化过程中起重要作用。肾纤维化体外研究发现,缺氧能够刺激成纤维细胞增殖,促进细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)蛋白(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤连蛋白)、组织抑制因子-1 (tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1,TIMP-1)和组织抑制因子-3(tis- sue inhibitor of matrix metalloprotease-3,TIMP-3) m RNAs表达,抑制MMP-1 m RNA水平,与ECM的积累一致。TILAKRATNE等[12]注意到OSF成纤维细胞和内皮细胞中HIF-1α 表达上升,提示缺氧在OSF中具有重要意义。因此,认为基质玻璃样变和随之发生的上皮细胞缺氧会导致上皮缺血性萎缩。但与RAJENDRAN等[2]的观点不一致,推测诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)可能在OSF上皮萎缩中起作用,认为细胞缺少是由于角质细胞和基质细胞的细胞毒性和基因毒性作用。本研究证实TILAKRATNE等[12]的观点,即真皮层纤维化和血管减少伴随细胞因子活动变化,为烟草和槟榔中的致癌物质创造一个独特的环境,从而作用于上皮细胞。可以认为槟榔中致癌物长时间积累在上皮组织下,使得致癌物可以长时间作用于上皮组织而不侵入到更深层中。同时,血管减少也会减慢致癌物吸收到体循环中。

笔者谨慎地认为除基质纤维化和血管减少外, 致癌物积累也会影响已经受累的上皮细胞。上皮细胞发育异常及侵入到结缔组织,为肿瘤细胞迅速生长创造良好的微环境。血管生长因子释放导致血管生成和肿瘤细胞增殖,这也可以解释OSF恶变过程中MVD上升的机制。DESAI等[10]发现,CD34阳性基质细胞减少或缺失,尤其在OSF近上皮位置,与正常黏膜CD34阳性基质细胞均一分布不同。本实验结果显示,近上皮和基质内CD34阳性基质细胞完全缺失。但是与DESAI等[10]发现正常黏膜CD34阳性基质细胞均一分布相反,本研究未发现CD34阳性基质成纤维细胞。这可能是由于方法差异导致,包括内皮标志物敏感性。本研究结果表明,b FGF免疫反应性在成纤维细胞和早期OSF组织上皮细胞中升高,在晚期纤维化基质中b FGF表达显著降低,与BISHEN等[13]的研究结果一致。不同阶段OSF血管减少以及明显ET改变进一步证实灌注缺少可导致上皮细胞萎缩,进而引起上皮细胞发育异常。

CD34+细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集1998年8月至2008年3月门、住院血液病患者113例, 男48例、女65例、年龄16~84岁, 平均47岁, 均按国内外统一诊断标准, 选30例健康人做正常对照, 男12例、女18例, 年龄19~68岁, 平均42岁。

1.2 方法

1.2.1 方法

肝素抗凝血, 加入荧光标记单克隆抗体20ul, 避光20 min, 加溶血素10 min, 流式细胞仪上机检测, 测定阳性细胞表达百分率。

1.2.2 其他血液检测指标

按大连医科大学第二医院王永才教授主编的《最新血液骨髓细胞诊断学多媒体图谱》, 人民军医出版社, 2008。

2 结果

详见表1。

注:P<0.01;△P<0.05

2.1 CD55、CD59、CD34抗原表达率

从表1可见AA 、PNH、AA-PNH综合征患者的CD55、CD59抗原表达率, 较正常及其他血液病明显减低, CD55 (53.4%~56.8%) , CD59 (27.8%~35.5%) , 相互间有显著差异 ( P<0.01;P<0.05) ;46例AA患者中有12例 (26.1%) 患者发现粒细胞上CD55、CD59抗原表达有缺陷, 其中8例 (66.7%) 患者酸溶血试验 (Ham) 、糖水试验、罗氏试验 (Rous) 、游离血红蛋白 (P-Hb) 、结合珠蛋白 (Hb-HP) 等溶血指标阳性, 其他4例 (33.3%) 患者CD55、CD59异常表达者, 经0.9~5.6年, 上述溶血指标才呈阳性, 在AA-PNH组的患者经4.2年后, 才发现为PNH。AA患者CD34较低, 但发展成AA-PNH或PNH患者时, CD34呈明显增高 (P<0.05) , 白血病、MDS CD34异常增高, 相互间有显著差异 (P<0.01) , 其他贫血CD34虽然有不同程度差异, 但经统计学处理差异无统计学意义 (P>0.05) 。

2.2 贫血患者

Coomb’s、Hams、糖水试验、Rous、P-Hb、Hb-HP阳性反应, 58例再障 (AA) 有12例 (20.7%) CD55、CD59抗原异常率明显增高, CD34抗原增高, 网织红细胞双值 (RC) 回升或增高, 而诊断AA-PNH综合征, 因此CD55、CD59、CD34有早期检测AA患者演变AA-PNH综合征及PNH发生可靠的诊断指标。

3 讨论

血液病是常见病, 多见AA 、PNH、AA-PNH综合征、HA、MA、IDA近1/3的患者可伴全血细胞减少、ACD34.8%, LKA、MDS、脾亢、恶性肿瘤化疗、某些中毒等患者, 都有一过性或持续性全血细胞减少病理表现, 因此寻找探讨有诊断价值及鉴别诊断指标非常重要[1,2,4]。

3.1 CD55、CD59、CD34抗原表达率, 是AA、AA-PNH、PNH最敏感、最特异诊断及鉴别诊断指标。CD55、CD59、CD34抗原明显减少, 异常细胞明显增多>5%, 如CD34抗原增多时, 患者细胞膜上糖基磷脂酰肌醇GPI生成障碍, 导致GPI锚连蛋白异常, 提示PNH或AA演变AA-PNH综合征的可能, 如果CD55、CD59抗原正常, 而CD34抗原明显减低者, 是AA重要免疫表型特征;若CD55、CD59抗原正常, 但CD34抗原明显增高>3% (4.71%、49.51%) , 提示造血干细胞异常恶性增殖紊乱, 是白血病或MDS重要表现[2,3,4,5,6]。

3.2 CD55、CD59、CD34抗原异常表达并伴Hams、糖水试验、P-Hb、Hb-HP、Rous异常, 提示补体衰变因子CD55及膜反应溶解抑制因子CD59缺陷, 导致红细胞加速破坏, Hams、糖水试验、Rous阳性, P-Hb增高, Hb-HP消失, 提示血管内溶血, 幼红细胞及网织红细胞双值的异常增高, 是PNH、AA-PNH综合征重要佐证。但PNH、AA-PNH综合征本文可有33.3%患者酸溶血、糖水试验阴性, 而CD55、CD59、CD34抗原异常表达, 证明CD55、CD59、CD34抗原表达较酸溶血及其他溶血指标更敏感、更可靠、更适用[4,5,6]。

3.3 CD55、CD59、CD34抗原表达率正常, 伴Coomb’s异常, 及网织双值巨增>10%, 幼红细胞>50%, 周围血出现幼红细胞时, 多提示红细胞遭受不完全抗体破坏, 是自免贫重要特征。因该病以血管外溶血为特征, 故Rous常为阴性, P-Hb、Hb-HP仅有16.5%患者呈不同阳性反应, 但尿胆原、血清间接胆红素巨增可助诊断, 值得注意, Coomb’s必须采用促凝剂处理, 并选用IgG、IgA、IgM、C3及抗原抗体最适合浓度的改良的Coomb’s可使其检测结果较传统方法提高8~10倍[1,3,4]。

3.4 CD55、CD59、CD34抗原表达须与血象及骨髓细胞学诊断结果密切相结合意义更大, 比如恶性组织细胞病、某些急性非典型的白血病、AA、PNH、AA-PNH综合征、脾亢、某些自免贫、巨幼贫、缺铁贫以及其他慢性病贫血等多种疾病, 除了CD55、CD59、CD34有重要诊断价值外, 血象、骨髓象检查并结合其他特殊试验诊断指标, 如微核、NORAg、基因、染色体综合分析更为重要;CD55、CD59、CD34可以解决有关红细胞膜缺陷及异常克隆增殖所致全血细胞减少症的首要选择[4,5,6,7]。

摘要:目的探讨CD55、CD59、CD34抗原表达率对血液病的早期诊断及鉴别诊断价值。方法应用流式细胞仪测定血液病患者及对照粒细胞CD55、CD59、CD34抗原表达率, 找出相关性。结果AA、PNH、AA-PNH患者CD55、CD59、CD34抗原表达率较其他血液病及正常明显增高。结论粒细胞上CD55、CD59、CD34抗原异常表达率可做血液病患者早期诊断及鉴别诊断指标, 特别对AA、AA-PNH综合征、PNH有重要诊断价值。

关键词:CD55,CD59,CD34,血液病,诊断

参考文献

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CD34+细胞 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2010年1月~2014年10月收治的完全性葡萄胎66例、部分性葡萄胎52例及水肿性流产患者68例为观察组, 再选取正常早期妊娠流产10例为对照组, 孕周均为6~8周。

1.2 方法

对免疫组化采用SP法, 鼠抗人单克隆抗体P57、P53、CD34均购自丹麦DAKO公司。

1.3 结果判定标准

P57阳性定位于细胞滋养叶细胞及绒毛间质细胞核内, 呈棕黄色。阳性细胞数>30%为 (+) , 阳性细胞数<10%为 (-) 。P53阳性产物定位于细胞滋养叶细胞核, 呈棕黄色。一张切片中阳性细胞数>10%为 (+) 。CD34在血管内皮细胞阳性表达, 显示绒毛间质血管数目及管腔开放或闭塞状态。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17统计学软件对数据进行分析, 计数资料以百分数 (%) 表示, 采用x2检验。

2 结果

2.1 P57检测

66例完全性葡萄胎中, 65例P57 (-) , 部分性葡萄胎、水肿性流产及正常早期妊娠中P57均为 (+) 。

2.2 P53检测

66例完全性葡萄胎中, 64例P53表现为 (+) , 且为 (++) ~ (+++) ;52例部分性葡萄胎中, 48例为 (+) ~ (++) , 4例为 (-) ;68例水肿型流产中, 4例为 (+) , 64例为 (-) ;10例正常早期妊娠流产中, P53均呈 (-) 。

完全性葡萄胎、部分性葡萄胎与水肿性流产的P53阳性率比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;部分性葡萄胎与水肿性流产的P53阳性率比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;水肿性流产与正常早期妊娠流产的P53阳性率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。118例葡萄胎中, 112例P53 (+) , 78例非葡萄胎中74例P53 (-) , 两组P53阳性率比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.3 CD34检测

在108例葡萄胎中, 均可见绒毛间质血管消失或管腔塌陷、闭塞现象。完全性葡萄胎64例中, 闭塞血管占全部绒毛血管的90%以上;部分性葡萄胎52例中, 闭塞血管占全部绒毛血管的30%以上;68例非葡萄胎中, 几乎全部绒毛间质血管呈开放性改变。三组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。因此, CD34指标可以作为葡萄胎与水肿性流产的鉴别诊断指标。

3 讨论

完全性葡萄胎、部分性葡萄胎及水肿性流产在临床实践中的鉴别诊断已成为妇产科病理检测方面最具挑战性的领域之一。因三者临床治疗及转归差别很大, 因此准确诊断具有重要意义。虽然DNA倍体分析是目前区分完全性葡萄胎和部分性葡萄胎的金标准, 但由于其操作费时, 价格昂贵, 故尚难以推广。与之相比, 免疫组化染色方法更简便易行。对临床工作中遇到的绒毛水肿, 应首先注意观察其病例学特征性的形态改变, 如水肿绒毛有无表现为水池形成, 滋养叶细胞增生模式、程度、不典型性等方面做比较。同时应结合免疫组化P57、P53、CD34免疫组化表达, 能明显提高葡萄胎的诊断准确率。

本研究还利用CD34在血管内皮细胞中的表达, 观察绒毛间质血管情况, 发现在完全性葡萄胎中, 大部分绒毛间质血管消失, 残存血管管腔几乎全部塌陷、闭塞, 占所有绒毛血管的90%以上, 部分性葡萄胎闭塞的绒毛血管比例也在30%以上。而非葡萄胎绒毛间质血管几乎全部为开放状态。这为葡萄胎的鉴别诊断又增加了一项观察指标。

综上所述, P57、P53和CD34免疫组化检测对于葡萄胎的诊断有重要应用价值。P57 (-) , P53 (+) , CD34显示血管大部分消失或闭塞, 支持完全性葡萄胎诊断;P57 (+) , P53 (-) , CD34绒毛血管开放, 支持水肿性流产;P57 (+) 和P53 (+) , CD34可见不同程度的血管消失或闭塞, 支持部分性葡萄胎。

摘要:目的 探讨联合应用P57、P53和CD34蛋白对葡萄胎的诊断意义。方法 选选取我院2010年1月~2014年10月收治的完全性葡萄胎66例、部分性葡萄胎52例及水肿性流产患者68例为观察组, 再选取正常早期妊娠流产10例为对照组。全部进行P57、P53及CD34免疫组化检测。结果 66例完全性葡萄胎中, 65例P57 (-) , 部分性葡萄胎、水肿性流产及正常早期妊娠中P57均为 (+) 。完全性葡萄胎、部分性葡萄胎、水肿性流产及正常早期妊娠P53阳性率分别为94.5%、85.6%、15.8%及0%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。大多数完全性葡萄胎P53呈强或中等强 (+) , 水肿性流产P53仅呈弱 (+) 。CD34表达于血管内皮细胞, 在108例完全性和部分性葡萄胎中, CD34免疫组化染色显示绒毛间质血管塌陷或闭塞102例, 而在水肿性流产及正常早期妊娠流产中, 绒毛间质血管显示为开放性改变, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 P57、P53、CD34蛋白表达对葡萄胎诊断有重要价值。P57 (-) , P53强 (+) , CD31显示血管腔闭塞支持完全性葡萄胎, P57 (+) , P53 (-) , CD34显示血管腔闭塞支持部分性葡萄胎, P57 (+) , P53 (-) , CD34显示血管腔开放提示为水肿性流产。

关键词:葡萄胎,P57,P53,CD34,免疫组化,诊断意义

参考文献

[1]汪春年, 吴波, 周航波, 等.P57在完全性与部分性水泡状胎块中的表达及意义[J].诊断病理学杂志, 2009, 16 (3) :192-194.

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CD34+细胞 篇6

1 材料与方法

1.1 实验材料

人喉鳞癌TU177细胞株来源于耳鼻咽喉头颈肿瘤山西省重点实验室, 10%小牛血清 (美国GIBCO公司) 、MEM培养液 (美国GIBCO公司)

1.2 主要试剂

FITC-CD44抗体及同型对照 (美国, BD) , PE-CD133抗体及同型对照、anti-PE multisort kit、anti-FICT磁珠和LS分选柱 (德国, Miltenyi)

1.3 实验方法

1.3.1 TU177细胞系的培养及筛选

收集对数期TU177细胞, CD133-PE抗体避光孵育, 洗涤, 加抗PE磁珠混匀, 避光孵育, 过柱, 阳性收集管中为CD133+细胞标记为A, 阴性收集管中为133-细胞标记为B。将得到A组加磁珠剪切剂孵育, 洗涤, 加停止剪切剂, 得到去除磁珠的CD133+细胞标记为C。将得到的B、C组细胞和CD44磁珠孵育, C细胞过柱得到2组细胞为CD44+CD133+、CD44-CD133+, B组细胞过柱得到2组细胞为CD44+CD133-、CD44-CD133-。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞纯度

1.3.3 增殖实验

细胞计数, 调整浓度为1×105/ml, 每组细胞取100ul, 设3个复孔, 分别于第1、2、3、4、5天, 加CCK-8孵育1小时, 450nm测定吸光度值, 计算均值。

1.3.4 侵袭实验

细胞计数仪计数, 调整浓度为1×105/m L。取基质胶包被的transwell小室, 下室加含20%FBS的MEM, 上室加200u L细胞, 每组3个复孔, 培养48小时后取出小室, PBS清洗, 甲醛固定, 轻擦上室, 冰醋酸溶解, 测OD值。

1.3.5 迁移实验

同侵袭实验, 用未用基质胶包被的小室。

1.3.6 克隆形成实验

细胞计数, 稀释至300个/m L, 置35mm2培养皿中培养, 2周后PBS清洗, 甲醛固定, 结晶紫染色, 冰醋酸溶解, 测OD值。

1.3.7 细胞粘附实验

细胞计数为1×105个/m L, 基质胶包被96孔板, 每孔加入细胞液100u L, 3个复孔, 培养1、2、4h后取出, 加入CCK-8, 检测450nm波长各孔吸光值。

1.3.8 统计学方法

SPSS22.0进行统计分析。计量资料用±s来表示, 多组间比较采用方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式结果

流式结果显示分选前CD133表达率为1.5%左右, CD44表达率约为80.6%, 使用免疫磁珠分选技术对磁珠进行分选, 进行流式检测, 检测结果示CD133-CD44-细胞纯度达99.52%左右, CD133+CD44+细胞组纯度达95.17%左右, 如图1所示。

2.2 增殖实验结果

如图2所示。

2.3 迁移、侵袭、粘附、克隆实验结果

CD133+CD44+细胞迁移、侵袭、粘附、克隆数多于其它组细胞, CD133+CD44-细胞迁移、侵袭、粘附、克隆数大于CD133-CD44+细胞、CD133-CD44-细胞和TU177细胞, 组间两两比较差异具有统计学意义 (P<0.00O1) 。实验结果见表1。

3 讨论

喉鳞癌 (laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC) 源于喉黏膜上皮, 居头颈部鳞癌第2位, 约占全身恶性肿瘤6%。世界范围内喉鳞癌发病略有上升, 且年轻化趋势逐渐显现[3]。喉鳞癌目前主要治疗方式以手术为主, 辅以放疗, 但其对放化疗敏感性较差。近30年来喉鳞癌5年生存率仍未有明显提升, 患者一旦发生颈淋巴结转移, 其生存率降低一半, 是其5年内死亡的主要原因[4]。由于这些原因, 进一步阐明喉癌的发病机制及其发病的生物学原因显的越来越重要。大量研究表明, 肿瘤的发生、转移、复发和耐药等与肿瘤中的肿瘤干细胞有关。Zhou等研究认为, CD133可以作为喉癌干细胞标志物[5]。于丹[6]等认为CD44可以作为喉癌的特异性标志物。本研究中, 我们联合CD133、CD44两个干细胞表面标志物, 运用免疫磁珠分选技术对喉癌TU177细胞进行分组筛选, 进行体外增殖、侵袭、迁移、粘附等能力分析。

在细胞增殖实验中, CD133+CD44+细胞组增殖速度最快, 第3天已经达到相对80%融合度, CD133+CD44-增殖数大于TU177、CD133-CD44+、CD133-CD44-组细胞。在细胞增殖方面我们也可以得出干细胞标志物CD133要强于CD44。

许多研究者认为, 肿瘤干细胞具有较强的侵袭和转移能力。我们的研究结果表明, CD133+CD44+细胞确实具有更强的侵袭和迁移能力。通过细胞增殖实验发现CD133+44+细胞增殖能力也明显更强。粘附实验中发现, CD133+44+细胞在1小时内就可以迅速贴壁。克隆形成结果也提示, CD133+44+细胞具有更强的集落形成能力。所有这些特征都符合肿瘤干细胞的生物学特性。我们通过侵袭、迁移、粘附、克隆等实验的相互论证, 更进一步证实了CD133+CD44+亚群细胞具有干细胞特性。综上所述, CD133+CD44+细胞组具有侵袭能力强、迁移快、粘附快、克隆能力强、增殖能力强等肿瘤干细胞特点, 这两种细胞表面标志物可能作为喉肿瘤靶向治疗的靶点。但是实验中我们也发现, CD133-CD44-的细胞组也具有较弱的侵袭、迁移、克隆等能力, 所以我们相信还有其他的干细胞标志物未被我们发现。因此, 我们还需要进一步的研究、探讨。

参考文献

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CD34+细胞 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

该院共有86例肿瘤患者, 其中男44例, 女42例。年龄在35~75岁间, 平均年龄为 (42.6±3.2) 岁。以数字法随机分成观察组 (43例) 和对照组 (43例) 。其中观察组含男21例, 女22例。年龄在35~74岁间, 平均年龄为 (43.8±2.3) 岁。肿瘤分级:Ⅰ级33例, Ⅱ级7例, Ⅲ级3例。对照组含男23例, 女20例。年龄在36~75岁间, 平均年龄为 (42.4±2.7) 岁。肿瘤分级:Ⅰ级32例, Ⅱ级8例, Ⅲ级3例。

1.2 研究方法

根据肿瘤类型选择不同的化疗方案, 观察组的化疗计量增加1倍, 切化疗间隔时间延长1倍。在化疗前与化疗后均采静脉血, 流式细胞仪检测淋巴细胞亚群CD4、CD8和NK细胞表达[4]。

1.3 疗效评定

通过以下标准对疗效进行判定。“优”为一切正常, 无不适病症;“良”为能进行正常活动, 有轻微病症, “可”为勉强可以正常活动, 有些病症和体征;“差”为病症无明显好转[5]。

1.4 统计方法

以SPSS13.0软件对数据进行分析。计数数据比较以χ2检验。计量数据以t检验。

2 结果

2.1 两组疗效对比

观察组疗效为优者占比78.05% (32/41) , 优良率为90.25 (37/41) , 均显著高于对照组的56.10% (23/41) , 73.17% (30/41) 。提示观察组的化疗方案明显优于对照组, 同时化疗后T淋巴细胞亚群CD4、CD8细胞显著高于化疗前, 说明治疗后病情有所好转。差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

注:与对照组相比, *P<0.05。

2.2 治疗前后淋巴细胞亚群数量比较

肿瘤患者治疗后, CD4, CD8显著高于治疗前。NK细胞治疗前后变化不大, 具有积极意义。见表2、表3。

3 讨论

一般认为, 肿瘤患者普遍存在免疫功能低下, 免疫细胞不能有效识别, 杀灭肿瘤细胞[6]。从本世纪以来, 对于肿瘤免疫的监测, 免疫应答和免疫逃逸的细胞与分子机制有了更安全的认识, 并由此提出通过阻断肿瘤诱导的免疫抑制方法治疗肿瘤, 促进肿瘤免疫治疗的应用[7]。

该研究的实验表明, 不同的化疗方案及化疗前后, 淋巴细胞亚群的数量均有显著变化。结果1显示观察组疗效为优者占比78.05%, 优良率为90.25, 均显著高于对照组的56.10%, 73.17%, 通过表2可以发现, 观察组的CD4及CD8也明显高于对照组, 提示化疗方案的不同, 则淋巴细胞亚群有显著变化, 因此淋巴细胞亚群的检测可以有助于化疗方案的选择。这与荣守华[8]等人的报道相符, 观察组由于加倍剂量但是延长相关化疗时间, 可以明显的保护患者的免疫系统, 这可能与患者自身的免疫系统代谢与肿瘤活动情况有关, 表3提示化疗后T淋巴细胞亚群CD4、CD8显著高于化疗前, 具有重要意义, 主要提示在治疗前后, 淋巴细胞亚群有显著的变化, 有助于判断患者的病情严重程度和化疗损伤程度等等, 另外, CD4主要表达于辅助T (Th) 细胞, 是Th细胞TCR识别抗原的供受体, 与MHCⅡ类分子的非多肽区结合, 参与Th细胞TCR识别抗原的信号转导, CD8的功能也类似, 所以这两种物质的计量能够有效的反应患者体内的免疫质量, 在进行化疗之后, 这两种物质的浓度明显升高, 表示化疗之后, 患者的总体的免疫系统有所增强, 这主要与化疗杀死癌细胞, 并且减少癌细胞对免疫系统的抑制有关, 此外, 肿瘤患者化疗前T淋巴细胞亚群降低, 化疗后T淋巴细胞亚群中CD4, CD8细胞明显升高[9], NK细胞变化不明显。可能与肿瘤患者的免疫功能受抑制, 同时机体也产生针对肿瘤抗原的适应性免疫应答, 其中细胞免疫被认为是抗肿瘤免疫的主力, 在细胞水平上的免疫调节以T淋巴细胞为主, 根据是否表达CD4, CD8, NK细胞起主要作用[10]。CD4T细胞在免疫反应中扮演重要的角色, 可能参与CD8T细胞的作用。因此肿瘤免疫需要激活T淋巴细胞。同时CD4T细胞可作用作为肿瘤患者化疗后免疫检测的指标之一, 而且NK细胞在治疗中无太大的差异, 因此NK细胞呈现静止状态, 稳定的参与肿瘤免疫作用[11]。

综上所述, 肿瘤患者淋巴细胞亚群中的CD4, CD8, NK细胞检测, 对于化疗的监视非常重要, 因此在临床治疗中不同患者治疗采取相应的免疫治疗, 增强患者免疫功能。

参考文献

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CD34+细胞 篇8

关键词:缺血性脑卒中,bFGF,rhG-CSF,CD34,MAP-2,免疫荧光,激光共聚焦

脑血管病因其发病率及死亡率逐年增加而愈加引起重视, 但现有治疗方法很少对对其病理本质神经细胞的坏死有明显改善或促进作用, 神经细胞本身不可再生的特性使受损脑区的解剖结构则几乎无法恢复[1]。神经干细胞因其可分化为神经元而得到神经科学的广泛重视和研究, 但外源性神经干细胞移植存在免疫反应较大及细胞来源等诸多问题。干细胞动员剂是一种能够有效动员内源性神经干细胞产生并向损伤脑区迁移的因子, 一定程度上解决了干细胞来源和移植免疫的问题[2,3,4,5,6]。另已知碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 对神经干细胞有复杂多向的促分化作用[7]。高浓度的bFGF 有极强的促进神经干细胞分化为神经元的作用[8]。本实验正是观察应用干细胞动员剂rhG-CSF及bFGF等因素后对脑卒中鼠的脑区神经干细胞数量变化并因此促进脑功能的恢复的影响以及对神经干细胞和神经元相关特异性蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组

实验动物由佳木斯大学动物实验中心提供, Wistar雄性大鼠75只, 体重250~280g, 分为空白组5只, 对照组10只, bFGF组20只, rhG-CSF组20只, 合用组20只。

1.2 Zea-Longa法造模

取除空白组外各组60只鼠, 10%水合氯醛麻醉, 于大鼠颈前正中部切开皮肤至皮下, 充分暴露左颈总动脉及分叉部, 游离左颈总和伴行神经, 将左颈外动脉分离并结扎, 同时结扎左颈总近心端, 夹闭左颈总近分叉处, 插入栓线导入颈内动脉, 至大脑前动脉前端, 结扎颈外动脉近心端, 插入深度为16mm。接着将颈外动脉近心端结扎, 8min后抽出拴线, 恢复大脑中动脉血供, 这样既可模拟第一次再灌注。逐层缝合, 消毒切口。2~3d后实行二次线栓, 麻醉, 拆除一次缝线, 在一次颈外动脉结扎端, 再次剪口插线阻断大脑中动脉, 结扎颈外动脉的近心端, 逐层缝合。100min后抽出拴线, 即二次再灌注。

1.3 bFGF的应用

取造模3d后大鼠, 向bFGF组及混合组大鼠左侧侧脑室注入浓度为200μg/L的bFGF 8μL, 对照组向大鼠左侧侧脑室注射8μL生理盐水。空白组不做处理。

1.4 rhG-CSF的应用

将rhG-CSF用生理盐水稀释成10μg/mL。按15μg/kg·d剂量给药造模3d后, 给rhG-CSF组及联合组大鼠每天劲部皮下注射, 对照组注射等量生理盐水, 持续4~6d。进行外周血干细胞动员。空白组不做处理。

1.5 神经功能评分

采用Zealonga5级4分法评定标准:无神经系统功能缺损, 活动正常为0分;有轻微神经功能缺损, 不能完全伸展右侧前爪者为1分;中度局灶性神经功能缺损, 爬行时出现向右转圈者为2分;重度局灶性神经功能缺损, 行走时身体向右侧倾倒者为3分;极重神经功能缺损, 不能自发行走, 意识丧失者为4分。

造模后每3天对试验及对照、空白各组大鼠进行Zealonga评分, 各组分别处理后, 连续评定8周。实验数据以undefined记录, 采用方差分析检验, P<0.05为检验水准, SPSS17.0分析数据。

1.6 免疫荧光法检测各组CD34, GFAP, MAP-2抗体表达

分别于造模后5d, 10d, 15d, 20d麻醉各组实验鼠, 4%多聚甲醛固定, 左侧纹状体做10μm冰冻切片, 每次切片分为4组, 每组10张切片。PBS漂洗, 5min, 3次;4%多聚甲醛固定20min, PBS漂洗, 5min, 3次;0.5%Tritonx-100破膜15min, PBS漂洗, 5min, 3次;滴加10%BSA, 室温封闭20min, PBS漂洗5min, 1次;各组分别加入1:100兔抗大鼠CD34, MAP-2一抗, 置湿盒中, 4℃过夜;湿盒室温放置2h, PBS漂洗, 5min, 3次;加含荧光素羊抗兔二抗, 避光室温孵育1h;用激光共聚焦扫描显微镜观察免疫荧光效果并照片, 用图像处理软件分析图片。

2 结果

2.1 神经功能评分结果

空白组各时段评分均为0.00+0.00。

对以上数据结合各组不同时段神经功能评分趋势图 (表1) 可知, 对照组神经评分随时间推移神经功能改善不显著, 无统计学意义。处理2d后 (造模5d后) , 各处理组神经功能开始逐渐出现改善, 明显优于对照组, 差别有统计学意义。各组早期 (处理2周内) 随时间延长, 神经评分明显提高, 差异有统计学意义, 而rhG-CSF组使用动员剂初期改善神经功能较明显, 初期动员剂组效果优于bFGF组, 差异有统计学意义, 2周后长期改善效果不明显, 差别无统计学意义, 合用组改善效果优于其他组, 差异有统计学意义。

2.2 免疫荧光法检测抗体表达

处理早期, 联用组及rhG-CSF组CD34阳性细胞数较多, 多于bFGF组及对照组 (表2) , 差异有统计学意义, 说明此两组处理早期神经干细胞数量增加就较明显;处理10d后, 随时间延长, rhG-CSF组CD34阳性细胞数的优势不再明显, 联用组尚有少量增加, 而此时bFGF组合联用组的MAP-2阳性细胞数明显多于对照组和rhG-CSF组, 差异有统计学意义, 作用后期联用组CD34阳性细胞数及MAP-2阳性细胞数优势都比较明显, 显示了两因素的相互促进作用 (表3) 。

3 讨论

空白组神经功能评分未受到明显影响, 而对照组评分增高也说明了造模的有效性。bFGF组初期因干细胞较少且发挥作用需要时间[8], 以逐渐促进迁移来的神经干细胞转化为神经元恢复该区的结构和功能, 因此在作用7~14d时作用最为明显。而rhG-CSF组能够使血液等脑外组织中的干细胞转化为神经干细胞, 并可促使转化后的神经干细胞向脑内定向迁移, 该作用在注入后即生效, 因此在注射2~5d后改善神经功能的效应最明显, 随rhG-CSF停止使用, 改善效果减退, 说明rhG-CSF无长期持续效果。而合用组虽未产生完全的加成效应, 可能是因为两种因子发挥作用的时间差异使其作用不能完全叠加, 但二者合用仍对神经功能改善的促进作用明显优于单独使用, 证明合用对脑缺血鼠的神经功能改善有一定效果。 rhG-CSF在使用10d内明显促进CD34阳性细胞数量增加, 证明其对脑缺血区神经干细胞表达有促进作用, 且早期作用强于bFGF及对照组, 联用组早期则与rhG-CSF作用没有显著性差异; 15d后, bFGF作用达高峰, 明显促进MAP-2抗体的表达, 该抗体是神经元特异性抗体, 且通过促进也出形成及突触可塑性而恢复病灶区正常神经元结构。联用组在作用后期表现出了明显的二因素相互促进作用, 对脑缺血脑区功能及结构恢复均有较明显作用。

参考文献

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