ATP酶（精选八篇）
ATP酶 篇1
目前,关于精液冷冻保存前后ATP酶活性变化规律的研究主要集中在人、牛及鱼类等动物上,对家畜尤其是绵羊精液的研究鲜有报道[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。笔者采用酶动力学分光光度法对冷冻保存前后小尾寒羊精液、精子及精清中ATP酶活性变化规律进行研究,以期为优化绵羊精液冷冻保存技术,提高冷冻精液品质和体外受精过程中选种、配种提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
甘油、D-(+)-葡萄糖、蔗糖、青霉素、链霉素,美国sigma公司生产;柠檬酸钠、氯化钠、0.2%Triton X-100、Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L,p H值8.2)、ATP溶液,分析纯[6]。
1.2 主要仪器
高速离心机(型号为ZONKIA HC–2518),购自浙江中佳科技有限公司,紫外可见分光光度计(型号为TU-1810 PC/SPC),购自上海沪粤明科学仪器有限公司;显微镜(型号为CKX31),购自奥斯巴林(中国)有限公司。
1.3 稀释液的配制
取基础液(葡萄糖3 g,蔗糖4 g,柠檬酸钠3 g,超纯水100 m L,煮沸消毒)80 m L,加20 m L新鲜卵黄液,青霉素、链霉素各10万IU配制成保存稀释液;再取上述溶液94 m L加入甘油6 m L,配制成冷冻稀释液[1]。
1.4 精液采集与常规品质评定
选取膘情中等、体质健康、性欲旺盛的小尾寒羊种公羊,用假阴道法采集精液,立即在37℃下进行常规品质评定,要求原精液密度达到“密”级,活率在0.8以上,无异常气味,色泽乳白,用于试验。
1.5 精液冷冻保存与解冻
1.5.1 精液的稀释与平衡
精液常规检查后,将符合要求的新鲜精液根据活率和密度按3~6倍的比例,在35℃下用冷冻稀释液等温稀释,混匀,在室温下用0.25 m L的塑料细管进行分装并封口。裹8~10层纱布置于4℃冰箱中平衡2~3 h。
1.5.2 精液的冷冻与保存
将平衡好的精液细管置于自制冷冻漂浮器上(距离液氮表面2.0~2.5 cm,温度在-110~-80℃)熏蒸10 min,投入液氮保存。
1.5.3 精液的解冻
从液氮罐中取出精液细管,迅速浸入39~40℃水浴中,轻轻摇动直至融化(10~15 s)。
1.6 精子活率的评定
将稀释精液摇匀后,取中层精液10μL滴于经37℃恒温板等温预热的载玻片上,盖片后置于显微镜下放大400倍检查精子1 000个以上,分别计算呈直线运动精子数和总精子数,计算精子活率。
1.7 ATP酶活性的测定
1.7.1 ATP酶的提取
精液总ATP酶粗提液:取120μL稀释精液于离心管中,加入360μL 0.2%Triton X-100,抽提20 min,然后4 000 r/min离心30 min,保留上清液待测。
精清中ATP酶粗提液:取120μL稀释精液于离心管中,加入自制稀释液360μL 2 000 r/min离心20 min,保留上清液待测。
精子中ATP酶粗提液:将上一步所得沉淀加入0.2%Triton X-100 360μL抽提20 min,4 000 r/min离心30 min,保留上清液待测。
1.7.2 ATP酶活性的测定
取纯化水2.21 m L,ATP溶液1.10 m L,混匀后加入25℃预热的ATP酶待测液0.19 m L(空白管用纯化水代替),迅速摇匀倒入比色皿(光径为1 cm),700 nm处每隔1 min测定1次OD值,每次测5 min。
1.7.3 ATP酶活性的计算
公式为:酶活力=(测定管OD值-对照管OD值)×1/(60×取样量)×样品稀释倍数。
1.8 数据的统计与分析
采用SPSS 10.0统计软件对试验数据进行统计分析,差异显著性采用Excel软件中数据分析工具库进行描述统计、t检验和方差分析。试验重复5次以上。
2 结果与分析
结果见表1。
由表1可见,与冷冻前相比,冷冻后小尾寒羊精子中ATP酶活性极显著降低(P<0.01),精清中ATP酶活性极显著升高(P<0.01),说明冷冻保存对绵羊精子中ATP酶的活性造成了严重损伤。冷冻前后精子活率与精子ATP酶活性均呈极显著正相关(r=0.979和0.968,P<0.01),说明精子ATP酶活性能够反映精子活率,可作为精液品质评价的指标。
注:同列数据肩标字母不同表示差异极显著(P<0.01);相关系数仅表示精子活率与精子ATP酶活性的相关性,**表示极显著相关(P<0.01)。
3 讨论与结论
ATP酶存在于组织细胞及线粒体的内膜上[5],可催化ATP水解释放出大量能量,供生物体进行各种需能生命活动。精子在冷冻保存过程中经历了与冷冻剂相互作用、降温冷冻、超低温贮存和解冻复温的过程,这些过程中的物理和化学效应(p H值、渗透压的变化,冰晶的形成等)都有可能使精子受到损伤,导致ATP酶活性受到影响[6]。
本研究中,与冷冻前相比,冷冻后精清中ATP酶活性极显著升高(P<0.01),而精子中的ATP酶活性极显著降低(P<0.01),说明冷冻保存对精子结构和功能造成了损伤。这可能是因为:1)冷冻过程中冰晶的形成和细胞内外渗透压的改变导致精子膜的损伤,精子膜中的类脂蛋白从细胞结构中分离,使细胞膜原有空间构象发生改变,精细胞中的酶释放到精清中[7];2)内源性精子类脂过氧化反应能造成精子膜的严重损伤,导致细胞内容物的释放,外源性脂肪酸过氧化物亦可损伤精子膜,造成同样的细胞内酶的释放[8],这与陈田飞等[9]的研究结果一致。
本试验结果亦表明,冷冻前后精子活率与ATP酶活性具有较好的线性关系,两者均呈极显著正相关(r=0.979和0.968,P<0.01),即ATP酶活性越高,精子活率越高。说明ATP酶活性的测定可以作为绵羊精液质量评价的可靠指标。这与黄晓荣等[10]和熊承良等[11]的研究结果一致。采用酶动力学分光光度法测定ATP酶活性具有用量少、操作简单、成本低等优点,易于在基层实验室中进行应用与推广。
摘要：为了充分发挥和提高优良种公羊的利用率,提高绵羊冻融精液品质,试验采用酶动力学分光光度法对冷冻保存前后小尾寒羊精子和精清中ATP酶活性变化进行研究。结果表明:冷冻保存小尾寒羊精子中ATP酶活性(83.76±3.53)U/m L与冷冻前(175.42±4.32)U/m L相比极显著降低(P<0.01),精清中ATP酶活性(164.96±3.22)U/m L与冷冻前(73.51±2.23)U/m L相比极显著升高(P<0.01);冷冻前后精子活率与精子ATP酶活性均呈极显著正相关(r=0.979和0.968,P<0.01)。说明冻融过程对绵羊精子中ATP酶的活性造成了严重损伤。绵羊冻融精子ATP酶的活性可以在一定程度上预测精子活率,并可作为绵羊精液品质评价的重要指标。
关键词：小尾寒羊,冻融,精液冷冻,ATP酶,活性
参考文献
[1]徐振军,赵冰,魏丹,等.绒山羊精液冷冻保存技术的研究[J].中国畜牧杂志,2009,45(1):16-18.
[2]陈松林.鱼类配子和胚胎冷冻保存研究进展及前景展望[J].水产学报,2002,26(2):161-168.
[3]张轩杰.鱼类精液超低温冷冻保存研究进展[J].水产学报,1987,9(3):259-267.
[4]刘睿智,郭航,孙妍,等.冷冻保存对人精子顶体酶活性影响[J].中国实验诊断学,2004,8(6):647-648.
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[8]叶尚勉.精子的类脂过氧化反应[J].生殖与避孕,1986,6(4):3.
[9]陈田飞,吴大洋,李春峰.家蚕冷冻精液超氧化物歧化酶(SOD)活性分析[J].蚕学通讯,2004,24(4):9-14.
[10]黄晓荣,章龙珍,乔振国,等.抗冻剂对日本鳗鲡精子活力及运动时间的影响[J].海洋渔业,2007,29(3):193-199.
ATP，隐形主角 篇2
人体的动力系统就好比是一台“锅炉”，锅炉里舞蹈着的火苗其实就是一种名叫“ATP”的东西，本文将简单介绍这人体“锅炉”的工作原理和它的“燃烧工艺”。
我有一个设想，用童话故事的方式，讲述人体的供能原理。故事中最好有卖火柴的小女孩、灰姑娘和白雪公主，最好有神奇的火柴、水晶鞋和毒苹果，当然还少不了有南瓜车和七个小矮人等等。
一个枯燥无比的概念：ATP
“ATP”这个名词解释无法逾越，究竟什么是ATP呢？所谓ATP是个英文缩写，原文为adenosine-triphosphate，标准的中文名称为腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷（腺苷三磷酸），简称为ATP。
不要理睬什么英文原文或者中文名称。只知道有ATP就足够了，它只是个能量单位。
下面有一堆和ATP有关的概念，简单认识一下它们，以便于我讲述：
—ATP是人体身上能量转换和传递的关键物质，比喻为流通着的“能量货币”比较形象。它是穿行在集贸市场的“硬币”，它们的穿梭流动正像是舞蹈在锅炉里的“火苗”。只要人活着，这些舞动着的“火苗”就永不熄灭。
—ATP在人体中含量极低，总量只有大约0.1摩尔（分子的计量单位，大概是0.5克）。但它无所不在，遍及全身的每一个角落。
—人体每天消耗的能量需要水解100～150摩尔的ATP（相当于50至75公斤，接近人的体重），就好像硬币在集贸市场上反复流通一样，每天人体中的ATP要被循环使用至少1000～1500次。
—ATP不能被储存，因为ATP合成后必须在短时间内被消耗。真是“躺着也中枪”，就算是每天睡觉，ATP也在不停地循环生成、水解，然后释放能量。用过蜂窝煤的朋友们一定记得每天晚上是如何封炉子的。炉子看上去休息了，但里面的“火苗”还在发着暗红的火。生命不息，ATP不止呀。
ATP的三种供能方式
一是非乳酸能系统，典型的“无氧代谢”。一般可维持10秒爆发性的肌肉活动。短跑、举重、跳高都属于这类运动。10秒钟之后，ATP消耗殆尽，只能大口喘气恢复体力。电视上见过博尔特跑100米，见过刘翔跨栏就不难想像它的威力。工作原理略过。后果，至少20分钟后人体才能恢复正常的状态。
二是乳酸能系统，称“厌氧代谢”。一般可维持1～3分的肌肉活动。持续进行有一定强度的运动时，肌肉内的肌糖原在缺氧状态下进行酵解，释放能量供肌肉收缩之后，体内会产生一堆无法代谢的乳酸，被称为“疲劳毒素”。一个不经常锻炼的人，偶尔跑一个800米跑之后，第二天一定会出现肌肉酸痛，那多半就是“疲劳毒素”的原因。所谓“排酸跑”，就是通过适量运动的方式，将这些堆积的乳酸代谢出身体。
三是“有氧代谢”，是指在氧充足的条件下，糖原或脂肪彻底氧化分解，最终生成二氧化碳（CO2）和水（H2O），二氧化碳通过呼吸排出，水则是借助汗水流走，换来的是持续有效的运动能力。在运动开始之际，主要的能量供应为“无氧代谢”或“厌氧代谢”；随着运动持续时间的增加延长，以脂肪参加能量转换的“有氧代谢”比例逐渐地增大，而“厌氧代谢”慢慢地减少比例。运动的持续时间是增加燃烧脂肪的重要关键。记住，有氧代谢系统一旦被启动，便貌似一台永动机。你可以把自己的身体想像成一艘鼓起风帆的船，在浩瀚的汪洋中随心所欲地破浪前行。
有关ATP的几组数字
20分钟——非乳酸能系统“无氧运动”每次短暂爆发（最多10秒）后，需要至少20分钟才能恢复到正常体能状态；哪怕是强度不算太高的“厌氧代谢”乳酸能系统，最多也只能支持20分钟的运动状态，20分钟之后身体会因缺氧而无法继续运动；“有氧代谢”完全启动至少也需要身体运动过20分钟之后。如果强度控制得当，“有氧代谢”的过程中，每20分钟便可生成出大约等于身体前20分钟消耗的ATP，如此循环往复，不一而足。由此得出一个简单的结论，如果强度控制得准，让每20分钟消耗的ATP略大于新生成的，保持这样一个恒定的配速，直到42.195公里的终点，完成比赛，能量也刚好消耗殆尽。这样的配速堪称“绝配”。理论上，每个人都有这样一个“绝配”。马拉松比赛其实就是一场寻找自己最佳配速的博弈。
2:38:129—“无氧代谢”（或“厌氧代谢”）的燃料有两种，一种是人体内存量极少的高能物质磷酸肌酸，它最多几秒钟便消耗殆尽。另一种是体内存货不算多的糖原；“有氧代谢”的燃料也有两种，第一与“无氧代谢”的后者相同，是体内存货不多的糖原，第二是脂肪。为什么糖原在两种代谢方式中有不同的表现呢？看下面的数据：“无氧代谢”中，消耗一摩尔糖原，生成两摩尔的ATP。“有氧代谢”中，消耗一摩尔糖原，生成38摩尔ATP。换句话说，“无氧代谢”与“有氧代谢”能量转换的效率相差16倍，“有氧代谢”占绝对优势。更有甚者是在“有氧代谢”中，每消耗一摩尔的脂肪，能够生成高达129个ATP。了解了这一点非常重要，因为慢能让我们燃烧脂肪，而燃烧脂肪是生成ATP的最高境界。
12和36—因为在“有氧代谢”中，燃烧脂肪效率奇高，人身体内储存的脂肪在有氧运动的状态中可以为肌肉提供的能量足够跑12个以上的马拉松。证据确凿，1982年，在澳大利亚一年一度的悉尼至墨尔本的耐力长跑赛上，一位来自墨尔本61岁的农夫，以5天15时4分的成绩跑完了这场长达875公里的比赛，整个比赛他一分钟也没有睡觉，全程用他那“杨氏碎步”完成了比赛，还捧走了冠军奖杯，以提前九小时的成绩打破了赛事纪录。这个距离相当于36个马拉松。这位农夫制胜的秘籍就是一个字—慢。说慢其实也不慢。他的每公里配速是9:13（每小时6.5公里），按照这个配速跑完一个全程马拉松用时是6小时29分。厦门马拉松是七小时关门，按照这个成绩，这位农夫用他的“杨氏碎步”，可以连续36次在厦门的关门时间内完成全程马拉松。
15%—15%—65%—人体中携带着一个庞大的燃料库存，这种燃料叫“脂肪”，它几乎成了各类女士们挥之不去的烦恼。脂肪占人体重量的约15%，另有一个15%是蛋白质，蛋白质是生命的物质基础—肌肉、骨骼、内脏、大脑和血液等等。人体另外一个重要的组成部分是水分，占人体重量的约65%。相对功能效率极低的“无氧代谢”来说，“有氧代谢”占尽天时地利人和，因为人体储备有足够的脂肪，水分又可以随时补充，空气更取之不尽，用之不竭。所以，马拉松比赛的供能方式中，消耗脂肪为主的“有氧代谢”是绝对的主角。以五小时完成比赛为例，平均每半分钟消耗一摩尔的ATP。这样的耗能比，非“有氧代谢”莫属。
ATP酶 篇3
ATPase(下称ATP合酶)是参与生物体能量代谢的关键酶,并参与氧化磷酸化与光合磷酸化反应。ATP作为物质的能量“货币”,主要通过ATP合酶来催化合成。ATP合酶在自然界中广泛存在,例如在真核细胞中的线粒体、叶绿体以及细菌的细胞质膜中均有发现。ATP合酶可分为三大类,分别为储能F-型、质膜P-型和液泡V-型[1],其中F-型ATP合酶(F1FO-ATP合酶)是参与能量代谢的关键酶,它利用跨膜电化学质子梯度来驱动ATP的合成[2,3]。因此,研究ATP合酶的核及线粒体基因,从而在分子水平上探究提高动植物能量的转化率的方法,具有重要意义。同时,有报道称ATP合酶还参与植物生物和非生物胁迫的反应,这对提高植物的抗逆性同样有着重要的意义。ATP合酶合成能量的转化效率接近100%,可称之为迄今为止最小、最快、效率最高的分子转动马达[4]。
电子克隆技术(in silico cloning) 是以生物信息数据库中的EST(expressed sequence tag)、核酸序列和蛋白质等数据库为基础,选择相应的生物软件,不断对EST序列进行同源比对、聚类分析、组装拼接并延伸,来快速获得功能基因的方法[5]。目前,已有以甘蔗EST序列为基础,成功电子克隆基因的报道,但还未见成功克隆ATP合酶的报道。因此,本研究以此为契机,通过电子克隆的方法,以小麦的种子序列作为探针,成功获得一个甘蔗ATP合酶基因的cDNA序列,随后运用一系列生物软件,对该基因的编码蛋白结构和功能进行了分析和预测,这为该基因的实验室克隆和进一步研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 电子克隆获得SATPC1基因cDNA序列
以小麦(Triticum aestivum)TaATPC1基因(GeneBank登录号GU369976.1)为探针,运用NCBI中的Blast工具对甘蔗的EST数据库进行搜索下载所得到的与该基因同源性较高的甘蔗EST序列利用DNAMAN软件进行拼接、延伸,得到新探针,即拼接得到的重叠群,用新探针再次搜索EST数据库,直至没有可供拼接的新的EST序列为止。最后,将得到的序列在NCBI非冗余数据库进行比对,确认该基因为新基因。
1.2 生物信息学分析
1.2.1 编码氨基酸一级结构及疏水性/亲水性预测分析
利用在线工具ProtParam分析甘蔗新ATP合酶基因及其他植物该基因的氨基酸组成以及理化性质,并进行对比。对该基因氨基酸序列的亲水性/疏水性预测使用的软件ProtScale。
1.2.2 磷酸化位点及信号肽的预测
利用在线工具NetPhos2.0 Server和SignalP 4.0 Server分别对该蛋白质序列进行潜在磷酸化位点和信号肽预测。
1.2.3 亚细胞定位及跨膜结构域预测
利用Wolf psort在线工具对该蛋白进行亚细胞定位预测。对于SATPC1蛋白跨膜螺旋区的的预测应用的软件是Expasy软件中的TMHMM工具。
1.2.4 蛋白二级结构及保守结构域的预测和分析
通过使用GOR4软件对甘蔗ATP合酶二级结构进行预测,并利用NCBI保守结构数据库(CDD),分析该编码蛋白的保守结构域。
1.2.5 蛋白三维结构预测
利用ExPASy服务器的SWISS-MODEL工具对蛋白质的三维结构进行预测,运用Discovery studio viewerpro软件查看预测结果。
1.2.6 氨基酸同源性分析及进化树的构建
首先通过GeneBank中的Blastp程序对甘蔗ATP合酶基因编码氨基酸的同源性进行分析。运用DNAMAN软件对该基因的氨基酸序列和其它物种ATP合酶基因的氨基酸序列进行多重比对并构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 甘蔗SATPC1基因cDNA序列全长的获得
以小麦(Triticumaestivum)TaATPC1基因(GeneBank登录号GU369976.1)作为查询探针,在NCBI的甘蔗EST库中检索,得到13条与该序列同源性较高的EST序列。利用DNAMAN软件与NCBE的Blast系统对其进行反复拼接和检索,得到一个长为1 415bp 的cogtig重叠群,拼接示意图如图1。通过NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)软件预测,该序列完整的开放阅读框长为1 077bp,编码氨基酸为358个,符合kozak原则,因此,说明拼接获得的为一条完整的cDNA序列,命名为SATPC1。具体序列信息如图2所示。
2.2 甘蔗SATPC1基因编码氨基酸一级结构及疏水性/亲水性预测分
利用ProtParam在线工具对甘蔗SATPC1基因的理化性质,并同其他植物进行比对(如表1),该基因的氨基酸个数为358,分子量39 627.6Da,等电点为7.52,负电荷残基与正电荷残基个数分别为44、45,蛋白质不稳定系数为52,该蛋白的理化性质和氨基酸组成与禾本科植物水稻、玉米和高粱等的ATP合酶相似性较高,由此可见该基因拼接的正确率较高。该类蛋白的不稳定系数均大于40,可见,该类蛋白质不稳定[6]。对甘蔗SATPC1基因编码的氨基酸序列的亲水性/疏水性(如图3)预测的结果显示,SATPC1基因多肽链的第113位氨基酸表现为最高值2.044,疏水性最强;第338位氨基酸表现为最低值-2.633,亲水性最强。该蛋白的GRAVY值为-0.117,可见该蛋白质具有亲水性,推断为水溶性蛋白。
2.3 甘蔗SATPC1蛋白磷酸化位点预测甘蔗SATPC1蛋白信号肽预测
蛋白质的磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后的修饰方式。 一般来说, 多肽链中的氨基酸潜在的磷酸化位点
越多,发挥更多功能的可能性就越大。用NetPhos 2.0 Server对该蛋白质序列进行潜在磷酸化位点分析。结果显示,该蛋白具有丝氨酸磷酸化位点(Ser)11个,苏氨酸磷酸化位点(Thr)8个,酪氨酸磷酸化位点(Tyr)1个(如图4)。SignalP 4.0 Server预测甘蔗SATPC1蛋白信号肽结果如图5所示,可见具有最高的原始剪切位点分值、最高的综合剪切位点分值和最高信号肽分值的分别是,第20位的丝氨酸残基和第2位的丝氨酸残基,分值分别为为0.132、0.377和0.195。由此可推测该基因所编码的蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白。
2.4 甘蔗SATPC1蛋白亚细胞定位分析及蛋白跨膜结构域预测
根据前人研究,与该蛋白同源性较高的其他物种的ATP合酶大多定位于叶绿体上。利用Wolf psort在线工具对SATPC1进行亚细胞定位预测。预测结果显示,该蛋白定位于叶绿体上的分值为14,由此可以推测该蛋白可能定位于叶绿体上,为叶绿体ATP合酶。通过TMHMM工具预测SATPC1蛋白的跨膜结构域,结果显示如图6。可见该蛋白无跨膜螺旋区,为非膜蛋白。
2.5 甘蔗SATPC1蛋白二级结构的预测及保守结构域的分析
通过CDD对该基因编码蛋白的保守结构域分析显示,甘蔗SATPC1蛋白具有一个保守的ATP合酶家族的保守结构域(如图7),由此可见该基因的完整性,并属于ATP合酶家族。
GOR4对甘蔗SATPC1蛋白二级结构的预测显示(如图8,表2),该蛋白的二级结构中,α螺旋的比例最高为44.97%,其次为无规则卷曲44.69%,延伸链最低为10.34%。该蛋白中α螺旋和无规则卷曲为该蛋白二级结构中的主要结构元件,分散于整个蛋白质中。
2.6 甘蔗SATPC1蛋白三维结构预测
蛋白质的三维结构通过利用ExPASy服务器的SWISS-MODEL工具预测,并运用Discovery studio viewerpro软件查看预测结果,如图9所示,可知螺旋和无规则卷曲是构成甘蔗SATPC1蛋白的主要空间结构。
2.7 甘蔗SATPC1蛋白的氨基酸同源性分析及进化树的构建
对甘蔗SATPC1蛋白的氨基酸进行同源分析后,结果显示甘蔗SATPC1蛋白与来自玉米(Zea mays NP_001150872.1)、水稻(Oryza sativa Japonica Group NP_001059768.1)、短柄草(Brachypodiumdistachyon XP_003563030.1)、小麦(TriticumaestivumADC33136.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana NP_567265.1)、甜瓜(Cucumismelo subsp.Melo ADN34052.1)、大豆(Glycine max XP_003542863.1)和蓖麻(Ricinuscommunis XP_002518477.1)的ATP蛋白的同源性分别为96%、91%、88%、85%、77%、73%、72%和71%。这与甘蔗和这些物种同属于禾本科植物的传统分类是一致的,进一步证明了该基因电子克隆的准确性。然后运用DNAMAN软件进行了氨基酸序列的多重比对并构建了系统进化树(如图10、11)。 通过这些均可见甘蔗SATPC1蛋白的氨基酸序列与其他物种该类基因具有很高的同源性。证明了该基因cDNA序列电子克隆的正确性,其确实属于ATP基因家族成员。
3 讨论
电子克隆技术的产生改变了今后基因研究的策略,充分利用生物信息数据库生物软件,首先可以促进新基因的发现,其次也为基因功能的研究和蛋白质组学的研究提供了新的思路和平台[7,8]。电子克隆与传统的克隆方法相比,最显著的优势在于节省时间和经费,能够起到事半功倍的效果。目前,电子克隆技术应用在玉米、烟草、葡萄和甜瓜等作物上的先例已有报道,并在甘蔗上的应用也已经有成功的先例[9,10,11,12,13,14]。但是EST数据库中的EST数据的精确度有限[15],所以电子克隆所获得的序列的准确度与真实序列是有差距的,因此,仍要通过实验室克隆验证。目前,有关甘蔗ATP合酶基因的克隆及功能研究报道甚少,本文对该基因研究的目的就在于为其今后的实验室克隆及相关研究奠定了基础。
4 结论
本文以生物信息学为基础运用电子克隆的方法,拼接出一条甘蔗的ATP合酶基因的cDNA序列全长,并应用分子生物学相关软件,预测出此基因编码蛋白具有一个保守的ATP合酶家族的保守结构域,具有20个磷酸化位点,为非分泌蛋白、非膜蛋白,亚细胞定位分析显示该蛋白可能定位于叶绿体上,该蛋白的二级结构中的主要结构元件为α螺旋和无规则卷曲,其分散于整个蛋白质中。通过与玉米、小麦、水稻、短柄草等禾本科植物进行氨基酸同源比对发现,甘蔗SATPC1蛋白与这些作物的ATP合酶均具有较高的同源性。这为该基因的实验室克隆提供了理论依据。
摘要：目的:运用电子克隆的方法获得甘蔗中的ATP合酶基因。方法:以小麦中一个ATP合酶基因为种子序列,对甘蔗的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行聚类分析、拼接组装和延长。结果:获得一个ATP合酶基因SATPC1的cDNA序列全长,该序列长1 415bp,包含一个完整的1 077bp的ORF,编码358个氨基酸,且与水稻、玉米、高粱和葡萄等其他植物的ATP合酶具有高度的同源性。结论:电子克隆获得的cDNA序列为完整的甘蔗ATP合酶基因全长cDNA。
上海,大师杯后迎来ATP1000 篇4
回首：和球迷一起成长
1999年12月9日，网球大师杯赛诞生。作为男子职业网球巡回赛的总决赛，网球大师杯赛是网坛最高级别的赛事。从每年的1月1日起，男子职业选手从四大满贯赛、九大大师系列赛和个人成绩最好的五站ATP巡回赛上获取积分，到每年最后一场ATP巡回赛结束后的周一为止，在“ATP冠军排行榜”中位列前7名的选手有资格进入网球大师杯赛，第8个名额则留给排名前20并且是当年的四大满贯赛冠军之一的选手。因此，大师杯赛是真正的风云际会，代表了当今网坛最高水准的较量。
大师杯总决赛在世界各大城市轮流举行，2002年第一次来到上海，然后2005年至2008年连续4年停留在上海这个充满时尚活力的城市，成为它的一部分，掀起一阵阵网球热潮。
2008年对于上海的网坛至关重要。首先，在今年1月份，过去几年负责运作上海网球大师杯的上海新新体育文化有限公司，和负责F1中国大奖赛的上海国际赛车场经营发展有限公司，合并为上海久事国际赛事管理有限公司，统一运作F1中国大奖赛和网球大师杯这两项顶级赛事；其次，2008年是网球大师杯赛在上海的最后一年，因此这一站“告别演出”更显得异常珍贵。ATP职业球员们为取得来上海的一张“入场券”奋力拼搏于网坛各大赛事，球迷们则热血沸腾地等待着最终“杀入”上海的大师们带来一场精彩纷呈的赛事。
展望：从大师杯到ATP1000
来自美国的Charles是最早将网球大赛引入上海的发起者之一，他的中文名字叫施成伟，“是同事起的”，他笑称。他在上海已经工作了10年，现任上海久事国际赛事管理有限公司国际区域业务总监。这个处世方式已非常中国化的美国人，在他位于黄浦江畔的办公室接受了我们的采访，和我们分享他关于网球大师杯赛、网球大师系列赛的感知与积累。
Charles透露，从2009年开始，上海将成为顶级网球赛事——大师系列赛永久性的一站，因为大师系列赛的积分等级达1000分，所以上海的这项赛事也被称为“亚洲1000”，这是仅次于4大网球公开赛(积分等级为2000)的ATP最重要的赛事之一。届时，全球最顶尖的64位单打选手和32对双打选手将来到上海参赛，赛事规模和总奖金将超过现在的大师杯。
谈起将于2 0 0 9年开始的“亚洲1000”， Charles总是会抑制不住地兴奋：“比起大师杯，我们届时会有更强大的网球选手阵容。说实话，每年的大师杯都很精彩，但因为都是最顶尖的选手，所以互相之间胜负都不是令人意外的事，而‘亚洲1000’将充满悬念！”
上海成为永久性的“亚洲1000”赛事举办地，其道路并不平坦。2002年，为配合中国申办2010年上海世博会，上海参考德国申办汉诺威世博会的经验，一举拿下了ATP年终总决赛——大师杯的举办权。“接下来我们一直联系ATP，想拿下一站永久性的大师系列赛，但因为种种原因并未成功。”
2005年，大师杯年终总决赛又回到上海，而且一签就是“3+2”的合同。但这些毕竟都是租借合同，“我们要向ATP支付价格不菲的申办费和租金，而且赛场内的所有广告、电视转播等等收入，全部属于ATP官方所有，而我们能得到的只有门票和一些外围广告收入。”
2005年，大师杯年终总决赛又回到上海，而且一签就是“3+2”的合同。但这些毕竟都是租借合同，“我们要向ATP支付价格不菲的申办费和租金，而且赛场内的所有广告、电视转播等等收入全部属于ATP官方所有，而我们能得到的只有门票和一些外围广告收入。”
2007年，恰逢ATP改革赛制，上海最终以放弃2009年大师杯优先举办权为代价，获得从2009年起的永久性大师系列赛举办权，这是全球8站ATP大师系列赛的唯一一个亚洲站点。“那会是完全不一样的赛事！商业权益更多、经营的资源更多、收益增加的可能性也更大！”Charles说。
这两个赛事的成本结构将发生很大变化，“亚洲1000”虽然看起来规模扩大，但实际成本反而会降低。Charles表示，因为大师杯是租借的赛事，上海通过申请来举办，不仅商业权力受限制，而且申办成本也很高。明年开始，久事赛事公司将运营拥有自主产权的大师系列赛“亚洲1000”，比起大师杯，“亚洲1000”显然拥有更多经营优势。“从经营角度来说，成为‘亚洲1000’，支付给ATP一笔费用之后，就拥有了‘亚洲1000’的产权。所有的经营、门票费用，以及全部的电视转播权和场地广告经营权，都将全部归属上海举办方。”
回味：比赛的优雅气质
在久事赛事公司的办公楼里，随处可见显著的F1和网球大师杯标志，Charles的办公室在6楼，从落地玻璃可以看见窗外波光粼粼的黄浦江，“大师杯在上海是最后一届，但是这个‘最后’毫不令人沮丧，因为从2009年开始，大师系列赛落户上海，上海完全有能力、也有需要承办比大师杯规模更大的比赛。”
“ 最初进入上海， 1 9 9 7 年，IMG(国际管理集团)曾经举办过一次上海网球公开赛，那时候观众只有寥寥1000人；而到了2007年，上海大师杯的观众已超10万人次。1000球迷经几何级发展到10万人，只用了10年时间，你能相信吗？只有上海才会发生这样的奇迹！”说到几年来上海网球大师杯的变化，Charles接连用了“fantastic”、“unbelievable”这类表达强烈语气的单词。
的确，根据统计资料显示，1997年的《上海市网球运动发展情况调研报告》记载，每周至少打1到2次网球的人口不到2万人；到了2007年，猛增到50万人以上。1997年，上海的网球场不足200个；2007年，上海已经有超过2000个网球场，甚至新建的小区都会把网球场作为标准配置纳入规划。
由于网球是一项将优雅与力量完美结合的运动，它对于上海来说，本身就是一个非常难得的拓展城市影响力的契机。比如说，名不见经传的法国小城罗兰加洛斯，就因为它每年举办法网，所以其在国际上拥有极大知名度，对于城市的经济发展，有着许多积极效应。“当初很多城市都争相希望成为举办地。但是上海，毫无疑问是最适合的，上海和网球的气质太相近了——动静皆宜！”Charles说。
根据目前ATP的冠军排名和相关积分，纳达尔、费德勒、德约科维奇和穆雷这4位已经拿到入场券，铁定出席2008上海大师杯；剩余4张入场券不出意外的话，将在俄罗斯达维登科、美国球星罗迪克、西班牙费雷尔、阿根廷德尔波特罗、瑞士瓦林卡、美国布雷克这6位选手中产生。
ATP酶 篇5
1 材料和方法
1.1 材料
选择昆明种小白鼠60只作为实验对象,雌雄不拘,体重18～22g,随机分为高、中、低3个染毒剂量组和1个对照组,每组15只。所有小鼠在同一室内环境下由专门管理人员进行饲养。
1.2 方法
1.2.1 实验仪器及试剂
95%乙醇(济宁化工试剂厂,染毒时配制成浓度为40%乙醇),722分光光度计(上海第三分析仪器厂),低温冰箱(美国FormaScientific),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、过氧化物歧化酶(SOD)测试盒、三磷酸腺苷(ATP)酶测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒,均为南京建成生物工程研究所产品。
1.2.2 染毒剂量的确定及染毒方式
应用霍恩法,确立小鼠经口40%乙醇染毒的LD50为3000mg/kg,取该量的1/5、1/10、1/20即600、300、150mg/kg作为高、中、低3个染毒剂量组的每日染毒剂量。小鼠在实验环境中适应5d后进行染毒,染毒量为0.1ml/只,每日染毒1次,连续3次,以灌胃方式染毒。对照组用相同量的蒸馏水灌胃。
1.2.3 标本采集及脂质过氧化指标、ATP酶活力的测定
处死小鼠,在冰台上迅速取出肝脏,称重加入9倍于肝组织块重量、质量分数为0.86%的生理盐水,在匀浆管中充分研碎,将匀浆液以3500r/min(离心半径=20cm)离心10～15min,上清液即质量分数为10%g肝组织匀浆,取2ml存于-80℃冰箱中待测。用考马斯亮蓝蛋白测定试剂测定肝组织中蛋白含量,MDA含量及SOD、GSH-Px活力的测定方法为化学比色法,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Ms2+-ATP酶的测定方法为定磷比色法。
1.2.4 统计学处理
应用SPSS 11.5统计软件进行方差分析。
2 结果
2.1 小鼠染毒后的一般情况
染毒组小鼠在染毒后出现精神委靡、食欲减少、活动减少症状,无动物死亡。对照组小鼠无明显变化。
2.2 各组中脂质过氧化指标的变化
各组小鼠染毒后肝组织中MDA浓度,SOD、GSH-Px活力在总体上差异具有统计学意义(P<0.01)。各染毒组肝组织MDA含量均显著高于对照组,SOD、GSH-Px活力均显著低于低于对照组(P<0.05,P<0.01)。见表1。
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
2.3 各组ATP酶活力变化
各组小鼠染毒后肝组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力在总体上差异具有统计学意义(P<0.01)。高、中剂量染毒组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力显著低于对照组(P<0.05,P<0.01),低剂量组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力也低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。△每小时每毫克蛋白的ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的数量称为1个ATP活力单位。
3 讨论
脂质过氧化是指在不饱和脂肪酸中发生的一系列自由基反应,与某些疾病的发生发展及衰老等有很大关系[1]。当环境中的物理因素或外源化学物质直接或间接诱导产生的大量自由基超过了机体的清除能力,或内源性自由基产生和清除失去平衡时,就会使机体处于氧化应激状态,进而造成机体的损害[2]。MDA是重要的脂质过氧化产物之一,测定MDA的量可以反映机体内脂质过氧化反应的程度,间接反映出细胞损伤的程度[3]。正常机体存在着完善的抗氧化系统,主要有SOD、GSH-Px,这些抗氧化酶可以消除自由基,阻断脂质过氧化,保护细胞膜结构与功能的完整性,使细胞免受损伤。ATP酶存在于组织细胞及细胞器膜上,是生物膜上的一种蛋白质,它在物质的运送、能量转换以及信息传递等方面具有重要作用。
本次研究结果显示,各染毒组小鼠肝脏MDA含量显著升高,同时GSH-Px、SOD活力降低,表明乙醇染毒小鼠,使肝组织代谢过程中产生了过多的自由基,破坏了肝组织自身防御系统,使其抗氧化能力下降。同时本研究还发现,乙醇染毒后,高、中染毒剂量组小鼠肝脏组织中的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明显低于对照组,提示乙醇可抑制肝脏组织中ATP酶的活力。低剂量组ATP酶活力与对照组比较,差异无统计学意义,表明在此剂量下不致造成肝脏ATP酶活力的变化。值得注意的是,在此染毒剂量下,肝脏脂质过氧化指标已经发生了明显异常,说明脂质过氧化增强可能早于ATP酶的变化;而ATP酶活力的异常是否与脂质过氧化增强有关,尚待进一步研究。可见,乙醇在体内代谢过程中,产生氧应激产物,激活磷脂酶及脂质过氧化反应,抑制SOD、GSH-PX、ATP酶活力,进而对肝脏造成损伤。乙醇对肝组织中脂质过氧化及ATP酶活力影响的确切机制尚有待进一步研究。
摘要：目的探讨乙醇对小鼠肝组织脂质过氧化和ATP酶活力的影响及意义。方法将60只小鼠随机分为高、中、低3个染毒剂量组和1个对照组。3个染毒剂量组分别以不同剂量经口染毒3 d后,对各组肝组织进行过氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、丙二醛(MDA)含量以及Na+-K+-ATP酶活力、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的测定。结果与对照组比较,乙醇染毒组小鼠肝组织中SOD、GSH-Px活力明显下降、MDA浓度显著增高,差异均有统计学意义(P<0.01);与对照组比较,高、中剂量染毒组ATP酶活力呈显著下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论乙醇所致对小鼠肝组织脂质过氧化增强和ATP酶活力的下降,可能是乙醇导致肝功能损伤的机制之一。
关键词：肝脏,脂质过氧化,ATP酶
参考文献
[1]张桥.卫生毒理学基础.2版.北京:人民卫生出版社,1999:58.
[2]王心如.毒理学基础.4版.北京:人民卫生出版社,2004:62-67.
ATP酶 篇6
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
2, 6二甲苯胺噻嗪, 由东北农业大学动物医学学院外科教研室提供;考马斯亮蓝蛋白含量测定试剂盒、ATP酶测定试剂盒, 由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 试验动物及分组
Wistar大鼠32只 (购自哈尔滨医科大学动物实验中心) , 雌雄不限, 体重为190~280 g, 随机分为4组, 即对照组、麻醉组、恢复Ⅰ组和 恢复Ⅱ组。对照组腹腔注射给予生理盐水10 mL/kg, 5 min后断头取材;其他3组均腹腔注射2, 6二甲苯胺噻嗪50 mg/kg (用前稀释成10 mg/mL, 与对照组等容) , 其中麻醉组在大鼠翻正反射消失后立刻断头取材, 恢复Ⅰ组在大鼠翻正反射恢复后断头取材, 恢复Ⅱ组在大鼠完全苏醒后断头取材。
1.3 样本处理
大鼠断头后, 在低温操作箱内生理盐水冰面上取脑, 迅速分离双侧大脑皮质、丘脑及海马, 立即用液氮冷冻。将不同脑区的脑组织称重后, 分别置于预冷的0.32 mol/L蔗糖缓冲液介质中匀浆, 按差速离心法 (differential centrifugation) 制备不同脑区粗突触体。首先以1 000 r/min离心10 min, 收集上清液, 沉淀用预冷的蔗糖缓冲液混悬后再按上述方法离心;收集上清液, 合并2次上清液;然后再以17 000 r/min离心55 min, 弃去上清液, 即获粗制突触体[2];再用相同的蔗糖缓冲液将粗制的突触体调成2 g/L的混悬液, 用以检测Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性。以上所有操作均在0~4 ℃条件下进行。
1.4 检测指标
采用比色法测定Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性, 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。酶活力以每小时每毫克蛋白组织中ATP产生的1 μmol无机磷的量为1个ATP酶活力单位。
1.5 统计学分析
试验数据以undefined表示, 采用SPSS 11.5统计软件进行方差分析, 组间比较采用LSD法, 应用Microsoft Excel 2003对试验数据作图。
2 结果与分析
2.1 行为学变化
大鼠腹腔注射2, 6二甲苯胺噻嗪50 mg/kg后, 部分大鼠在4~6 min出现过度兴奋、躁动不安、反应强烈等现象, 稍后大鼠的动作行为变得迟缓, 精神沉郁, 不愿走动, 对周围刺激不再敏感。翻正反射消失的平均时间为 (10.80±3.75 ) min, 此段时间大鼠出现呼吸、心跳减慢, 倦怠, 嗜睡, 小便失禁等现象。从翻正反射消失到翻正反射恢复的时间为 (36.52±4.35) min, 此时给予轻微刺激, 大鼠能自主恢复正常体位, 尝试爬行。
2.2 2, 6二甲苯胺噻嗪对大鼠大脑皮质、丘脑和海马Na+-K+-ATP酶活性的影响 (结果见表1和图1)
注:与对照组比较, 同列数据肩标*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。
由表1和图1可知, 大鼠腹腔注射2, 6二甲苯胺噻嗪50 mg/kg后, 麻醉组大鼠的大脑皮质、丘脑的Na+-K+-ATP酶活性与对照组比较分别降低了48.3% (P<0.01) 和40.3% (P<0.05) , 海马的Na+-K+-ATP酶活性较对照组降低了28.8% (P>0.05) 。恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组大鼠的Na+-K+-ATP酶活性逐步恢复, 与对照组相比无明显差异 (P>0.05) , 且Na+-K+-ATP酶活性的动态变化趋势与大鼠行为学表现基本一致。
2.3 2, 6二甲苯胺噻嗪对大鼠大脑皮质、丘脑和海马Ca2+-ATP酶活性的影响 (结果见表2和图2)
注:与对照组比较, 同列数据肩标*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。
由表2和图2可知, 与对照组比较, 麻醉组大鼠的大脑皮质、丘脑和海马的Ca2+-ATP酶活性分别降低了52.9%、31.0%和29.2% (P<0.01) 。而恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组大鼠的Ca2+-ATP酶活性逐步恢复, 与对照组相比无明显差异 (P>0.05) , 这与大鼠行为学表现基本一致。
3 讨论
大脑皮质具有调控意识和感觉的作用[3], 而海马最突出的功能是控制情绪的发生和表现, 其功能受阻会表现中枢抑制精神症状[4]。丘脑作为感觉传入通路中重要的中继站, 在感觉传入、痛觉调控及意识维持上也有相当重要作用。另外, 丘脑内非特异性丘脑核团、丘脑皮质纤维及网状丘脑纤维构成了上行网状激活系统 (ARAS) 的形态学基础, 该系统是维持大脑皮质觉醒状态的功能系统, 它与上行网抑制系统 (ARIS) 的动态平衡以及二者与大脑皮质的相互影响决定意识的各个水平[5]。因此, 本试验选择了大脑皮质、丘脑和海马作为研究的脑区。
Na+-K+-ATP酶在维持神经组织兴奋所需的细胞内外离子梯度、恢复去极化神经的复极化、调整神经的兴奋性以及调整突触的相互联系等方面起着重要作用。此外, Na+-K+-ATP酶还可通过Na+/Ca2+交换来调节细胞内Ca2+浓度, 控制神经递质的释放, 从而控制神经细胞之间及神经细胞与肌肉或腺体细胞之间的兴奋传递[6]。因此, Na+-K+-ATP酶活性的降低必然影响突触的电化学传递。细胞内Ca2+是调节细胞功能的重要因子, 而质膜上的Ca2+-ATP酶对维持Ca2+浓度的稳定起着十分重要作用。 以往研究发现, 吸入麻醉药发挥作用可能是通过与酶蛋白的结合[7]、直接抑制酶活性[8]或作用于脂质和蛋白质相互作用的表面来影响酶的活性。而且Ca2+-ATP酶活性的变化导致了细胞内Ca2+浓度的变化, 从而影响神经细胞动作电位的传导, 产生一定的中枢效应。
参考文献
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[3]张志龙, 李彦东, 张来柱, 等.氯胺酮对大鼠大脑皮层和丘脑突触体Na+-K+-ATP酶活性的影响[J].济宁医学院学报, 2001, 24 (4) :12-13.
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ATP酶 篇7
1 材料与方法
1.1 动物选择及分组 健康雄性Wistar大鼠21只, 体重200 g~250 g (山西医科大学动物实验中心提供) , 随机分为假手术组 (N组) , 缺血再灌注组 (IR组, 于术前30 min给予等量生理盐水腹腔注射) 、二氮嗪干预组 (DZ组, 于术前30 min给予二氮嗪5 mg/kg腹腔注射) , 每组7只。
1.2 主要试剂及仪器 二氮嗪 (diazoxide) 购自Sigma公司。超微量ATP酶试剂盒、考马斯亮蓝蛋白含量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。普通试剂由山西医科大学实验中心提供。722分光光度计。
1.3 方法
1.3.1 大鼠局灶性脑缺血再灌注模型 各组均参照Longa [2]线拴法, 稍作改良, 建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。大鼠造模前禁食12 h, 不禁水, 室温条件下称重, 术前给予10%水合氯醛腹腔麻醉。结扎颈外动脉、颈总动脉近心端, 微小动脉夹夹闭颈内动脉, 用眼科剪在颈总动脉分叉下方剪一切口, 将预先制备好的圆头尼龙线插入颈内动脉, 缓慢推进线栓, 遇阻力停止, 插入深度17 mm~18 mm, 遇阻力即可通过。缺血1 h后将线栓拉出10 mm左右, 使其后退出大脑中动脉主干, 通过脑底动脉环开通实现再灌注, 再灌注24 h将大鼠颈椎脱臼处死。假手术组大鼠麻醉后, 线拴仅插入颈内动脉10 mm, 其余步骤同缺血再灌注组。造模手术过程中用白炽灯照射大鼠, 使体温保持在37 ℃左右。待动物苏醒评估神经功能后放回笼中, 自由饮食。
1.3.2 神经功能缺失体征评分 参考Longa等[2]的5级4分法标准。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻度局灶性神经功能缺损, 即提尾不能伸展左侧前爪; 2分:中度局灶性神经功能缺损, 即行走向左侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损:即行走困难, 并向左侧倾倒;4分:不能自发行走, 意识水平下降。造模成功的判定标准:以大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪, 站立不稳, 提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。0分、4分者均剔除, 再随机补充。
1.4 病理标本制备 各组随机取一只大鼠在缺血1 h再灌注24 h后, 断头取脑, 迅速固定脑组织, 然后石蜡包埋。由视交叉开始向后做冠状切片, HE染色, 观察海马区脑组织形态学的变化。
1.5 脑组织匀浆制备及ATPase活性测定 取大鼠右侧脑组织用冰冷生理盐水漂洗, 除去血液, 滤纸拭干, 称重, 按1∶9加入生理盐水, 由玻璃匀浆器制备成10%脑组织匀浆, 研磨过程在冰浴中进行。取制备好的10%脑组织匀浆用低温离心机以2 000 r/min离心10 min, 再取上清液以10 000 r/min离心15 min, 沉淀物为线粒体。按照说明书将提取的线粒体制成悬液。线粒体破碎后, 低速离心2 000 r/min离心10 min, 留取上清进行线粒体蛋白含量、ATPase活性的测定。操作过程按照试剂盒说明书严格执行。
1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件分析。数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 光镜下HE染色结果
N组海马区神经元细胞形态结构正常, 核仁明显呈圆形或椭圆形, 胞浆丰富;IR组海马区神经元细胞损伤坏死明显, 结构不清, 核仁不清, 核周间隙增大, 出现不同程度的水肿;DZ组海马区神经元细胞损伤程度较轻, 核仁清晰, 胞体轻度水肿。
2.2 脑组织ATPase活性变化
与N组比较, IR组Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性明显降低 (P<0.05) ;DZ组Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均较IR组有不同程度的提高 (P<0.05) 。详见表1。
3 讨 论
ATP酶是存在于组织细胞及细胞器 (如线粒体) 等生物膜上的一种逆化学梯度转运离子的蛋白酶, 其中Na+-K+-ATPase, Ca2+-Mg2+-ATPase与神经系统关系密切, 对维持神经细胞的形态、离子浓度平衡及膜兴奋性传导等方面发挥十分重要的作用, 其活性可以表示神经细胞质膜功能的状态[3]。存在于线粒体内膜上的Na+-K+-ATPase, Ca2+-Mg2+-ATPase对维持线粒体膜内、外H2O、Na+、Ca2+离子平衡起重要作用。脑缺血缺氧时, 细胞能量代谢障碍, 线粒体合成ATP受阻, 依赖于ATP的离子泵Na+-K+-ATPase活性降低, 使得线粒体发生肿胀, Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低使得线粒体内Ca2+蓄积。线粒体内超负荷的Ca2+与无机磷酸根结合成钙盐沉积, 使呼吸链功能受损, 三磷腺苷进一步减少, 使胞内Na+、Ca2+排出障碍, 形成恶性循环, 加速细胞死亡[4]。
ATP敏感性钾通道 (mitoK-ATP) 是一种内向整流钾通道, 其活性受细胞内ATP浓度调节。K-ATP通道根据其分布的部位不同分为细胞膜K-ATP通道 (sK-ATP) 和线粒体内膜K-ATP (mitoK-ATP) 通道。当组织缺血缺氧引起ATP浓度下降时, 该通道被激活, 导致细胞膜超极化、线粒体内膜去极化, 从而降低了由于缺血缺氧引起的神经元兴奋性, 保持细胞内离子稳态。除ATP等代谢因素外, K-ATP通道还可被K-ATP通道开放剂激活。二氮嗪是一种线粒体膜K-ATP通道开放剂, 它对mitoK-ATP通道的敏感性是 sK-ATP通道的2 000倍[5]。在多种动物模型上已经证实, 二氮嗪通过开放mito K-ATP通道提高了神经元的缺血耐受并在大脑缺血时发挥保护作用。Shimizuk等[6]报道二氮嗪能改善脑缺血再灌注后神经功能并减小脑梗死面积。二氮嗪的神经保护作用被认为可能类似于缺血预处理产生的作用, 但具体机制仍不清楚。有研究表明二氮嗪通过开放mitoK-ATP通道维持线粒体膜电位发挥作用, 阻止线粒体转换孔的开放[7], 阻止线粒体释放细胞色素C[8]。Garlid等[9]认为二氮嗪保护作用可能是因为允许K+内流入线粒体基质, 导致基质体积膨胀, 加强线粒体新陈代谢促进ATP的生成和利用。Domoki等[10]在对缺血再灌注小猪模型研究表明, 二氮嗪可以减少海马椎体细胞线粒体内Ca2+的沉积发挥脑保护的作用。
本实验研究表明, Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase在局灶性脑缺血再灌注损伤后明显下降, 在缺血前0.5 h给予二氮嗪干预后ATP酶的活性较IR组有不同程度的恢复, 说明二氮嗪预处理可以提高Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性, 维持线粒体内离子的平衡分布, 稳定线粒体膜的膜电位, 减轻线粒体水肿、防止线粒体内钙超载, 稳定基质体积而发挥脑保护作用。
摘要：目的 探讨线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脑组织线粒体ATP酶活性的影响。方法 采用改良线栓法建立大鼠局灶性大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。将21只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组 (N组) 、缺血再灌注组 (IR组) 、二氮嗪干预组 (DZ组) 。缺血1 h再灌注24 h后留取标本, 测定脑组织线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的变化。结果 与假手术组比较, 缺血再灌注组Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显降低 (P<0.05) ;二氮嗪干预组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均较缺血再灌注组有不同程度的提高 (P<0.05) 。结论 二氮嗪预处理能通过提高脑组织线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性, 减轻脑缺血再灌注损伤, 保护神经元线粒体的功能, 有效维持大脑能量代谢, 发挥脑保护作用。
关键词：二氮嗪,缺血再灌注,Na+-K+-ATP酶,Ca2+-Mg2+-ATP酶
参考文献
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ATP酶 篇8
克氏双锯鱼( Amphiprion clarkii) 俗名双带小丑,隶属雀鲷科、双锯鱼属,是重要的热带海水观赏鱼之一,也是典型的珊瑚礁鱼类。环境因子对克氏双锯鱼个体生长发育的影响已有一些研究,例如温度对克氏双锯鱼仔鱼生长和生理的影响[13,14],光周期和光照强度对克氏双锯鱼仔鱼生长的影响[15],以及盐度对克氏双锯鱼仔鱼活力和仔稚鱼培育效果的影响,结果表明克氏双锯鱼仔鱼在较低盐度生长较快,在中盐度成活率较高[16]。而目前,克氏双锯鱼幼鱼的盐度适应能力以及盐度适应机制的研究方面仅见于盐度胁迫对克氏双锯鱼幼鱼过氧化氢酶的影响[17],其他双锯鱼也仅见盐度变化对黑双锯鱼( A. melanopus) 幼鱼一些生理生化指标影响的研究[4,18]。文章采用实验生态学的方法,研究了急性盐度变化下克氏双锯鱼血清皮质醇浓度和NKA活性96 h的变化规律,以期深入了解克氏双锯鱼幼鱼对盐度的适应能力和调节机制,为其养殖时水体的盐度调节提供一些理论依据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
实验所用克氏双锯鱼幼鱼为中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心人工繁育,全长为( 16. 36 ± 1. 58) cm,体质量为( 22. 74 ± 3. 41) g。挑选体色和活力正常的健康幼鱼用于实验。实验前暂养2 d,暂养用水为自然沙滤海水,盐度35,水温( 28 ± 0. 5) ℃ ,p H 8. 0 ~8. 2,连续充气,每日换水2 次,换水量为100% ,投喂虾糜,每日投喂2 次。
1. 2 实验设计与方法
以当地自然海水盐度35 为对照组,将暂养的克氏双锯鱼随机分为5 组,分别放入盐度为35、30、25、20 和15 的容积为500 L的塑料桶中,每组设3 个平行,每个实验桶放克氏双锯鱼幼鱼48 尾。实验用水采用自然沙滤海水和经充分曝气的自来水调节至所需的盐度,每天换水1 次。实验期间水温( 28 ± 0. 5) ℃ ,p H 8. 0 ~ 8. 2,连续充气。
各盐度处理组分别第0、第6、第12、第24、第48 和第96 小时时进行取样,实验鱼用MS-222( 200 mg·L- 1) 麻醉,以降低或尽量避免因捕捞引起的应激反应。每个实验桶各随机选取3 尾幼鱼,置于冰盘内解剖,取其鳃丝和肝脏,用生理盐水冲洗干净,用滤纸吸去组织表面的水分并称质量。然后称适量组织,用9 倍生理盐水研磨,将研磨液4 ℃ 、4 000 r·min- 1离心10 min,取上清,置于4 ℃ 冰箱备测。蛋白含量和NKA活性分别采用蛋白含量测定试剂盒( 武汉谷歌生物科技有限公司出品) 和超微量NKA酶测试盒( 南京建成生物工程研究所出品) 进行测定,测定方法按说明书进行。
用1 m L经肝素钠润洗、烘干的一次性无菌注射器于臀鳍下方尾静脉或尾动脉抽血,采用5 号针头,取血后置于1. 5 m L带刻度EP管,4 ℃ 静置,开始分层后离心( 8 000r·min- 1) 20 min,取血清。血清皮质醇浓度利用Cortisol EIA Kit试剂盒进行测定( Cayman公司出品) ,按其说明书进行操作。
1. 3 数据分析
实验数据通过SPSS 19. 0 统计软件进行统计分析,先对数据作单因素方差分析( ANOVA) ,处理组间若有显著差异,再用Duncan法进行多重比较,P < 0. 05 为差异显著。
2 结果与分析
2. 1 对幼鱼行为及成活率的影响
在各盐度处理组中,随着盐度的降低,克氏双锯鱼幼鱼最初表现出一些应激行为,如活动加剧,鳃盖煽动频率加快,摄食量减少等,经6 h适应后基本恢复正常。盐度20 和15 处理组的个体有些还出现腹鳍基部充血、背鳍颜色变淡现象,但整个实验过程中未发现死亡现象,所以盐度35 突变至盐度15 对克氏双锯鱼成活率没有影响。
2. 2 对血清皮质醇质量浓度的影响
各低盐度处理组血清皮质醇质量浓度均在处理的12 h内呈先降后升趋势,与对照组差异显著( P < 0. 05) ,第24小时继续缓慢上升,仅盐度20 和15 处理组与对照组差异显著( P < 0. 05) ,于第48 小时达到最大值后急剧降低至对照组水平,与对照组无显著差异( P > 0. 05) ,处理后第96小时各盐度处理组皮质醇质量浓度略低于对照组,与对照组无显著差异( P > 0. 05) ( 图1 - a) 。整体来看,血清皮质醇质量浓度最低和最高分别出现在盐度15 处理组的第6 和第24 小时处,均与对照组差异显著( P < 0. 05) ,且血清皮质醇质量浓度的升降幅度均与盐度变化幅度呈正相关,即盐度降低幅度越大,血清皮质醇上升或下降幅度越大。
2. 3 对鳃丝NKA活性影响
各低盐度处理组鳃丝NKA活性均在处理的24 h内呈上升趋势,尤其在处理后的6 h内上升迅速,与对照组差异显著( P < 0. 05) ,处理后第48 小时各处理组NKA活性迅速下降,盐度20 和15 处理组与对照组差异显著( P < 0. 05) ,于第96 小时缓慢下降至略低于对照组,与对照组无显著差异( P > 0. 05) ( 图1 - b) 。整体来看,鳃丝NKA活性最低和最高分别出现在盐度15 处理组的第96 和第24 小时。鳃丝NKA活性变化幅度亦与盐度降低幅度呈正相关。
2. 4 对肝脏NKA活性影响
各盐度处理个体肝脏NKA与该酶在鳃丝中的酶活性变化规律呈现高度的一致性,即6 h内急剧上升,与对照组差异显著( P < 0. 05) ,均匀上升至第24 小时,于第48 小时迅速下降,与处理后24 h处类似,同样仅在盐度20 和15 处理组与对照组差异显著( P < 0. 05) ,第96 小时缓慢下降至略低于对照组,且与对照组无显著差异( P > 0. 05) ( 图1 -c) 。整体水平上,与鳃丝中类似,肝脏中NKA活性最低和最高分别出现在盐度15 处理组的第96 和第24 小时,且酶活性升降幅度亦与盐度降低幅度呈正相关。不同的是,肝脏中NKA活性水平较鳃丝中相差一个数量级。
3 讨论
3. 1 盐度对克氏双锯鱼NKA活性影响
DEANE等[19]和LIN等[20]认为,海水硬骨鱼类NKA酶活性随盐度的变化可分为“高渗环境高NKA活性”和“低渗环境高NKA活性”2 种类型。“高渗环境高NKA活性”鱼类有黑双锯鱼[18]、 赤鲷( Pagrus pagrus )[21]、 大黄鱼( Pseudosciaena crocea)[22]和斑尾复虎鱼( Synechogobius ommaturus)[23]等。而“低渗环境高NKA活性”鱼类有条石鲷( Oplegnathus fasciatus)[24]、鲻( Mugil cephalus)[25]和大底鳉( Fundulus grandis)[26]。该实验中克氏双锯鱼幼鱼鳃丝和肝脏NKA活性在盐度从35 突变至15、20 和25 时总体呈先上升后恢复的变化,在低盐应激的最初阶段( 6 h内) ,鳃丝NKA活性迅速增强,继续上升至第24 小时达峰值,之后酶活性骤降,于第48 小时与对照组处于同一水平,第96 小时稳定后略低于对照组,说明克氏双锯鱼经低盐应激后经历了应激反应期和主动适应期。应激反应期为被动应急阶段,幼鱼受盐度变化刺激,NKA活性被动激活升高,以增强对新环境盐度的适应能力,盐度降低幅度越大NKA活性增幅越大,在这个阶段表现出“低渗环境高NKA活性”; 在主动适应期,机体NKA活性向盐度变化前的状态逐步恢复,在第96 小时稳定后NKA活性随着盐度降低而下降,表现出“高渗环境高NKA活性”。鱼类在适应环境盐度变化的过程中会消耗大量能量,渗透调节酶类NKA等活性增强,而用于生长的能量减少,稳定后低盐度组克氏双锯鱼幼鱼NKA活性低于高盐度组,表明适应较低盐度环境后,有更多的能量可用于生长,支持先前研究中克氏双锯鱼仔鱼在较低盐度生长较快的结论[16]。
盐度变化后NKA活性稳定的时间因品种而异,如施氏鲟( Acipenser schrenekii) 的NKA活性达到稳定需要4 d[3],褐牙鲆( Paralichthys olivaceus) 幼鱼达到稳定需9 d[27],鲻鱼肠和鳃丝NKA活性则在实验第20 天才恢复[25],斜带石斑鱼( Epinephelus coioides) 鳃丝NKA能在第6 小时达稳定水平[4],大黄鱼鳃丝NKA活性当盐度突降至21 时,于第24小时趋于稳定,但当盐度突降至17 和13 时,酶活性升高后不能恢复[22]。说明种类间渗透调节能力的差异。该实验中,克氏双锯鱼幼鱼在低盐应激下NKA活性6 h内活化并在96 h内恢复至接近原始的稳定水平,表明其对盐度变化具有较强的渗透调节能力。
目前,关于不同盐度下鱼类适应高渗或低渗环境能力的研究主要集中在鳃丝、肾脏、肠道等组织上,而已有研究表明盐度对鱼类肝脏中NKA活性也有影响,如条石鲷幼鱼低盐胁迫下肝脏中NKA活性甚至高于肾脏,表明在鱼类肝脏中NKA也有较高的活性,这可能与肝脏中存在丰富的线粒体有关[24]。冯平等[28]对不同环境盐度下青鳉( Oryzias latipes) 肠内NKA的 α 和 β 基因表达量进行检测,发现盐度升高抑制青鳉肠内NKAβ 基因的表达,表明盐度对鱼类肠道的NKA也产生影响。而盐度对花鳗鲡( Anguilla marmorata) 幼鳗和太平洋双色鳗鲡( A. bicolor pacifica) 幼鳗的鳃丝NKA活性有显著影响,但对肾脏中NKA活性影响不显著[29]。该研究中急性低盐胁迫下,肝脏中NKA活性变化规律与鳃丝中大体一致,只是酶活水平较鳃丝中低了一个数量级,证实了鱼类鳃部为渗透调节和盐度适应的主要功能性组织的结论。
3. 2 盐度对克氏双锯鱼血清皮质醇的影响
皮质醇等应激激素由下丘脑-垂体-肾上腺轴( HPI) 体系促肾上腺皮质激素释放而合成与释放[30]。鱼类在环境压力作用下,该体系被激活导致皮质醇等应激激素的生成,进而影响机体的离子渗透及新陈代谢以维持机体的生理平衡[31]。作为与鳃泌氯细胞数量及NKA活性密切相关的重要激素,皮质醇的含量增加促使鳃泌氯细胞增生、分化以及NKA活性的增强,从而对硬骨鱼类调节及维持渗透压平衡有着重要作用[9,32]。该实验结果表明,在低盐胁迫过程中,克氏双锯鱼幼鱼血清皮质醇浓度呈先升后降的趋势,于处理的第48 小时降至最初水平,即恢复至正常的激素水平,表明了该鱼对盐度突变有一段适应期,时间约为48 h。克氏双锯鱼幼鱼在盐度35 突变至15、20 和25,24 h内血清皮质醇浓度均达到最大值,且其增加幅度随盐度突变幅度增加而增大,说明盐度波动幅度越大对克氏双锯鱼幼鱼的渗透应激越强。血清皮质醇浓度的急剧升高有助于增强NKA和H+-ATP酶活性,提供低盐胁迫过程所需能量,提高对低盐度环境的适应能力[33]。而盐度从35 突变至30,血清皮质醇浓度无显著增加,说明该盐度变化幅度对克氏双锯鱼没有造成应激反应。克氏双锯鱼幼鱼在盐度35 突变至低盐时,血清皮质醇浓度峰值先于各组织的NKA活性,且先于各组织的NKA活性下降达到最初水平,证实NKA活性受控于皮质醇激素。
不同鱼类在低盐胁迫时血清皮质醇浓度峰值出现和恢复时间存在较大差异,该实验结果表明,克氏双锯鱼幼鱼在盐度35 突变15、20 和25 时峰值出现时间为第24 小时,恢复至最初水平时间为第48 小时。而黑双锯鱼在盐度35突变至17. 5 时血清皮质醇浓度在第24 小时达到峰值后下降,但第48 小时还没降至最初水平[18]。鲻幼鱼从盐度35急剧降至盐度15 和25,第30 分钟时皮质醇浓度显著上升,第60 分钟时回复正常水平[1]。军曹鱼( Rachycentron canadum) 稚鱼从盐度37 的自然海水中直接转移至盐度15 时,第0. 5 小时皮质醇浓度达峰值,第1 小时降低至最初水平,而突变至25 时,第1 小时达到峰值,第12 小时才恢复至最初水平[34]。而赤鲷皮质醇浓度在半咸水( 盐度12) 和海水( 盐度39) 中均无显著差异,但鳃丝NKA活性在海水中显著高于半咸水中[21]。这些差异表明鱼类盐度适应机制是一个十分复杂的过程,不同种类的鱼有着不同的适应机制,需要进行更深入的研究。