d-柠檬烯诱导白血病细胞凋亡的机制研究

d-柠檬烯是体内甲羟戊酸通路中的一个单萜成分, 见图1, 常见于传统药物的挥发油中[1]。d-柠檬烯有广泛的预防肿瘤作用, 包括有乳腺癌、皮肤癌、肝癌、肺癌和胃癌等[2~5]。近来发现d-柠檬烯还有对乳腺癌和胰腺癌的治疗作用[6~9], 其抗乳腺癌的作用目前正在一期临床试验中[10]。虽然有课题组合成了大量的d-柠檬烯衍生物, 增强了其对白血病和前列腺癌的抗肿瘤活性[11], 但对d-柠檬烯的抗白血病机制研究报道较少。本文以HL-60细胞为工具, 研究了d-柠檬烯抗肿瘤增值作用和凋亡诱导机制。

1 材料

1.1 药物

d-柠檬烯, 由沈阳药科大学董金华教授提取并惠赠, 纯度99.2%。

1.2 试剂

单抗PARP (批号:70282560, Cell Signaling公司) , 单抗Caspase-8 (批号70892639, Cell Signaling公司) , 单抗Caspase-3 (批号70392463, Cell Signaling公司) , 单抗Bid (批号08028361, Santa Cruz公司) , 单抗β-actin (批号07118352, Santa Cruz公司) , N-乙酰半胱氨酸 (NAC, Sigma公司) , 过氧化氢酶 (CAT, Sigma公司) , 2’, 7’-二氯荧光素乙二酯 (DCFH-DA, Sigma公司) , 丫啶橙 (AO, Sigma公司) , 溴化乙啶 (EB, Sigma公司) 。

1.3 细胞株

人类急性髓细胞性白血病细胞株HL-60由广州军区广州总医院医学实验科惠赠。细胞接种在含有10%胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS) 、100U/m L青霉素、100U/m L链霉素、0.2%Na HCO3的RPMI-1640培养液中, 在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养。

1.4 仪器

DMLS2型徕卡正置荧光显微镜 (德国莱卡公司) ;流式细胞仪 (Becton Dickinson) ;Mini电泳仪 (Bio-Rad) 。

2 方法

2.1 细胞生长抑制活性测定

化合物对白血病细胞的生长抑制作用通过细胞直接计数测得。取对数生长期细 (1×105/m L) 接种于12孔板, 每孔2m L。加入不同浓度d-柠檬烯孵育72h后, 用血球计数板分别计数对照孔和加药孔的细胞数。利用下列公式求得细胞生长抑制率:1- (加药孔细胞数/对照孔细胞数) ×100%, 并计算半数生长抑制浓度 (GI50) 。在d-柠檬烯孵育24h后[12], 细胞存活率通过台盼蓝排斥实验检测。

2.2 凋亡的检测

利用丫啶橙 (AO) 和溴化乙啶 (EB) 双染法考察凋亡细胞的形态学变化。取对数生长期细胞, 以每孔1×105个/m L的细胞密度接种于12孔板中, 每孔2m L。药物处理后, 取1m L细胞悬液, 离心, 弃去上清液, 重悬于25μL PBS中, 然后加入AO/EB等体积混合液3μL (100μg/m LAO, 100μg/m L EB) , 混匀。取20μl混合液点于洁净载玻片上, 用盖玻片封片, 在荧光显微镜下观察并拍照。EB拒染并出现核皱缩、发芽、发泡以及凋亡小体的细胞被认为是凋亡细胞。在镜下不同区域随机选择300个细胞, 凋亡细胞占其百分比为细胞凋亡率。

细胞 (106个) 经药物处理相应时间后, 离心收集, 经70%酒精固定过夜后收集样品, 在1mg/m L的RNase溶液中37℃孵育30分钟后, 加入相应体积的PI试剂至终浓度为50μg/m L。样品DNA含量利用流式细胞仪 (Becton Dickinson) 检测, PI激发波长为488nm, 吸收波长为625nm, 定量计数10000个细胞, 数据采用CELLQuest软件进行分析处理。

2.3 细胞内过氧化氢 (H2O2) 水平检测

细胞内的过氧化氢 (H2O2) 含量可以利用其特异性荧光探针DCFH-DA进行检测[13]。对数生长期细胞 (1×105cells/m L) 中加入DCFH-DA至终浓度为5μmol/L, 在37℃、5%CO2培养箱中孵育1h后, 加入受试药物处理指定时间。收集各组细胞, PBS润洗两次图2 d-柠檬烯的细胞生长抑制作用和细胞毒性后经流式细胞仪检测其荧光强度 (激发波长为495nm, 吸收波长为525nm) 。将100μmol/LH2O2处理细胞1h作为实验阳性对照组。

2.4 线粒体膜电位检测

线粒体膜电位的变化可以通过具有膜通透性的阳离子染料Rh123进行检测, 线粒体对其摄取量与线粒体膜电位成正比。细胞 (106个) 经PBS润洗后, 加入Rh123至终浓度为0.2μg/m L, 在室温避光孵育20分钟[13]。细胞样品经PBS润洗后经流式细胞仪检测其荧光强度 (激发波长为495nm, 吸收波长为535nm) 。

2.5 蛋白免疫印迹技术

细胞内的蛋白样品 (50μg蛋白) 通过RIPA裂解缓冲液 (50mmol/L Tris盐酸, 150mmol/L氯化钠, 0.1%十二烷基硫酸钠 (S D S) , 1%N P-4 0, 0.5%脱氧胆酸钠, 1mmol/L PMSF, 100μmol/L leupeptin和2μg/m L a p r o t i n i n, P H 8.0) 裂解得到。Bradford方法定量蛋白后, 利用非连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳将裂解得到的蛋白样品进行分离, 再通过电转移装置将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用0.2%的丽春红对膜染色以确定各孔道的蛋白是否等量上样并是否成功转移至膜上。5%的脱脂奶粉对膜封闭后, 在4℃对硝酸纤维素膜孵育待测蛋白的特异性抗体, 过夜。滤膜加入免疫印迹化学发光试剂 (ECL kit, Amersham Biosciences) 后, 蛋白条带可经X光片 (放射自显影片) 感光记录下来[14]。

3 结果

3.1 d-柠檬烯的生长抑制作用和细胞毒性

A.d-柠檬烯的细胞生长抑制作用如图2所示浓度的d-柠檬烯处理HL-60细胞, 3天后用台盼蓝排斥实验方法检测细胞浓度。B.d-柠檬烯的细胞毒性作用如图2所示浓度的d-柠檬烯处理HL-60细胞, 1天后用台盼蓝排斥实验方法检测坏死细胞浓度。结果表示为:均值±标准差 (三次独立实验) 。

处理HL-60细胞1-3天d-柠檬烯呈现出剂量依赖的生长抑制作用, 如图2-A, 半数生长抑制浓度 (GI50) 值为86.7μM。用胎盘篮排染实验检测了不同浓度的d-柠檬烯处理HL-60细胞24h后的细胞毒性情况。其半数细胞坏死浓度值为 (IC50) 值为131.4μM, 如图2-B。实验结果证明d-柠檬烯既有抑制肿瘤细胞生长的作用又有杀伤肿瘤细胞的作用。

3.2 d-柠檬烯的凋亡诱导作用

分别用100, 120和140μM的d-柠檬烯处理HL-60细胞6, 12和24小时, 用AO/EB双染, 荧光显微镜观察的方法检凋亡。如图3-A和3-B所示, d-柠檬烯诱导的HL-60细胞凋亡呈现时间和剂量的依赖性。化合物d-柠檬烯对HL-60细胞的凋亡诱导活性可经PI染色后, 通过流式细胞术进一步得以确证。如图3-C所示, 用120μM的d-柠檬烯处理HL-60细胞12小时, sub-G1峰的比例是34.9%。

A.时间和剂量依赖的凋亡诱导作用如图所示浓度的d-柠檬烯处理HL-60细胞, 再如图所示的时间点用AO/EB双染法检测凋亡细胞的数量。B.凋亡细胞的形态学变化d-柠檬烯120μM处理HL-60细胞12小时后用AO/EB双染荧光法考察。C.SubG1峰的凋亡检测d-柠檬烯120μM处理HL-60细胞12小时后用流式细胞仪检测Sub-G1峰的比例。

3.3 d-柠檬烯诱导细胞内活性氧蓄积并使线粒体膜电位下降

d-柠檬烯120μM处理HL-60细胞8h, 如图4-A所示, 细胞内ROS的含量增加了36.3%。同条件下检测MMP (线粒体膜电位) 的变化情况, 如图4-C, 线粒体膜电位下降了33.6%。NAC (N-乙酰半胱氨酸) 预处理HL-60细胞可以阻断d-柠檬烯诱导的ROS蓄积, 如图4-B, 细胞内ROS的含量降回到9.1%。如图4-D所示, 同样条件下, 预处理NAC对d-柠檬烯的线粒体膜电位的下降作用几乎无影响。

A.ROS蓄积d-柠檬烯1 2 0μM处理HL-60细胞8小时后用流式细胞仪检测细胞内ROS含量。B.NAC对d-柠檬烯诱导ROS蓄积的阻断作用用10m M的NAC预处理HL-60细胞4小时后继续用120μMd-柠檬烯处理HL-60细胞8小时。C.线粒体膜电位下降d-柠檬烯120μM处理HL-60细胞8小时后用流式细胞仪检测线粒体膜电位下降情况。D.NAC对d-柠檬烯诱导MMP下降的阻断作用用10m M的NAC预处理HL-60细胞4小时后继续用120μMd-柠檬烯处理HL-60细胞8小时。

3.4 N A C不能阻断d-柠檬烯诱导的凋亡

NAC预处理HL-60细胞后, 再分别用100μM, 120μM和140μM的d-柠檬烯处理HL-60细胞12小时, 用AO/EB双染法考察凋亡细胞的形态学变化。结果如图5-A所示, NAC不能阻断d-柠檬烯诱导的凋亡。NAC对d-柠檬烯的凋亡诱导活性可经PI染色后, 通过流式细胞术进一步得以确证。如图5-B所示, NAC不能阻断d-柠檬烯诱导的Sub-G1峰的增加。

A.凋亡细胞的形态学检测用10m M的NAC预处理HL-60细胞4小时后继续用不同浓度的d-柠檬烯处理HL-60细胞12小时后用AO/EB双染法检测凋亡细胞的数量。结果表示为:均值±标准差 (三次独立实验) B.Sub-G1峰的凋亡检测用10m M的NAC预处理HL-60细胞4小时后继续用120μM的d-柠檬烯处理HL-60细胞12小时后用流式细胞仪检测Sub-G1峰的比例。

3.5 d-柠檬烯可以活化C a s p a s e-3和Caspa se-8

本文用电泳的方法分别考察了d-柠檬烯处理HL-60细胞后Caspase-3, Caspase-8, Bid和PARP蛋白的改变情况, 结果表明PARP蛋白被断裂, 同时Caspase-3, Caspase-8前体以及Bid蛋白都有活化裂解。分别用100, 120和140μM的d-柠檬烯处理HL-60细胞12小时后用电泳方法检测对应的蛋白。

4 结语

d-柠檬烯是单萜类化合物, 常见于药食同源的植物挥发油中, 在动物实验中表现出抗肿瘤活性[1,15]。但其现在还很少用于人类肿瘤的治疗[15], 原因之一是相对于当前的治疗药物, d-柠檬烯的细胞毒性作用较弱。如果能够寻找到对d-柠檬烯敏感的肿瘤细胞类型或其作用靶点, 加之它相对于传统细胞毒类化疗药物的安全性较好的优势, 其临床应用前景将非常看好。因d-柠檬烯在体外对HL-60细胞既有生长抑制作用又有凋亡诱导活性, 证明其有被开发成抗白血病药物的潜质。

本研究结果发现, d-柠檬烯对HL-60细胞既有生长抑制作用又有诱导HL-60细胞凋亡的作用。在d-柠檬烯引起的凋亡发生机制中, d-柠檬烯可以引起HL-60细胞内ROS的蓄积并降低MMP, 抗氧化剂NAC只能阻断d-柠檬烯诱导的ROS蓄积, 但不能改变d-柠檬烯引起的线粒体膜电位的下降。此结果表明, d-柠檬烯诱导的凋亡机制与As2O3和阿霉素不同[13], ROS的蓄积在d-柠檬烯诱导的凋亡过程中并不起主要作用。MMP的下降可能由于Caspase-8的活化继而引起的T-Bid蛋白的活化[16]。本实验中d-柠檬烯处理HL-60细胞后, Caspase-8蛋白和Bid蛋白的都有活化。此结果表明d-柠檬烯引起的Caspase-8的活化继而引起的MMP的下降, 主要是通过Bid蛋白的活化来实现的。近期的实验研究表明, 几个天然化合物是通过激活死亡受体DR4或DR5来活化caspase-8蛋白的[17], 而且柠檬草中的挥发油就是通过活化DR4继而活化caspase-8蛋白的[18], 但本实验并没有发现d-柠檬烯可以引起DR4和DR5的改变 (结果欠奉) 。至于d-柠檬烯是如何引起的MMP下降, 有待进一步研究。

摘要：探讨传统中药中挥发油成分d-柠檬烯在HL-60细胞株中的抗肿瘤作用机制。体外细胞培养、凋亡检测、流式细胞术和蛋白免疫印迹等分子生物学技术进行机制研究。d-柠檬烯可以抑制HL-60细胞增值的同时可以诱导HL-60细胞的凋亡。d-柠檬烯可引起细胞内活性氧 (ROS) 的蓄积、线粒体膜电位 (MMP) 的下降和Caspase-8活化。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 可以阻断d-柠檬烯诱导的细胞内活性氧 (ROS) 的蓄积, 但不能阻断线粒体膜电位 (MMP) 的下降和Caspase-8活化。d-柠檬烯诱导的HL-60细胞凋亡机制是通过活性氧非依赖的Caspase-8活化来实现的。

关键词：d-柠檬烯,Caspase-8活化,白血病,凋亡

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