第一篇：核酸提取方法有哪些
核酸的提取
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为： 裂解细胞
去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。
沉淀核酸
纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质
(一)DNA提取的经典方法
DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿(1：1)、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。
说明：
回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。 沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。
70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或 8
RNA的提取
RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。 蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。 1.提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备
塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。
玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。
DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37℃浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。
所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
严格来说，所有溶液均应用0.1轕C于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。
2.RNA提取中RNase污染的控制
最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。 实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。 RN A提取方法
下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。
异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。
RNase虽可耐受多种处理，(如煮沸)而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙醇(破坏RNase蛋白质中的二硫键)等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA分子。
因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。
200µl血清(浆)
↓
加入200µl 20%PEG6000
↓
4oC，3小时，12000rpm，4℃离心15分钟
↓
弃上清，加500µl裂解液(含异硫氰酸胍、-β巯基乙醇等)，混匀
↓
加50µl NaAc，500µl饱和酚：氯仿：异戊醇(50：49：1)，充分混匀，冰浴10分钟
↓
4℃12000rpm，离心5分钟
↓
小心吸取上层水相移至一新离心管中，避免吸取两相之间的蛋白质，用氯仿-异戊醇再抽提
一次 ↓
加2.5倍体积无水乙醇，冰浴30-60分钟
↓
4℃12000rpm，离心10分钟
↓
弃上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65℃烘干
↓
用10µl DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin
↓ -20℃保存备用
(三)核酸提取的其他方法(简单介绍): 胍盐提取结合二氧化硅吸附法
二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。
2.TRIzol试剂提取RNA方法：
TRIzol试剂盒是由GIBCO BRI公司推出的产品，其操作方法简单方便，一小时内即可完成。用TRIzol试剂裂解细胞，再加入氯仿，离心后可见三层，上层为透明的水相含有RNA，中间层含DNA，下层为红色的有机相，含蛋白质。 3.旋转离心柱提取
旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，属于硅吸附方法的一种，市场上的离心柱虽各有特色，但在原理上通常可分为三个部分： 利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。
把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时被甩出柱子。 把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。
此法也可用于DNA测序前核酸的纯化，又叫过柱纯化。
旋转离心柱技术具有广泛的发展前景，该产品可应用于生物学、遗传学、免疫学、考古学、法医学等各方面的基因分析。
聚合酶链反应
应用聚合酶链反应(PCR)技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。
经典的核酸提取方法通常是加去污剂(SDS等)裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。
由于样本的处理及保存对DNA和RNA(尤其是RNA)的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。
临床常见的标本有血清(浆)、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。 临床标本的处理
血清(浆)标本 一些病原体，如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等的PCR检测常采用血清或血浆标本。
HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选 择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。
HCV：检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用, 且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快(2小时内)分离血清 进行检测，或-20oC保存。 全血标本
通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。 抗凝剂：一般使用EDTA-Na
2、枸橼酸纳，不使用肝素。
前处理：
1)加适量的红细胞裂解液(破膜液)，裂解全血中的红细胞。
2)再加适量的细胞核裂液(破核液)，裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释放出来。 3)然后再加SDS(十二烷基硫酸钠)等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。
SDS可与蛋白 质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过 程中必须除去。
痰标本
痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。 具体方法：
用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml，
↓
加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30分钟左右液化
↓
取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室温放10分钟
↓
12000 rpm，离心15分钟
↓ 弃上清，加无菌生理盐水1 ml ，混匀，12000rpm离心5分钟
↓
弃上清，沉淀物用于 DNA提取
棉拭子
用PCR方法检测性病病原体时(衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等)，临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。 具体方法：
加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm ，离心5分钟
用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物(由医护人员采集)，置无菌试管或EP管内 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟 具体方法：
加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm ，离心5分钟
↓
用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物(由医护人员采集)，置无菌试管或EP管内
↓
弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟
↓
同上，重复洗涤一次
↓
弃上清，沉淀即可用于DNA提取
5.体液
体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心，取沉淀物提取核酸。 血性胸腹水，可使用红细胞裂解液处理：
加等体积红细胞裂解液，震荡混匀，置5-10分钟
↓
10000rpm，离心5分钟，弃上清
↓
可根据情况重复2-3次，沉淀物用于DNA提取
6.脓液
粘稠脓液：同痰标本处理，先用4%NaOH液化，再离心取沉淀提取DNA。 水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后用于DNA提取。
7.组织
组织有新鲜组织和石蜡切片。 新鲜组织的处理步骤：
先用生理盐水洗二次，然后将其捣碎或剪碎(用眼科剪)，加蛋白酶K消化后提取核酸
石蜡切片用于核酸提取，需先用二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后进行DNA提取。
标本的保存
血清(浆)
HBV：分离出的血清(浆)如不立即提取核酸，保存于-20℃待检。 HCV：尽快分离血清(浆), 如不立即提取RNA， 保存于-20℃待检。
长期保存：吸取200µl血清，加20u RNasin(RNA酶抑制剂)，保存于-70℃。 已发出结果报告的标本应及时转移至冰箱保存，并由专人负责管理，保存1-2周(时间长短根据报告单上的承诺而定)。
全血标本
全血标本如用于DNA提取，可4℃下短期保存(数天)，时间长易降解，如用于RNA检测，应在取血后尽快提取RNA。 最好将DNA或RNA提取后，置-70℃保存。
痰
液化的痰标本如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。
处理后的棉拭子、体液、脓液如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。
组织
新鲜组织最好保存于50%乙醇中，具体方法：先用生理盐水将组织洗一次，切成小块，加入适量生理盐水，然后边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。
总而言之，标本的保存及适当的预处理对核酸模板的成功提取具有决定性作用。要强调的是，所有用于上述处理的容器如试管或离心管，均应在使用前压灭菌。
第二篇：实验二 植物核酸的提取-教案
授课教师 学生人数 55 课 题 实验二 植物基因组DNA的提取 授课类型 新授课 授课方法 讲授、演示 教学目的 掌握CTAB法提取植物基因组DNA的原理与方法 教学重点 理解每一步实验操作的目的 教学难点 实验操作过程中的一些注意事项 教学过程
一、 背景知识
1.DNA在细胞中存在的位臵?植物细胞DNA存在的位臵和动物细胞有何不同?(图) 教学用具 多媒体
2.DNA的存在形式
双螺旋结构图
双螺旋结构组成
染色体是怎样形成的?
一级结构(核小体=双螺旋+组蛋白)-二级结构(螺线管)-三级结构(超螺线管)-四级结构(染色体)
真核生物基因组DNA是经过四级包装形成了染色体，先是DNA形成双螺旋结构，再与组蛋白形成核小体(一级结构)，压缩7倍，再形成螺旋管(二级结构)，压缩6倍，之后再形成超螺旋管(三级结构)，压缩40倍，最后超螺旋管压缩形成染色体(四级结构)，再压缩5倍，正常细胞中基因组DNA是以染色质(相当于一级结构)形式存在，在细胞分裂的中期以染色体形式存在，真核生物细胞质DNA主要是以裸露的环状DNA形式存在，没有核小体结构。
3.遗传物质核酸除了DNA外还有另外一种，即RNA，它与DNA在结构上的区别?(图)
RNA基本单位中间的五碳糖是核糖，含氮碱基尿嘧啶(U)替代 胸腺嘧啶(T) 4.核酸的理化性质
(1)形状：DNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品呈白色粉末或结晶。
(2)溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、异丙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。 (3)保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。
二、实验目的
1.掌握CTAB法提取植物基因组DNA的原理 2.CTAB法提取植物基因组DNA的实验方法
三、实验原理
1.核酸在细胞中的存在方式，
是以核酸-蛋白质复合物的形式存在，如一级结构核小体(图)：DNA螺旋+组蛋白
2.通过低温研钵破坏植物细胞壁
3.加入CTAB溶解细胞膜，CTAB与核酸形成核酸-CTAB复合物，使核酸与蛋白质分离。
4.加入高盐溶液溶解核酸-CTAB复合物，加入蛋白质变性剂使蛋白质变性沉淀出来，离心除去蛋白质。 5.加入核酸沉淀剂，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出来，离心得到核酸沉淀。
四、实验仪器 1.水浴锅
2.离心机(12管)：3台 3.研钵：10个
4.移液枪(包括枪头)：1ml、400ul
五、实验材料与药品
实验材料：新鲜菠菜叶片 1.十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)
作用：溶解细胞膜并与核酸结合，便于分离核酸。 商品信息：瓶装/100g。
理化性质：白色或浅黄色结晶体至粉末状，有刺激气味，易溶于异丙醇，可溶于水,震荡时产生大量泡沫，化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。有吸湿性，在酸性溶液中稳定;溶于10份水，溶于热水、乙醇、三氯甲烷,易溶于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。
储存：在阴凉，干燥，通风良好的地方，远离不相容的物质。 危害：高毒，对皮肤及粘膜刺激性小，有轻微脱脂作用。 2.1M Tris-HCl PH8.0缓冲液
作用：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液
理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。
储存：室温保存。
危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。 3.乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)
作用：螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。
商品信息：瓶/250g。
理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。
储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。
危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。 4.Tris饱和酚
作用：强蛋白质变性剂。 商品信息：瓶/250ml。
理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。
储存：4℃避光保存。
危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。 5.β-巯基乙醇(2-巯基乙醇)
作用：提供一种还原剂，这样酚类物质(植物材料特别是老的材料中含有大量的酚类物质)就不能被氧化成醌(醌易与DNA发生共价结合，使DNA发生褐变，从而影响你提DNA的实验)。巯基乙醇兼有消除CTAB震荡时产生的泡沫的作用。
商品信息：瓶/100g。
理化性质：无色透明液体，具有少许硫醇气味。易溶于水，乙醇和乙醚等有机溶剂，与苯可以任意比例混溶。水中溶解度：1mg/mL。
储存：对空气敏感，易吸潮。 使容器保持密闭，储存在阴凉、干燥通风处。打开了的容器必须仔细重新封口并保持竖放位臵以防止泄漏。建议贮存温度 2- 8℃。
危害：高毒吸入 、摄入或经皮肤吸收后会中毒。 对环境有危害，对水体可造成污染。 本品可燃。 6.氯化钠(NaCl)
作用：CTAB-核酸复合物在高盐溶液中易溶。 商品信息：瓶/500g，分析纯AR。
理化性质：白色晶体状。易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨;不溶于浓盐酸。在空气中微有潮解性。稳定性比较好。
储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。 危害： 7.无水乙醇
作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。 商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。
理化性质：无色澄清液体。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。 储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。
危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%(体积)。 8.氯仿(三氯甲烷)
作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的少量酚(酚易溶于氯仿)。 商品信息：瓶/500ml。
理化性质：无色透明液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。 储存：保存在密封的棕色瓶中。
危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。 9.异戊醇
作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
商品信息：瓶/500ml。
理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。
储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。
危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。 10.异丙醇
作用：DNA沉淀剂，DNA在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全，而后由于异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇，乙醇挥发快。用-20度预冷异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好;异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当;但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶解损失;所以多选用-20度预冷异丙醇。一般6500倍到8000倍重力10分钟就可以将异丙醇沉淀的核酸紧密的离到管底。
商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。
理化性质：无色透明具有乙醇气味的可燃性液体。有似乙醇和丙酮混合物的气味，能与醇、醚、氯仿和水混溶，不溶于盐溶液。
储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、卤素等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。
危害：微毒类，高浓度蒸气具有明显麻醉作用，对眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能损伤视网膜及视神经。常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气混合易形成爆炸混合物。 11.PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)
作用：PVP是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
商品信息：白色塑料瓶/100g。
理化性质：白色或乳白色粉末或颗粒，有微臭。溶于水、碱、酸及极性有机溶剂。 储存：室温干燥保存。 危害： 12.液氮(LN2)
作用：低温导致植物组织冻裂，方便研磨使细胞破碎，使DNA释放完全;低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNAase的作用，保护DNA。 商品信息：分析纯
理化性质：-196℃。液态的氮气。是惰性的，无色，无臭，无腐蚀性，不可燃，温度极低。 储存：储存于阴凉、通风的库房。库温不宜超过30℃。 危害：汽化时大量吸热接触造成冻伤。
六、实验试剂
1.氯仿-异戊醇(24:1)100ml-20ml=80ml {氯仿 96ml + 异戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存 2.酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)40ml {氯仿-异戊醇(24:1)20ml + Tris饱和酚20ml} = 40ml，4℃保存 3.TE缓冲液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl(PH8.0)缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA(PH8.0)0.1ml} → → 定容到50ml → 高压灭菌后冷却4℃保存 【0.5M EDTA(PH8.0)】的配制：100ml {蒸馏水 80ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g} → 用NaOH(约2g)调至PH8.0 → 定容至100ml → → 分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。 【10mM Tris-HCl(PH8.0)缓冲液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml} → 定容至10ml → 10mM Tris-HCl(PH8.0)缓冲液 4. 2%CTAB抽提液 250ml
{CTAB 4g + 无水乙醇 5ml + 水100ml} → 加入200ml烧杯中 → 加热溶解 → 再依次加入 → → {5M NaCl 56ml + 1M Tris-HCl(PH8.0)20ml + 0.5M EDTA 8ml} → 定容至250ml → 高压灭菌冷却后加入 → {1%β-巯基乙醇(400ul)2ml + PVP-40 5g} → 4℃保存 【5M NaCl溶液】配制：100ml {NaCl 29.22g + 水90ml} → 加热到80℃溶解冷却后 → 定容至100ml → 高压灭菌备用 【1%(v/v)β-巯基乙醇】配制：10ml {β-巯基乙醇 100μl +水9.9ml} → 1%β-巯基乙醇10ml 5.蒸馏水
所有药剂用水都要纯净水经高压灭菌冷却
七、实验步骤
(一)实验前准备
1.研钵、异丙醇-20℃预冷;【研钵10个、异丙醇75ml】
2.将2%CTAB抽提液从4℃冰箱内取出在65℃水浴预热;【CTAB抽提液30ml】 3.称取30份新鲜菠菜叶片，每份1g，称重时去叶脉;【菠菜叶片30g】 4.用蒸馏水冲洗叶片，滤纸吸干水分，将叶片用剪刀剪小。【洗瓶、滤纸、剪刀】
5.实验器材：冰箱、65℃水浴锅、液氮、10ml离心管90个、药匙、移液枪(1ml、100μl、400μl)、离心机(10000r/min)
6.实验药剂：酚-氯仿-异戊醇30ml(每管1ml)、氯仿-异戊醇60ml(每管2ml)、无水乙醇12ml(每管400 μl)、TE缓冲液3ml(每管100μl)
(二)破碎细胞，释放溶解核酸
1.将叶片臵于预冷的研钵(实验前-20℃预冷)中，倒入液氮，尽快研磨成粉末;
目的：低温导致植物组织冻裂，方便研磨使细胞破碎，使DNA释放完全;低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNase的作用，保护DNA。
2.将粉末加入10ml离心管中，加入 1ml预热的CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀; 目的：CTAB可以溶解细胞膜并与DNA结合，便于分离DNA。加入β-巯基乙醇和PVP-40的目的是减少植物中酚类物质的影响。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。Tris-HCl提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。高盐溶液可以更好的溶解核酸-CTAB复合物。
3.将离心管臵于 65℃的水浴中保温40分钟，期间每隔10分钟轻轻摇晃几次。 目的：水浴使CTAB抽提液和叶片充分反应。
(三)抽提去掉蛋白质
1.将水浴的离心管取出，冷却 2分钟后，加入1ml酚-氯仿-异戊醇，振荡 2分钟，使两者混合均匀，12000 r/min离心10分钟; 目的：第一次离心溶液分3层，上-中-下层：CTAB-核酸-变性蛋白-有机溶剂
2.取上清液(含CTAB-核酸)至新的10 ml离心管中，加入2ml氯仿-异戊醇，轻轻颠倒离心管，混匀，12 000r/min离心10分钟。 目的：第二次离心进一步去掉变性蛋白，去掉多余的酚
(四)沉淀核酸
1.小心取上清液(含CTAB-核酸)臵于一个新的10ml离心管中(尽量避免吸取中间层),加入2.5ml的异丙醇(-20℃预冷)，将离心管慢慢上下摇动30秒，使异丙醇与水层充分混合，室温放臵15分钟至能见到DNA絮状物; 目的：异丙醇为DNA沉淀剂，异丙醇与CTAB互溶，但不与核酸相溶。用-20℃预冷的异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好，异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分核酸溶解损失;所以多选用-20度预冷异丙醇。核酸在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全。异丙醇易溶于CTAB，但不与核酸相溶。 2.10000r/min离心10分钟,小心倒去上清液。 目的：第三次离心使核酸沉淀到管底。
(五)核酸的洗涤
用400ul无水乙醇洗涤核酸沉淀直至无色，10000r/min离心10分钟，倾去上清液晾干。 目的：异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇及多余的NaCl，乙醇挥发快。
(六)保存
向下层离心物中加入100μl TE缓冲液进行溶解，臵于-20℃冰箱保存，以便下次课用。 目的：一般长期保存DNA，贮存在TE缓冲液中比较好。TE为含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)缓冲液：其中比较关键的成分是EDTA，日常环境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点;二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金属离子，从而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA会影响下游酶切，连接反应以及质粒转染进细胞的效率，如果接下来要做这些实验是应该避免使用含EDTA的缓冲液的。短期储存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA连接等效果。
八、实验注意事项
1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作; 2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护;
3.磨样时最好是加液氮，磨样速度要快，使材料处于低温状态; 4.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔; 5.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂;
6.将异丙醇吸出时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。
九、思考题
1.本实验中用到的各种试剂的作用是什么? 2.本实验中进行了几次离心操作，每次的目的?
十、实验安排
全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。 每组作3个离心管，共用一个研钵。
每3组(共18人9个离心管)共同进行离心操作。
第三篇：说明方法有哪些
说明方法有哪些?各是什么作用?
最佳答案
初中阶段常见的说明方法有下定义、分类别、举例子、列数字、作比较、打比方、画图表等。
下定义：是用一种基本固定的判断格式，简明地对说明对象的本质属性加以概括的说明方法。下定义的说明方法能够起到准确简明地说明事物的本质特征的作用。
分类别：是根据形状、性质、功能、成因等方面，把事物或事理按一定的标准分成若干类别，然后逐一加以说明的方法。分类别的说明方法可以全方位、多角度地说明事物或事.理，能够使说明更有条理、更加清楚。
举例子：为了说明事物的情况或事理，有时列举一些既通俗易懂又有代表性的例子来进行说明。举例说明可以通过有代表性的例子，清楚、真实、有力地说明事物或事理。
列数字：数字有约数和确数，不管哪一类数字，都能起到更准确、更具体地说明事物或事理的作用。值得注意的是表示年、月、日的不是列数字。
作比较：选择有外在或内在联系的事物进行比较。作比较包括类比和对比，同类事物的类比是为了说明相同点;不同类事物的对比，是为了突出不同之处。运用作比较的说明方法可以化深奥为浅显，变复杂为简明，可以更清晰、更鲜明地说明事物，增强说明效果。
打比方：是借助大家熟知的事物，取其相似之处运用比喻的修辞手法进行说明。其作用是增强说明的形象性、生动性，使抽象的事物变得更具体。
画图表：是指用示意图、表格、插图等来说明事物。画图表对文字说明起到节助作用，增强了说明的直观性，使事物的特点一目了然。
第四篇：教学方法有哪些
第一节
教学方法概述
教学方法的理论是教学理论研究中不可缺少的重要组成部分。自从人类有教学活动开始，随之也就有了教学方法的创造和应用。在千百年的教学实践活动中，人们创造和总结出难以记数的各种教学方法。
一、教学方法的概念
1、
中外对教学方法的不同界定
由于时代的不同，由于社会背景、文化氛围的不同，由于研究者研究问题的角度和侧面的差异，使得中外不同时期的教学理论研究者对“教学方法”概念的界说自然不尽相同。
2、
教学方法不同界定之间的共性
(1)教学方法要服务于教学目的和教学任务的要求。 (2)教学方法是师生双方共同完成教学活动内容的手段。 (3)教学方法是教学活动中师生双方行为体系。
3、 教学方法的内涵 [重点] 教学方法，是教学过程中教师与学生为实现教学目的和教学任务要求，在教学活动中所采取的行为方式的总称。 教学方法的内在本质特点：
(1)教学方法体现了特定的教育和教学的价值观念，它指向实现特定的教学目标要求。
(2)教学方法受到特定的教学内容的制约。
(3)教学方法要受到具体的教学组织形式的影响和制约。
二、教学方法的分类
教学方法的分类就是把多种多样的各种教学方法，按照一定的规则或标准，将它们归属为一个有内在联系的体系。
(一)国外学者的教学方法分类模式
1、
巴班斯基的教学方法分类
依据是对人的活动的认识, 认为教学活动包括了这样的三种成分，即知识信息活动的组织、个人活动的调整、活动过程的随机检查。把教学划分为三大类
第一大类：“组织和自我组织学习认识活动的方法”。
第二大类：“激发学习和形成学习动机的方法”。
第三大类：“检查和自我检查教学效果的方法”。
2、
拉斯卡的教学方法分类
分类的依据是新行为主义的学习理论，即刺激——反应联结理论。
(教学方法——学习刺激——预期的学习结果)
依据在实现预期学习结果中的作用，学习刺激可分为A、B、C、D四种，据此相应地归类为四种基本的或普通的教学方法。
第一种方法：呈现方法。 第二种方法：实践方法。 第三种方法：发现方法。 第四种方法：强化方法。
3、
威斯顿和格兰顿的教学方法分类
依据教师与学生交流的媒介和手段，把教学方法分为四大类：
教师中心的方法，主要包括讲授、提问、论证等方法; 相互作用的方法，包括全班讨论、小组讨论、同伴教学、小组设计等方法;
个体化的方法，如程序教学、单元教学、独立设计、计算机教学等;
实践的方法，包括现场和临床教学、实验室学习、角色扮演、模拟和游戏、练习等方法。
(二)中国学者建构的教学方法分类模式
1、
李秉德教授主编《教学论》中的教学方法分类。 按照教学方法的外部形态，以及相对应的这种形态下学生认识活动的特点，把中国的中小学教学活动中常用的教学方法分为五类。
第一类方法：“以语言传递信息为主的方法”，包括讲授法;谈话法;讨论法;读书指导法等。
第二类方法：“以直接感知为主的方法”，包括演示法;参观法等。
第三类方法：“以实际训练为主的方法”，包括练习法;实验法;实习作业法。
第四类方法：“以欣赏活动为主的教学方法”例如陶冶法等。
第五类方法：“以引导探究为主的方法”，如发现法;探究法等。
2、
黄甫全教授提出的层次构成分类模式。
黄甫全教授认为，从具体到抽象，教学方法是由三个层次构成的，这三个层次是：
第一层次：原理性教学方法。解决教学规律、教学思想、新教学理论观念与学校教学实践直接的联系问题，是教学意识在教学实践中方法化的结果。如：启发式、发现式、设计教学法、注入式方法等。
第二层次：技术性教学方法。向上可以接受原理性教学方法的指导，向下可以与不同学科的教学内容相结合构成操作性教学方法，在教学方法体系中发挥着中介性作用。例如：讲授法、谈话法、演示法、参观法、实验法、练习法、讨论法、读书指导法、实习作业法等。
第三层次：操作性教学方法。指学校不同学科教学中具有特殊性的具体的方法。如语文课的分散识字法、外语课的听说法、美术课是写生法、音乐课的视唱法、劳动技术课的工序法等。
第二节
课堂教学常用方法
中小学课堂教学中实用的教学方法多种多样和丰富多彩，这里所阐述的是其中最常用的一些主要的方法。
一、讲授式的教学方法
[重点]
1、定义：教师主要运用语言方式，系统地向学生传授科学知识，传播思想观念，发展学生的思维能力，发展学生的智力。
2、具体实施形式： (1)讲解教学方法 (2)谈话教学方法 (3)讨论教学方法 (4)讲读教学方法 (5)讲演教学方法
3、运用讲授式教学方法的基本要求主要体现在下述几个方面：
(1)科学地组织教学内容。
(2)教师的教学语言应具有清晰、精练、准确、生动等特点。
(3)善于设问解疑，激发学生的求知欲望和积极的思维活动。
二、问题探究式教学方法
[重点]
1、定义：教师或教师引导学生提出问题，在教师组织和指导下，通过学生比较独立的探究和研究活动，探求问题的答案而获得知识的方法。 (1)问题教学法 (2)探究教学法 (3)发现教学法
3、运用发现教学法与探究教学法时，应注意以下几方面的要求：
(1)努力创设一个有利于学生进行探究发现的良好的教学情境。
(2)选择和确定探究发现的问题(课题)与过程。 (3)有序组织教学，积极引导学生的探究发现活动。
4、问题探究式教学方法的实施的基本步骤： (1)创设问题的情境 (2)选择与确定问题 (3)讨论与提出假设 (4)实践与寻求结果 (5)验证与得出结论
三、训练与实践式教学方法
1、定义：通过课内外的练习、实验、实习、社会实践、研究性学习等以学生为主体的实践性活动，使学生巩固、丰富和完善所学知识，培养学生解决实际问题的能力和多方面的实践能力。
2、训练与实践式教学方法中的各种具体教学方法的内涵和基本要求 (1)练习法 (2)实验法 (3)社会实践法 (4)研究性学习法
四、基于现代信息技术的教学方法
1、现代教学媒体的分类
现代教学媒体根据人接受信息的感官不同，可以分为视觉媒体、听觉媒体、视听媒体和交互媒体等。
2、现代信息技术可以实现多方面的教学功能，其中主要的方面体现在： (1)再现功能。 (2)集成功能。 (3)交互功能。 (4)虚拟功能。
第三节
教学方法的选择与运用
科学、合理地选择和有效地运用教学方法，要求教师能够在现代教学理论的指导下，熟练地把握各类教学方法的特性，能够综合地考虑各种教学方法的各种要素，合理地选择适宜的教学方法并能进行优化组合。
一、选择教学方法的基本依据
[重点]
(一)依据教学目标选择教学方法。
不同领域或不同层次的教学目标的有效达成，要借助于相应的教学方法和技术。教师可依据具体的可操作性目标来选择和确定具体的教学方法。
(二)依据教学内容特点选择教学方法。
不同学科的知识内容与学习要求不同;不同阶段、不同单元、不同课时的内容与要求也不一致，这些都要求教学方法的选择具有多样性和灵活性的特点。
(三)根据学生实际特点选择教学方法。
学生的实际特点直接制约着教师对教学方法的选择，这就要求教师能够科学而准确地研究分析学生的上述特点，有针对性地选择和运用相应的教学方法。
(四)依据教师的自身素质选择教学方法。
任何一种教学方法，只有适应了教师的素养条件，并能为教师充分理解和把握，才有可能在实际教学活动中有效地发挥其功能和作用。因此，教师在选择教学方法时，还应当根据自己的实际优势，扬长避短，选择与自己最相适应的教学方法。
(五)依据教学环境条件选择教学方法。 教师在选择教学方法时，要在时间条件允许的情况下，应能最大限度地运用和发挥教学环境条件的功能与作用。
二、教学方法的运用
教师选择教学方法的目的，是要在实际教学活动中有效地运用。
首先，教师应当根据具体教学的实际，对所选择的教学方法进行优化组合和综合运用。
其次，无论选择或采用哪种教学方法，要以启发式教学思想作为运用各种教学方法的指导思想。
另外，教师在运用各种教学方法的过程中，还必须充分关注学生的参与性。
第五篇：装订的方法有哪些
装订的方法有哪些(转载)
1.装订种类：骑马订
装订页数：8-32P
装订特点：最普通的装订方式之一
适用范围：培训资料、会议资料、文件资料、产品说明、样本画册、菜谱酒单等内容较少的资料装订上
装订方法：将文件资料自中间压痕后，用书钉装订成册。
注意事项：装订采用跨页对折方式，总页数须为4的倍数。
2.装订种类：塑圈装订
装订页数：10-500P
装订特点：方便快捷、可以重复拆卸、加页，但其牢固度不足
适用范围：招投标书、培训资料、会议资料、文件资料、产品说明、毕业论文等
装订方法：通过塑料杆上所连接的塑料环片穿过文件左页边缘的装订孔，然后折压成册，封面上面可以较加装透明/雾面胶片。
注意事项：文本装订侧需留出7-12mm的打孔距离。
3.装订种类：铁圈装订
装订页数：10-500P
装订特点：精致耐久、清晰流畅、易于翻转、可以看到整个页面内容
适用范围：招投标书、VI手册、样本画册、作品集、纪念册、文件资料等
装订方法：环状金属线穿过文件左页边缘的装订孔，然后折压成册，封面上面可以较加装透明/雾面胶片。
注意事项：文本装订侧需留出7-12mm的打孔距离。
4.装订种类：无线胶装
装订页数：10-400P
装订特点：普遍而精美，和我们日常所见到的图书一样，无论是做什么，都不会让人感到不妥。
适用范围：招投标书、培训资料、会议资料、文件资料、产品说明、毕业论文、VI手册、样本画册、作品集等。
装订方法：通过特种粘合剂，经过装订机的冲压，将设计精美的封面同内文粘合在一起，装订成册。
注意事项：文本装订后需要修边，故切口处不宜放置重要图文。
5.装订种类：豪华精装
装订页数：50-450P
装订特点：豪华而高贵，可自由设计文本尺寸，是所有装订方式中最具震撼力的一种
适用范围：招投标书、VI手册、样本画册、菜谱酒单、精美手册等
装订方法：将经过精心设计的封面印出来，然后将其裱到硬的纸板上，组成非常坚挺的书皮;内文则采用线胶装装订起来，然后通过精美的环衬同书皮装订在一起。
注意事项：封面折页处不宜使用深色块图文，以避免折页处覆膜起泡。
6.装订种类：客户的定制文件夹
装订页数：2-550P
装订特点：方便、快捷，是所有装订方式中装订页数最多，时常自行装订最方便的一种。
适用范围：招投标书、培训资料、会议资料、文件资料、菜谱酒单等
装订方法：将设计的精美封面打印出来后，插到文件夹的透明封面套内，内文打孔后装到文件夹内即可。
7.装订种类：夹(边)条装订
装订页数：10-200P
装订特点：方便快捷、非常易于加减内容
适用范围：文件资料、会议资料、产品说明等
装订方法：用装订机将资料打上孔后，将其串到一条特制的细长塑料杆所连接的塑料片上，手压即可。
注意事项：文本装订侧需留出7-12mm的打孔距离